CN100404558C - 温轮胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵和提取，具体的说是一种温轮胶的制备方法。是将温轮胶的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，发酵过程是在温度为25-36℃、pH为6.2-6.7的条件下进行需氧发酵，生产菌种选用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp)CGMCC1561，对发酵终产物进行提取得到温轮胶。本发明解决了现有技术存在的胶粘度很低(低于100cp)，且发酵过程中需要改变发酵条件(pH)，其工艺步骤复杂，培养基成本高，不能耐受高浓度钙离子等问题，具有所制备的温轮胶在具有良好耐温性能的前提下，同时具备较好的粘度和流变性，能耐受高浓度的钙离子，工艺方法易于实现，生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵和提取，具体的说是一种温轮胶的制备方法。
背景技术
温轮胶(WELAN GUM)是一种工业级微生物多糖，它含有中性糖、D-葡萄糖、D＝葡萄醛酸、L-鼠李糖和L＝甘露糖、以及配糖键合的乙酰酯基。JanssonPE，Lindberg B和Widmalm G(1985)在“碳水化合物研究”(139，217-223)中描述了该多糖的结构，目前只有美国实现了工业化生产。
美国专利US4963668中公开了一种低粘度的威兰胶，其5％的水溶液的粘度仅为100cp，可用于水泥产品中。
专利号为92102564.5的发明专利中涉及了制备快速水化威兰胶(WELANGUM)的方法，该方法是用S-130菌株进行发酵，在pH值约6.5-7.5使S-130菌株需氧发酵，发酵过程中需调整pH值至10.5-12.5，随后采用常规方式进行沉淀、干燥、磨制。采用该方法制备的威兰胶具有良好的水化特性和耐温特性(华氏300度以内不变性)，但有关其粘度的数据说明采用该方法制备的威兰胶粘度很低(低于100cp)，且发酵过程中需要改变发酵条件(pH)，其工艺步骤复杂，培养基成本高，未有能耐受高浓度钙离子的数据记载和文字说明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过在以碳水化合物作为碳源、以酵母膏、豆粕粉等作为氮源的培养基中培养鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp)CGMCC1561制成，并采用凝胶、萃取技术从发酵终产物中提取温轮胶的方法，使所制备的温轮胶在具有良好耐温性能的前提下，同时具备较好的粘度和流变性，能耐爱高浓度的钙离子。
本发明的整体技术方案是：
温轮胶的制备方法，包括发酵步骤，是将温轮胶的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为25-36℃、pH为6.2-6.7的条件下进行需氧发酵，生产菌种选用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp)CGMCC1561，对发酵终产物进行提取得到温轮胶。
本发明中各工艺步骤的具体条件为：
碳源选自碳水化合物中的蔗糖、淀粉或水解糖。
氮源选自酵母膏、蛋白胨、豆粉、豆粕粉、无机铵盐中的一种或几种。
发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将A步骤中制备的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将B步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基为8％-10％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列组分(g/L)：
淀粉(水解糖)3.5-4 豆粕粉0.25-0.3 硝酸铵0.15-0.2
硫酸镁0.01-0.15 磷酸氢二钾0.1-0.15 碳酸钙0.1-0.15
微量元素0.001-0.0015
发酵中培养温度为25-36℃、pH6.2-6.7、通风量为0.15-1vvm、发酵周期为48-96小时。
所述的A步骤中斜面菌种的制备过程中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1-1.2 酵母膏0.25-0.3 牛肉膏0.25-0.3
蛋白胨0.1-0.15 琼脂2-2.2 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7。
所述的B步骤中的扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养，将斜面菌种接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，其中一级扩大培养中培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1-1.2 酵母膏0.25-0.3 牛肉膏0.25-0.3
