CN110078654A - 一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核桃中乙酰5‑羟色胺的分离方法及应用，包括以下步骤：(1)提取：将核桃经粉碎后，10～70％体积浓度的乙醇于30‑70℃条件下提取2‑5h，过滤取上清液，如此重复3次，将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物；(2)分离：将步骤(1)所得核桃乙醇提取物进行柱层析，用乙醇溶液洗脱，得到乙酰5‑羟色胺。采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5‑羟色胺具有直接的提高记忆的活性，是核桃中具有增强记忆力的主要功效成分；与现有的5‑羟色胺相比，采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5‑羟色胺增强记忆力效果更好。
Description
技术领域
本发明涉及一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法及应用，属于食品、保健食品、医药技术领域。
背景技术
核桃是胡桃(Juglans regial L.)的成熟种子，含有丰富的不饱和脂肪酸，有“木本油料王”之称，具有改善脑缺血，抗疲劳，提高记忆力的作用。核桃中含有多种营养成分对大脑神经有一定的益处，可以提高脑神经的生理功能，增强神经细胞活力，增强记忆力。
但核桃中具体哪一种成分具有增强记忆力的功效并不清楚，也无法明确功效的机理。目前普遍认为核桃中大量的亚油酸、亚麻酸、DHA等不饱和脂肪酸是健脑益智的功效成分，能净化血液，清除脑血管壁内中的杂质，提高脑细胞的血液供应量，保证脑细胞所需充足的养料和氧气，提高大脑的生理功能。不可否认多不和脂肪对大脑有较好的保护作用，但并不具有直接的提高记忆的功能，在我们对核桃提取物的成分研究中发现一种生物碱，并证实该生碱具有直接的提高记忆的活性，是核桃中具有增强记忆力的主要功效成分。
发明内容
本发明首次从核桃中分离鉴定出乙酰5-羟色胺，并确定该化合物为核桃中具有增强记忆力的主要功效成分。
本发明的第一个目的是提供一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法包括以下步骤：
(1)提取：将核桃经粉碎后，用10～70％体积浓度的乙醇，于30-70℃条件下搅拌提取2-5h，过滤取上清液，如此重复3次，将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。
(2)分离：将步骤(1)所得核桃乙醇提取物进行柱层析，用乙醇溶液洗脱，得到乙酰5-羟色胺。
在本发明一种实施方式中，所述乙酰5-羟色胺的结构式为：
在本发明一种实施方式中，步骤(1)中核桃粉和乙醇的料液比为1:10-20(M/V)。
在本发明一种实施方式中，步骤(2)中是将步骤(1)所得核桃乙醇提取物上MCI柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ODS柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ODS-AQ柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；将30％乙醇洗脱部分反复上ODS-AQ柱，最后得乙酰5-羟色胺。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述方法得到的乙酰5-羟色胺的组合物。
在本发明一种实施方式中，所述组合物在食品领域的应用。
本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物由上述方法得到的乙酰5-羟色胺和药学上可接受的载体组成。
在本发明一种实施方式中，剂型包括粉剂、片剂、针剂、口服液或注射液。
在本发明一种实施方式中，所述药物组合物在增强记忆力方面的应用。
有益效果：
(1)采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5-羟色胺具有直接的提高记忆的活性，是核桃中具有增强记忆力的主要功效成分；
(2)与现有的5-羟色胺相比，采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5-羟色胺增强记忆力效果更好。
附图说明
图1为乙酰5-羟色胺组1H-NMR图；
图2为乙酰5-羟色胺组13C-NMR图；
图3为乙酰5-羟色胺组135DEPT-NMR图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：
从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺方法，其步骤如下：
核桃经粉碎后，按料液比1:10(M/V)加入70％的乙醇，于50℃条件下搅拌提取3h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上MCI柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS-AQ柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ODS-AQ柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。
利用HPLC测定所得的乙酰5-羟色胺的收率为90％，纯度为98.1％。
实施例2：
从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺的方法，其步骤如下：
核桃经粉碎后，按料液比1:15(M/V)加入10％的乙醇，于30℃条件下搅拌提取5h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上MCI柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS-AQ柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ODS-AQ柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。所得的产品的收率为89％，纯度为98％。
实施例3：
从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺的方法，其步骤如下：
