CN110079568B - 改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵，特别是指一种改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法。它包括将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)CGMCC No.9531接种到灭菌后且含有碳源、氮源的培养液中，调节培养液的pH值进行通气搅拌发酵，将发酵结束后的发酵液经过预处理、萃取后得到定优胶；发酵过程中采用控制接种量及pH值、调整碳氮比等技术手段，提取过程采用发酵液调整pH值及升温等技术手段。本发明解决了现有技术中产品耐盐性及流变性差等技术问题，具有定优胶的耐盐性及流变性能好、产品白度高、生产成本低且生产安全性高等优点。

Description

改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵，特别是指一种改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法。
背景技术
定优胶是继黄原胶、温轮胶之后又一代性能优良的工业级微生物多糖，是由微生物发酵生成的水溶性生物聚合物。它具有优良的增稠性、假塑性、耐高温、高盐及较广范围的pH值适应性，可广泛用于石油、水泥等行业，具有广阔的应用前景。
定优胶是由鞘氨醇单胞菌接种于含有碳源、氮源、无机盐等组成的培养基在一定温度和一定pH值范围内通过有氧发酵制取。现有生产工艺制备的定优胶产品耐盐性差，流变性能差。
专利号为201410541800.4的发明专利中公开了一种鞘氨醇单胞菌以及利用其制取定优胶发酵液的方法，该方法用废糖蜜、玉米水解液及豆粕水解液为碳源和氮源，其主要技术思路是通过采用培养温度30-35℃、发酵过程补入稀双氧水提高溶解氧、补入浓氨水调pH值等技术措施制备定优胶发酵液，采用该方法制备的定优胶有良好耐温性能，但该方法制备的定优胶耐盐性差，在人工海水中1ppb3rpm读值低于25；流变性差，流行指数n值较高，剪切性能值低，k值低于8.0，动切力和静切力低；同时存在发酵液不易萃取，成品外观暗等问题。
目前的油田开发趋势由浅井向深井、由陆地向海洋方向发展，需要钻井液和采油助剂、固井水泥助剂等均必须具备良好的耐盐性能，尤其在高盐条件下低浓度胶体粘度值；流变性良好是钻井液必备性能，上述性能反应钻井液在泵送、搅拌等外力作用下液体流动和变形能力，关系到钻井液携带、悬浮岩屑、机械钻速、井眼规则和井下安全问题。
发明内容
本发明的目的提供一种改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，通过采用调整培养基碳氮比、发酵中控制pH值，对发酵液进行预处理等技术措施，使制备的定优胶具有良好的耐盐性和流变性。
本发明的整体技术构思是：
改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，是将鞘氨醇单胞菌(SpH值ingomonas sp.)CGMCC No.9531接种到灭菌后且含有碳源、氮源的培养液中，调节培养液的pH值进行通气搅拌发酵，将发酵结束后的发酵液经过预处理、萃取后得到定优胶；还包括如下工艺条件：
A、培养液中以淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米糖中的一种或其结合为碳源，以酵母膏、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、玉米蛋白粉、花生饼粉、棉籽粉、铵盐、硝酸盐中的一种或其结合为氮源，培养液中的碳氮比为5-20：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为5％-10％；温度28℃-32℃，pH值＝6.5-7.5；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝3.5-5.5反应0.5-2小时，然后在温度为50℃-70℃的条件下维持0.5-2小时。
本发明的具体技术构思还有：
为利于菌种的生长并有效合成定优胶，优选的技术方案是，所述的培养液中还包括无机盐，无机盐选用硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜、硼酸及醋酸锰。
包括pH值调整及升温处理措施的发酵液预处理主要目的是为了进一步去除杂质以提高定优胶纯度，从而提高定优胶的耐盐性及流变性能，优选的技术方案是，所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为3％-10％的盐酸或5％-15％的氯乙酸调pH值＝3.5-5.5。
碳氮比的调整的主要作用是为了提高所制备的定优胶的耐盐性及流变性能，优选的技术方案是，所述的碳源添加量为培养液质量的3％-6％；氮源添加量为培养液质量的0.3％-0.6％，无机盐添加量为培养液质量的0.02％-0.2％。
萃取的主要作用是将从发酵液中分离提取定优胶，为降低有机溶剂的消耗，降低生产成本并提高生产的安全性，优选的技术方案是，萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇或异丙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.5-2.0；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度70％-80％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1-1.2：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.0-8.0，得到湿纤维状定优胶。
为实现管式萃取中定优胶的有效析出，进一步保证定优胶的品质及性能，优选的技术方案是，步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为4m3/h-5m3/h，溶剂流速为6m3/h-10m3/h；步骤(2)的物料流速为8m3/h-9m3/h，溶剂流速为7m3/h-8m3/h，碱液流速为0.2m3/h-0.3m3/h。
更为优选的技术方案是，步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为5％-15％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