蛋白胨0.1-0.15 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为1-2％、培养温度为25-36℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为24-27小时。
所述的二级扩大培养是将一级种子接入二级扩大培养的培养基经发酵制成二级种子，二级扩大培养中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖0.85-1 淀粉0.2-0.25 硫酸铵0.15-0.2 豆粉0.15-0.2
磷酸氢二钾0.1-0.15 磷酸二氢钾0.04-0.05 硫酸镁0.01-0.15
消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为8-10％、培养温度为25-36℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为20-24小时。
所述的步骤C中所述的微量元素的组成是(g/L)：
柠檬酸0.1 Ca(OH)2 0.005 CuSO4·5H2O 2.5×10-5
CoSO4 2.8×10-5 MgSO4 0.0086 FeSO4 1.8×10-3
ZnSO4 2.8×10-5 H3BO4 6×10-6 MnSO4 8.3×10-5
对发酵终产物进行提取得到温轮胶包括如下工艺步骤：
(1)第一次预处理：将发酵液搅拌升温至60-80℃保温，降低至室温；
(2)第二次预处理：将经过第一次预处理后的发酵液中加入凝胶处理剂，反应30-45分钟后，调整pH至3.5-4.5反应30-45分钟至发酵液呈微凝胶状；
(3)萃取：加入萃取剂，使温轮胶呈纤维状析出；
(4)过滤、洗脱色素和杂质、干燥、粉碎、筛分。
步骤(1)中所述的保温时间为1小时；步骤(2)中所述的凝胶处理剂选用氯化钙，调整pH值选用盐酸；步骤(3)中的萃取剂选用乙醇；步骤(4)中的洗脱色素和杂质选用85％-90％的乙醇，过滤选用离心机或挤压机，干燥选用真空干燥。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、利用本发明所述的方法制备的温轮胶具有良好的耐温性能，在300华氏度(248.9摄氏度)粘度不衰减，其水溶液具有很好的粘度和极佳的流变性能(其1％的水溶液粘度为1800cp)，能耐受高浓度的钙离子，用于水泥行业有作为水泥外加剂，增加矿砂的稠度和流变特性，提高混凝土自密实的稳定性，增大泥浆混凝土的抗压泌水。可用于石油钻采行业，为石油泥浆提供增稠、悬浮和流变特性，可用于精细化工、日化等行业。
2、本发明的整体工艺路线设置合理，经过斜面菌种、一、二级扩大培养、发酵罐发酵、凝胶萃取步骤制备温轮胶，较现有技术而言，更易实现工业化批量生产。发酵过程中工艺条件不需进行中间调整，易于实现自动化控制。
3、本发明中培养基的组份来源广泛，成本低廉，使工业化生产成本得以大幅度降低。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1：
温轮胶的制备方法，包括发酵步骤，是将温轮胶的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，发酵过程是在温度为29℃、pH为6.2-6.7的条件下进行需氧发酵，该方法的生产菌种选用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp)CGMCC1561，对发酵终产物进行提取得到温轮胶。
发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将A步骤中制备的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将B步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基为8％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列组分(g/L)：
淀粉(水解糖)3.6 豆粕粉0.26 硝酸铵0.18
硫酸镁0.09 磷酸氢二钾0.11 碳酸钙0.11
微量元素0.001-0.0015
发酵中培养温度为29℃、pH6.2-6.7、通风量为0.15-1vvm、发酵周期为72小时。
所述的A步骤中斜面菌种的制备过程中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1-1.2 酵母膏0.25-0.3 牛肉膏0.25-0.3
蛋白胨0.1-0.15 琼脂2-2.2 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7。
扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养，将斜面菌种接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，其中一级扩大培养中培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1.1 酵母膏0.28 牛肉膏0.27
蛋白胨0.13 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为1-2％、培养温度为29℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为26小时。
二级扩大培养是将一级种子接入二级扩大培养的培养基经发酵制成二级种子，二级扩大培养中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖0.85-1 淀粉0.2-0.25 硫酸铵0.15-0.2 豆粉0.15-0.2
磷酸氢二钾0.1-0.15 磷酸二氢钾0.04-0.05 硫酸镁0.01-0.15
消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为8-10％、培养温度为25-36℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为20-24小时。
步骤C中所述的微量元素的组成是(g/L)：
柠檬酸0.1 Ca(OH)2 0.005 CuSO4·5H2O 2.5×10-5
CoSO4 2.8×10-5 MgSO4 0.0086 FeSO4 1.8×10-3
ZnSO4 2.8×10-5 H3BO4 6×10-6 MnSO4 8.3×10-5
对发酵终产物进行提取得到温轮胶包括如下工艺步骤：
(1)第一次预处理：将发酵液搅拌升温至65℃保温，降低至室温；
(2)第二次预处理：将经过第一次预处理后的发酵液中加入凝胶处理剂，反应40分钟后，调整pH至3.8反应40分钟至发酵液呈微凝胶状；
(3)萃取：加入萃取剂，使温轮胶呈纤维状析出；
(4)过滤、洗脱色素和杂质、干燥、粉碎、筛分。
步骤(1)中所述的保温时间为1小时；步骤(2)中所述的凝胶处理剂选用氯化钙，调整pH值选用盐酸；步骤(3)中的萃取剂选用乙醇；步骤(4)中的洗脱色素和杂质选用85％-90％的乙醇，过滤选用离心机，干燥选用真空干燥。
实施例2
温轮胶的制备方法，包括发酵步骤，是将温轮胶的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，发酵过程是在温度33℃、pH6.5的条件下进行需氧发酵，生产菌种选用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp)CGMCC1561，对发酵终产物进行提取得到温轮胶。
发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将A步骤中制备的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将B步骤中制备的种子液按种子液：发酵培养基为9％的接种量接入发酵培养基接入发酵培养基进行发酵，其中发酵培养基包括下列组分(g/L)：
淀粉(水解糖)3.8 豆粕粉0.28 硝酸铵0.17
硫酸镁0.09 磷酸氢二钾0.11 碳酸钙0.11
微量元素0.001-0.0015
发酵中培养温度为33℃、pH6.5、通风量为0.8vvm、发酵周期为65小时。
所述的A步骤中斜面菌种的制备过程中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1.2 酵母膏0.26 牛肉膏0.26
蛋白胨0.12 琼脂2.2 消泡剂0.09
培养基的pH为6.6。
扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养，将斜面菌种接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，其中一级扩大培养中培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖1.1 酵母膏0.28 牛肉膏0.27
蛋白胨0.13 消泡剂0.08
培养基的pH为6.6、接种量为1.5％、培养温度为33℃、通风量为0.16vvm、发酵周期为25小时。
二级扩大培养是将一级种子接入二级扩大培养的培养基经发酵制成二级种子，二级扩大培养中的培养基包括下列组分(g/L)：
蔗糖0.9 淀粉0.22 硫酸铵0.17 豆粉0.18
磷酸氢二钾0.14 磷酸二氢钾0.04 硫酸镁0.1
消泡剂0.09
培养基的pH为6.6、接种量为9％、培养温度为33℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为22小时。
步骤C中所述的微量元素的组成是(g/L)：
柠檬酸0.1 Ca(OH)2 0.005 CuSO4·5H2O 2.5×10-5
CoSO4 2.8×10-5 MgSO4 0.0086 FeSO4 1.8×10-3
ZnSO4 2.8×10-5 H3BO4 6×10-6 MnSO4 8.3×10-5
