CN110055310A - 一种基于酶切的巢式pcr方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于酶切的巢式PCR方法，属于基因工程技术领域，解决了大批量PCR扩增不稳定及DNA的非特异性问题。方法包括以下步骤：S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后片段进行第二轮PCR的扩增。本发明提供的基于酶切的巢式PCR方法，整个流程使用两对引物，得到的模板进行二轮扩增时特异性远高于常规的巢式PCR，且使用这个模板进行大批量的PCR扩增时十分稳定，也不会产生非特异性扩增。

Description

一种基于酶切的巢式PCR方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于酶切的巢式PCR方法。
背景技术
如何获得单一的DNA条带是制备DNA分子量标准的基础要素。DNA片段的获得无非来自三个途径。
第一种DNA片段获得方式是质粒酶切。通过在载体中加入特定大小和比例的某些片段，并在片段中加入酶切位点，这样对提取的质粒进行酶切，即可得到设定大小和比例的片段。通常通过这种方式得到的条带之间浓度比例非常准确。这个方法能够适应较大片段的获得，但较难得到很多的小片段。
第二种DNA片段获得方式是使用两条反向互补的引物退火。这个方式适用于较小的条带获得，例如小于100bp的条带都可以使用两条引物退火的方式获得。退火的引物条带是否单一取决于引物的质量和退火的效率。
第三种DNA片段获得方式是PCR。虽然PCR能够扩增数十K的片段。但由于PCR的特性以及DNA分子量标准的要求，通常不会扩增很大的片段。更关键的问题是，PCR首先需要引物和模板的结合，难以避免的会产生较多的非特异性结合，这样就导致了非特异的扩增。即使小样实验时能够获得很单一的条带，而DNA分子量标准的产品对每个条带都需要非常多的量，放大PCR的规模时出现一些未知的小波动也会导致非特异的扩增产生。这样，PCR就显得难以控制且工作量极大。
因此，一般的制备一个DNA分子量标准很难使用一种方法获得所有的片段，需要多种方法同时使用以适应不同大小的需要。巢式PCR是一种变异的PCR反应，整个流程使用两对引物。第一轮引物扩增的DNA片段较长，第二轮引物在第一轮引物内侧，扩增片段长度较短。这样的好处是，当第一轮PCR扩增产物中含有非特异扩增产物时，第二轮扩增引物不大可能在第一轮的非特异产物上结合，而正常模板可以结合，这样就可以极大提高PCR的特异性。但实际上，巢式PCR虽然提高了特异性，但仍然避免不了非特异的扩增。即使将第一轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，此问题一样得不到完美解决。在第二轮扩增时模板纯度不足是导致二轮扩增时非特异的一个重要因素，即使一轮产物已进行琼脂糖凝胶电泳纯化，也不能彻底的分离产生干扰的非特异片段。特别是制作DNA Marker时需要大量扩增高浓度的片段，巢式PCR一轮产物作为二轮模板扩增的模板无法达到使用要求。
发明内容
本发明针对PCR方法获得DNA片段时非特异扩增的问题，特别是针对大批量PCR扩增时不稳定的问题，提供一种基于酶切的巢式PCR方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于酶切的巢式PCR方法，包括以下步骤：
S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；
S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；
S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；
S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后的片段进行第二轮PCR的扩增。
上述基于酶切的巢式PCR方法，PCR扩增反应由预变性和30次扩增温度循环组成，循环条件为98℃预变性2min，98℃变性20s，58℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，循环结束后72℃补齐延伸1min后反应结束。与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的基于酶切的巢式PCR方法，第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆，得到的模板特异性高，使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化，进一步提高了扩增片段的特异性和纯度，针对切下并纯化后的片段进行二轮扩增，特异性远高于常规的巢式PCR，且使用这个模板进行大批量的PCR扩增时十分稳定，也不会产生非特异性扩增。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1左为相同引物下100bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图2左为相同引物下150bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图3左为相同引物下200bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图4左为相同引物下250bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图5左为相同引物下300bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图6左为相同引物下400bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图7左为相同引物下500bp DNA片段的常规巢式PCR扩增条带凝胶电泳图，图1右为本发明提供的基于酶切的巢式PCR扩增条带凝胶电泳图；
图8为本发明提供的50bp ladder的凝胶电泳图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。
本发明提供了一种基于酶切的巢式PCR方法，包括以下步骤：
S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增。
具体地，分别以100-500bp长度的lambda DNA(从TaKaRa生物公司购买)为模板扩增一系列片段，模板加入量为1微升，聚合酶采用北京擎科新业生物公司的金牌试剂，加入量为45微升，所用第一轮扩增引物序列分别如表1，每对上、下游引物各2微升。PCR扩增反应由预变性和30次扩增温度循环组成，循环条件为98℃预变性2min，98℃变性20s，58℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，循环结束后72℃补齐延伸1min后反应结束。
表1第一轮PCR引物序列
名称 序列号 序列 酶切位点
100bp片段上游引物 SEQ ID 1 AAGCTTCGTCAGAGAATTCTGGCGAATCCTCTGACCA HindIII
100bp片段下游引物 SEQ ID 2 AAGCTT GATATCGTTAGCCCACCCAGCAAAATTCGG HindIII
150bp片段上游引物 SEQ ID 3 AAGCTT CAGGGCGATCCGGCGTCGGTATCGTTCCGGATT HindIII
150bp片段下游引物 SEQ ID 4 AAGCTT ACCTGTCTGATATCCGCAATCTGCTTTTCCGAG HindIII
200bp片段上游引物 SEQ ID 5 AAGCTT TGAAGCCTTCGATCCGGTTGAGGTGGATATGGG HindIII
200bp片段下游引物 SEQ ID 6 AAGCTT GTATCCAGCTTCTCCTTGACGGCTTTGAAGGAA HindIII
250bp片段上游引物 SEQ ID 7 AAGCTT GCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCG HindIII
250bp片段下游引物 SEQ ID 8 AAGCTT CTGCAGCGTGTCGAGCATCTTCATCTGCTCCAT HindIII
300bp片段上游引物 SEQ ID 9 AAGCTT GTAAAGATTTCAGGAGTCCTGAAAGACGGCACA HindIII
300bp片段下游引物 SEQ ID 10 AAGCTT CTTCCACCATCAGTTCAAGACGACGCAGCACCT HindIII
400bp片段上游引物 SEQ ID 11 AAGCTT GGTAAAAGTGAGCCGTGTTCCTGACGGTGTTGC HindIII
400bp片段下游引物 SEQ ID 12 AAGCTT CCCCAGCGCCAGTTGCGTGAAGCGGTATGTGGT HindIII
500bp片段上游引物 SEQ ID 13 AAGCTT TGTCATTTATGGAGCGTGAGGAATGGGTAAAGG HindIII
500bp片段下游引物 SEQ ID 14 AAGCTT ATCACCACCGAGGCCAGATACTGCGAGGTGGTT HindIII
S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；
具体地，连接体系：片段1μl，007-BS载体1μl，去离子水7μl，ToPo Mix1μl室温反应5min，转到DH5α感受态中混匀，冰浴10min，42度热激60s后立即放入冰中冰浴2min，加500μl无抗液体LB，37度复苏30min后移液器吸取所有液体到氨苄抗性平板上涂匀，37度过夜培养。挑选正确克隆的单菌落在4ml氨苄抗性液体养基中37℃过夜摇菌提质粒。12000rpm离心1min集菌，去废液，加入200μl Buffer S1重悬菌体，加200μl Buffer S2轻轻颠倒几次，最后加入Bufffer S3同样轻轻颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清在吸附柱中，离心1min去废液，加700μLBuffer W2离心1min，去废液重复一次，换收集管用50μlμl预热的Eluent洗脱获得质粒，凝胶电泳鉴定。
S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化。具体地，使用HindIII内切酶37摄氏度水浴过夜酶切质粒获得相应大小的扩增模板，酶切体系：内切酶2μl，10×Buffer 10μl，去离子水38μl。1％琼脂糖凝胶电泳并切胶纯化，每块胶加500μl溶胶液在65℃溶胶15min，过柱12000rpm离心1min去废液，加700μl Buffer W2洗两次离心去废液，用50μl 65摄氏度预热的Eluent洗脱。
S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后的片段进行第二轮PCR的扩增。
具体地，以步骤3纯化后的片段为模板，第二轮扩增一系列片段，模板加入量为1微升，聚合酶采用北京擎科新业生物公司的金牌试剂，加入量为45微升，所用第二轮扩增引物序列分别如表2，每对上、下游引物各2微升。PCR扩增反应由预变性和30次扩增温度循环组成，循环条件为98℃预变性2min，98℃变性20s，58℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，循环结束后72℃补齐延伸1min后反应结束。
表1第二轮PCR引物序列
分别对二轮扩增后的片段进行凝胶电泳，条带如图1-7右所示，同时，采用相同的引物，采用常规巢式PCR扩增法得到了相应的电泳图，如图1-7左所示。通过对比实验表明，采用常规巢式PCR扩增法即使在很低的浓度如300ng/μl下也出现了肉眼可见的非特异扩增条带，而本发明的方法即使在非常高的浓度下如300ng/μl也无肉眼可见的非特异扩增条带。同时配制50bp ladder后跑PAGE胶电泳，条带如图8所示，各条带很清晰，由此可得出此方法解决了大批量PCR扩增不稳定及非特异性问题。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (8)