核桃经粉碎后，按料液比1:20(M/V)加入60％的乙醇，于70℃条件下搅拌提取2h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上MCI柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ODS-AQ柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ODS-AQ柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。所得的产品的收率为91％，纯度为97.5％。
实施例4：
分别用HR EI-MS和核磁共振对实施例1获得的物质结构进行鉴定。
LC-MS检测条件为：采用ESI+模式，电压1170v，化合物m/z为218.4103，计算分子式为C12H14N2O2。
核磁共振检测条件为：以D2O为溶剂，四甲基硅烷为内标，Bruck 500MZ进行NMR测定，核磁共振检测结果如表1所示。1H和13C核磁共振数据见表1。
HR EI-MS给出分子质量为218.4103，计算分子式为C12H14N2O2，1H和13C核磁共振数据见表1。
表1核桃中乙酰5-羟色胺的1H和13C核磁共振数据
1H-NMR可见δ7.19(1H，d,J＝8.5)，7.08(1H，s),δ6.94(1H，d,J＝3.0)，δ6.71(1H，dd,J＝8.5,3.0)，表明苯环上有一个AMX系统。δ3.18(2H，t,J＝7.5),δ3.03(2H，t,J＝7.5)为脂肪链上的-CH2-氢信号,δ1.91(3H，s)为甲基氢信号。
从13C-NMR可见化合物共有12个碳信号，其中δ180.7为羰基碳信号，δ151.8应为连氧碳信号，δ41.4为一个连氮碳信号。从135DEPT可见125.3，113.3，113.1，103.5四个-CH碳信号，δ41.4，25.1为-CH2-碳信号，δ24.5为甲基碳信号。可以得出化合物为5-羟色胺类衍生物，并含有一个乙酰基。
通过以上测定分析该化合物的结构如下所示:
实施例5：
利用小鼠水迷宫实验检测乙酰5-羟色胺改善记忆功能，具体步骤如下：
选取3周龄(18g左右)雄性ICR小鼠，适应性喂养7d，观察小鼠状态并对小鼠进行标记和分组，空白组(灌生理盐水)共10只，实验组10只。灌胃周期为连续21天，于末次给药30min后进行水迷宫实验。
由表2可知，与空白组相比，乙酰5-羟色胺组试验小鼠第1～2天单日逃避潜伏期无明显差异，第3和第4天单日逃避潜伏期较空白组显著缩短，第5天和第3～5天内平均潜伏期与空白组相比有极显著差异。由表3可知，与空白组相比，乙酰5-羟色胺组目标象限游泳累计时间显著延长，且经过平台区域频次显著增加。综合小鼠定位航行试验和空间探索试验结果表明乙酰5-羟色胺能明显改善小鼠的记忆水平。
实施例6：
利用小鼠跳台实验检测乙酰5-羟色胺改善记忆功能，具体步骤如下：
选取3周龄(18g左右)雄性ICR小鼠，适应性喂养7d，观察小鼠状态并对小鼠进行标记和分组，空白组(灌生理盐水)共10只，实验组30只。灌胃周期为连续21天，于末次给药30min后进行跳台测试。
从表4可见，乙酰5-羟色胺组组第一次潜伏期较空白对照组显著缩短，错误次数显著减少，而其余各组均无显著性差异，说明具有改善小鼠记忆的功效。
对比例1：
采用实施例3和4的方法检测5-羟色胺改善记忆功能，所述5-羟色胺的结构式为：
对比例2：
采用实施例3和4的方法检测5，10二-羟色胺改善记忆功能，所述5，10二-羟色胺结构式为：
表2定向航行实验结果
注∶与空白组比较，*P<0.05；**P<0.01。
表3空间探索实验结果
注∶与空白组比较，*P<0.05。
表4小鼠跳台实验结果
注：与空白对照组比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
由表2-4的对照结果可知，将乙酰5-羟色胺中的乙酰基替换成氨基和羟基，说明采用其它基团的5-羟色胺对小鼠记忆的功效不及采用本发明方法分离的乙酰5-羟色胺。
对比例3：
例：采用实施例1中的方法，将柱中MCI层析柱替换成大孔树脂AB-8，其他条件或者参数与实施例1一致。所得产品的收率为53％，纯度为72％。
对比例4：
采用实施例1中的方法，将乙醇浓度调整为5％，其他条件或者参数与实施例1一致。所得产品的收率为31％，纯度为65％。发明人经多次实验证明，乙醇浓度过高或过低对产品收率和纯度都有很大影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：将核桃经粉碎后，用10～70％体积浓度的乙醇于30-70℃条件下提取2-5h，过滤取上清液，重复3次，将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物；
(2)分离：将步骤(1)所得核桃乙醇提取物进行柱层析，用乙醇溶液洗脱，得到乙酰5-羟色胺；所述乙酰5-羟色胺的结构式为：
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)中核桃粉和乙醇的料液比为1:10-20(M/V)。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中是将步骤(1)所得核桃乙醇提取物上MCI柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。
4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于，将经MCI柱层析后收集的乙醇洗脱部分减压浓缩后上样到ODS柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，将经ODS柱层析后收集的乙醇洗脱部分减压浓缩后上样到ODS-AQ柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，将收集的30％乙醇洗脱部分反复上ODS-AQ柱，最后得乙酰5-羟色胺。
6.含有权利要求1所述的方法得到的乙酰5-羟色胺的组合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物在食品领域的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1～6任一所述的方法得到的乙酰5-羟色胺和药学上可接受的载体组成。
9.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，剂型包括粉剂、片剂、针剂、口服液或注射液。
10.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物在增强记忆力方面的应用。
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