申请人根据《钻井液材料规范》(GB/T5005-2010)和API美国石油学会标准的要求对定优胶制定了如下技术指标要求及检测方法：
一、相应指标要求
1、发酵及提取指标
周期 发酵液粘度 出胶率 提取率 有机溶剂消耗
≤70h ≥5000cp ≥2.0％ ≥90％ ≤250kg/T
2、成品流变性
(1)流变性指标
600rpm 300rpm 200rpm 100rpm 6rpm 3rpm
≥100 ≥85 ≥75 ≥65 ≥45 ≥40
(2)流型指数n值指标
n值 600rpm 300rpm 200rpm 100rpm 6rpm 3rpm
≤0.3 ≥30 ≥24 ≥23 ≥22 ≥20 ≥18
(3)剪切性能值K值指标
Figure BDA0002044783420000031
Figure BDA0002044783420000041
3、成品耐盐性检测指标
20％CaSO<sub>4</sub>溶液 2％KCL溶液 0.25％标准自来水 1ppb3rpm
≥2500cp ≥2000cp ≥5000cp ≥40
二、检测方法
(一)发酵及提取指标
1、发酵液粘度检测：
检测仪器：粘度计、4号转子，60rpm；
2、出胶率检测：
(1)检测仪器：电子天平(精确到0.001g)；鼓风恒温干燥箱；
(2)检测条件：浓度88％-95％乙醇500ml，发酵液100g。
(二)成品流变性
1、流变性检测
(1)检测仪器：ZNN-D6型六速旋转粘度计，0.2号弹簧；
(2)检测条件：溶液浓度为1ppb；溶剂为人工海水；
(3)人工海水配制：准确称取42g海盐，溶解于去离子水中，准确定容至1000ml；
2、流型指数n值计算
(1)检测仪器：ZNN-D6型六速旋转粘度计；
(2)检测条件：溶液浓度为0.5％水溶液，溶剂为去离子水；
(3)n值计算：n＝3.032×1g(600rpm/300rpm)；
3、剪切性能值K值计算
(1)检测仪器：BROOKFIELD粘度计，4号转子；
(2)检测条件：溶液浓度为1％；溶剂为1％KCl盐水；
(3)计算公式：K值＝6rpm粘度值/60rpm粘度值。
(三)耐盐性
1、耐钙性检测：
(1)检测仪器：BROOKFIELD粘度计粘度计，2号转子，3rpm；
(2)检测条件：样品浓度为1％；溶剂为20％CaSO4水溶液；
2、2％KCL溶液粘度检测：
(1)检测仪器：BROOKFIELD粘度计，4号转子，60rpm；
(2)检测条件：样品浓度为1％；溶剂为2％KCL水溶液；
3.0.25％标准自来水粘度检测：
(1)检测仪器：BROOKFIELD粘度计，2号转子，3rpm；
(2)标准自来水配制：准确称取0.1gNaCL、0.011gCaCL2溶解去离子水中，定容至1000ml；
(3)检测条件：样品浓度为0.25％；溶剂为标准自来水溶液；
4、1ppb3rpm检测：
(1)检测仪器：ZNN-D6型六速旋转粘度计；
(2)检测条件：样品浓度为1ppb；溶剂为4.2％人工海水；
(3)4.2％人工海水配制：准确称取42g海盐溶解于去离子水，定容至1000ml。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明通过优化培养基中的碳氮比以及对发酵过程中pH值控制，发酵过程pH值控制平稳，发酵品质好，定优胶的耐盐性及流变性能得以提高。
2、采用包括pH值调整、升温等技术措施的发酵液预处理，进一步去除发酵液中杂质并提高了定优胶成品纯度，从而进一步提高定优胶的耐盐性及流变性能，具有更好的剪切稀释性。经检测，所制备的定优胶在人工海水中1ppb3rpm读值可达40，流型指数n值小于0.3，0.25％粘度可达5000cp，剪切性能值K值可达8.0。
3、采用管式萃取提取定优胶，降低有机溶剂的消耗及生产成本，提高生产的安全性及产品白度。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围
实施例1
改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，是将鞘氨醇单胞菌(SpH值ingomonas sp.)CGMCC No.9531接种到灭菌后且含有碳源、氮源的培养液中，调节培养液的pH值进行通气搅拌发酵，将发酵结束后的发酵液经过预处理、萃取后得到定优胶；还包括如下工艺条件：
A、培养液中以淀粉为碳源，以玉米浆、铵盐为氮源，培养液中的碳氮比为20：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为10％；温度32℃，pH值＝7.5；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝5.5反应2小时，然后在温度为70℃的条件下维持2小时。
所述的培养液中还包括无机盐，无机盐选用硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜、硼酸及醋酸锰。
所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为10％的盐酸或15％的氯乙酸调pH值＝5.5。
所述的碳源添加量为培养液质量的6％；氮源添加量为培养液质量的0.3％，无机盐添加量为培养液质量的0.2％。
萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：2.0；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度80％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1.2：1，萃取中采用碱液调pH值＝8.0，得到湿纤维状定优胶。
步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为5m3/h，溶剂流速为10m3/h；步骤(2)的物料流速为9m3/h，溶剂流速为8m3/h，碱液流速为0.3m3/h。
步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为15％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵及后提取还包括如下工艺条件：
A、培养液中以玉米糖为碳源，以玉米蛋白粉、硝酸盐为氮源，培养液中的碳氮比为10：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为8％；温度30℃，pH值＝7.0；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝4.5反应1小时，然后在温度为60℃的条件下维持1小时。