对发酵终产物进行提取得到温轮胶包括如下工艺步骤：
(1)第一次预处理：将发酵液搅拌升温70℃保温，降低至室温；
(2)第二次预处理：将经过第一次预处理后的发酵液中加入凝胶处理剂，反应42分钟后，调整pH至3.7反应40分钟至发酵液呈微凝胶状；
(3)萃取：加入萃取剂，使温轮胶呈纤维状析出；
(4)过滤、洗脱色素和杂质、干燥、粉碎、筛分。
步骤(1)中所述的保温时间为1小时；步骤(2)中所述的凝胶处理剂选用氯化钙，调整pH值选用盐酸；步骤(3)中的萃取剂选用乙醇；步骤(4)中的洗脱色素和杂质选用90％的乙醇，过滤选用挤压机，干燥选用真空干燥。
Claims (9)
1.温轮胶的制备方法，包括发酵步骤，是将温轮胶的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，其特征在于所述的发酵过程是在温度为25-36℃、pH为6.2-6.7的条件下进行需氧发酵，生产菌种选用鞘氨醇单胞菌CGMCC1561，对发酵终产物进行提取得到温轮胶。
2.根据权利要求1所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的碳源选自碳水化合物中的蔗糖、淀粉或水解糖。
3.根据权利要求1所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的氮源选自酵母膏、蛋白胨、豆粉、豆粕粉、无机铵盐中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将原始菌种制成斜面菌种；
B、将A步骤中制备的斜面菌种经扩大培养制成种子液；
C、将B步骤中制备的种子液按种子液∶发酵培养基为8％-10％的接种量接入发酵培养基进行发酵，其中每升发酵培养基包括下列质量份的组分，质量份的单位为克：
淀粉或水解糖3.5-4 粕粉0.25-0.3 硝酸铵0.15-0.2
硫酸镁0.01-0.15 磷酸氢二钾0.1-0.15 碳酸钙0.1-0.15
微量元素0.001-0.0015
发酵中培养温度为25-36℃、pH6.2-6.7、通风量为0.15-1vvm、发酵周期为48-96小时。
5.根据权利要求4所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的A步骤中斜面菌种的制备过程中的每升培养基包括下列质量份的组分，质量份的单位为克：
蔗糖1-1.2 酵母膏0.25-0.3 牛肉膏0.25-0.3
蛋白胨0.1-0.15 琼脂2-2.2 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7。
6.根据权利要求4所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的B步骤中的扩大培养包括一级扩大培养和二级扩大培养，将斜面菌种接入一级扩大培养的培养基经发酵制成一级种子，其中每升一级扩大培养中培养基包括下列质量份的组分，质量份的单位为克：
蔗糖1-1.2 酵母膏0.25-0.3 牛肉膏0.25-0.3
蛋白胨0.1-0.15 消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为1-2％、培养温度为25-36℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为24-27小时。
7.根据权利要求6所述的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的二级扩大培养是将一级种子接入二级扩大培养的培养基经发酵制成二级种子，每升二级扩大培养中的培养基包括下列质量份的组分，质量份的单位为克：
蔗糖0.85-1 淀粉0.2-0.25 硫酸铵0.15-0.2 豆粉0.15-0.2
磷酸氢二钾0.1-0.15 磷酸二氢钾0.04-0.05 硫酸镁0.01-0.15
消泡剂0.07-0.1
培养基的pH为6.2-6.7、接种量为8-10％、培养温度为25-36℃、通风量为0.12-0.2vvm、发酵周期为20-24小时。
8.根据权利要求1所述的的温轮胶的制备方法，其特征在于所述的对发酵终产物进行提取得到温轮胶包括如下工艺步骤：
(1)第一次预处理：将发酵液搅拌升温至60-80℃保温，降低至室温；
(2)第二次预处理：将经过第一次预处理后的发酵液中加入凝胶处理剂，反应30-45分钟后，调整pH至3.5-4.5反应30-45分钟至发酵液呈微凝胶状；
(3)萃取：加入萃取剂，使温轮胶呈纤维状析出；
(4)过滤、洗脱色素和杂质、干燥、粉碎、筛分。
9.根据权利要求8所述的温轮胶的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的保温时间为1小时；步骤(2)中所述的凝胶处理剂选用氯化钙，调整pH值选用盐酸；步骤(3)中的萃取剂选用乙醇；步骤(4)中的洗脱色素和杂质选用85％-90％的乙醇，过滤选用离心机或挤压机，干燥选用真空干燥。
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