所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为7％的盐酸或10％的氯乙酸调pH值＝4.5。
所述的碳源添加量为培养液质量的5％；氮源添加量为培养液质量的0.5％，无机盐添加量为培养液质量的0.1％。
萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇或异丙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.8；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度75％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1.1：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.5，得到湿纤维状定优胶。
步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为4.5m3/h，溶剂流速为8m3/h；步骤(2)的物料流速为8.5m3/h，溶剂流速为7.5m3/h，碱液流速为0.25m3/h。
步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为10％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵及后提取还包括如下工艺条件：
A、培养液中以蔗糖为碳源，以花生饼粉、棉籽粉、铵盐为氮源，培养液中的碳氮比为5：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为5％；温度28℃，pH值＝6.5；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝3.5反应0.5小时，然后在温度为50℃的条件下维持0.5小时。
所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为3％的盐酸或8％的氯乙酸调pH值＝3.5。
所述的碳源添加量为培养液质量的3％；氮源添加量为培养液质量的0.6％，无机盐添加量为培养液质量的0.02％。
萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.5；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度70％的乙醇，物料与溶剂的质量比＝1：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.0，得到湿纤维状定优胶。
步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为4m3/h，溶剂流速为6m3/h；步骤(2)的物料流速为8m3/h，溶剂流速为7m3/h，碱液流速为0.2m3/h。
步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为5％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵及后提取还包括如下工艺条件：
A、培养液中以淀粉、葡萄糖为碳源，以花生饼粉为氮源，培养液中的碳氮比为15：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为9％；温度31℃，pH值＝7.2；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝5反应1.5小时，然后在温度为65℃的条件下维持1.5小时。
所述的培养液中还包括无机盐，无机盐选用硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜、硼酸、醋酸锰中的一种或其结合。
所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为9％的盐酸或12％的氯乙酸调pH值＝5。
所述的碳源添加量为培养液质量的6％；氮源添加量为培养液质量的0.4％，无机盐添加量为培养液质量的0.15％。
萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇或异丙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.9；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度78％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1.2：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.7，得到湿纤维状定优胶。
步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为5m3/h，溶剂流速为9m3/h；步骤(2)的物料流速为9m3/h，溶剂流速为8m3/h，碱液流速为0.3m3/h。
步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为12％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于：
发酵及后提取还包括如下工艺条件：
A、培养液中以蔗糖、玉米糖为碳源，以玉米浆、铵盐为氮源，培养液中的碳氮比为8：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为6％；温度29℃，pH值＝6.8；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝3.8反应0.8小时，然后在温度为55℃的条件下维持0.8小时。
所述的培养液中还包括无机盐，无机盐选用硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜、硼酸、醋酸锰中的一种或其结合。
所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为4％的盐酸或7％的氯乙酸调pH值＝3.8。
所述的碳源添加量为培养液质量的4％；氮源添加量为培养液质量的0.5％，无机盐添加量为培养液质量的0.08％。
萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇或异丙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.6；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度72％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.2，得到湿纤维状定优胶。
步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为4.2m3/h，溶剂流速为7m3/h；步骤(2)的物料流速为8.2m3/h，溶剂流速为7.2m3/h，碱液流速为0.2m3/h。
步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为6％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
申请人对实施例1-5中的发酵、提取及产品性能指标进行了相应测试，结果如下：
1、发酵及提取指标
周期 发酵液粘度 出胶率 提取率 有机溶剂消耗
实施例1 70h 5300cp 2.04％ 90.2％ 240kg/T
实施例2 69h 5200cp 2.08％ 90.7％ 230kg/T
实施例3 70h 5600cp 2.14％ 91.1％ 210kg/T
实施例4 68h 5050cp 2.08％ 91.0％ 240kg/T
实施例5 69h 5300cp 2.12％ 90.9％ 220kg/T
2、成品流变性
(1)流变性指标
Figure BDA0002044783420000101
Figure BDA0002044783420000111
(2)流型指数n值指标
n值 600rpm 300rpm 200rpm 100rpm 6rpm 3rpm
实施例1 0.27 32 26 25 23 21 19
实施例2 0.28 31 25 23 22 20 18
实施例3 0.26 33 27 26 24 22 20
实施例4 0.29 30 24 23 22 20 18
实施例5 0.27 32 26 25 23 21 19
(3)剪切性能值K值指标
K值 6rpm 60rpm
实施例1 8.00 16800cp 2100cp
实施例2 8.05 16500cp 2050cp
实施例3 8.18 18000cp 2200cp
实施例4 8.00 16000cp 2000cp
实施例5 8.10 17000cp 2100cp
由以上流变性的检测结果可知，实施例1-5中所制备的定优胶从高、中、低剪切条件下的粘度值判断，特别是3rpm读值和n值反应了定优胶具有良好的流变学特性；K值证明所制备的定优胶更耐剪切，具有更好的剪切稀释性。
3、成品耐盐性检测指标
Figure BDA0002044783420000112
Figure BDA0002044783420000121
由以上检测结果可知，实施例1-5中所制备的定优胶在上述四种条件下的粘度值均很高，说明其具有更好的耐盐性。

Claims (7)

1.改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，是将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)CGMCC No.9531接种到灭菌后且含有碳源、氮源的培养液中，调节培养液的pH值进行通气搅拌发酵，将发酵结束后的发酵液经过预处理、萃取后得到定优胶；其特征在于还包括如下工艺条件：
A、培养液中以淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米糖中的一种或其结合为碳源，以酵母膏、酵母粉、蛋白胨、玉米浆、玉米蛋白粉、花生饼粉、棉籽粉、铵盐、硝酸盐中的一种或其结合为氮源，培养液中的碳氮比为5-20：1；
B、通气搅拌发酵中接种量为5％-10％；温度28℃-32℃，pH值＝6.5-7.5；
C、发酵结束后对发酵液进行预处理的条件为：调整发酵液的pH值＝3.5-5.5反应0.5-2小时，然后在温度为50℃-70℃的条件下维持0.5-2小时。
2.根据权利要求1所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于所述的培养液中还包括无机盐，无机盐选用硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铜、硼酸及醋酸锰。
3.根据权利要求1所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于所述的步骤C中发酵结束后的发酵液用质量百分比浓度为3％-10％的盐酸或5％-15％的氯乙酸调pH值＝3.5-5.5。
4.根据权利要求1或2所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于所述的碳源添加量为培养液质量的3％-6％；氮源添加量为培养液质量的0.3％-0.6％，无机盐添加量为培养液质量的0.02％-0.2％。
5.根据权利要求1所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于萃取包括如下工艺步骤：
(1)第一次萃取：将预处理后的发酵液用管式萃取法进行第一次萃取，溶剂为质量百分比浓度不低于88％的乙醇或异丙醇，预处理后的发酵液与溶剂的质量比＝1：1.5-2.0；
(2)第二次萃取：将第一次萃取后的物料用管式萃取法进行第二次萃取，溶剂为质量百分比浓度70％-80％的乙醇或异丙醇，物料与溶剂的质量比＝1-1.2：1，萃取中采用碱液调pH值＝7.0-8.0，得到湿纤维状定优胶。
6.根据权利要求5所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于步骤(1)的管式萃取中发酵液流速为4m3/h-5m3/h，溶剂流速为6m3/h-10m3/h；步骤(2)的物料流速为8m3/h-9m3/h，溶剂流速为7m3/h-8m3/h，碱液流速为0.2m3/h-0.3m3/h。
7.根据权利要求5或6所述的改进的利用鞘氨醇单胞菌制取定优胶的方法，其特征在于步骤(2)中的碱液选用质量百分比浓度为5％-15％氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
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