1.一种基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将第一轮PCR引物的两端加上限制性内切酶酶切位点序列，进行第一轮PCR扩增；
S2、将扩增后片段连入克隆载体中，提取质粒挑选正确的克隆；
S3、使用相应的限制性内切酶酶切重组载体，切下的片段进行琼脂糖凝胶电泳纯化；
S4、使用第二轮PCR引物对步骤S3纯化后片段进行第二轮PCR的扩增。
2.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID1和SEQ ID2所示，第二轮PCR引物如SEQ ID15和SEQ ID16所示。
3.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID3和SEQ ID4所示，第二轮PCR引物如SEQ ID17和SEQ ID18所示。
4.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID5和SEQ ID6所示，第二轮PCR引物如SEQ ID19和SEQ ID20所示。
5.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID7和SEQ ID8所示，第二轮PCR引物如SEQ ID21和SEQ ID22所示。
6.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID9和SEQ ID10所示，第二轮PCR引物如SEQ ID23和SEQ ID24所示。
7.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID11和SEQ ID12所示，第二轮PCR引物如SEQ ID25和SEQ ID26所示。
8.根据权利要求1所述的基于酶切的巢式PCR方法，其特征在于，第一轮PCR引物如SEQID13和SEQ ID14所示，第二轮PCR引物如SEQ ID27和SEQ ID28所示。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592198A (zh) * 2019-09-10 2019-12-20 中山大学附属第七医院(深圳) 高灵敏度检测flt3/d835y基因突变的方法、系统和试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6068974A (en) * 1998-04-29 2000-05-30 Klann; Richard Chris Specific, highly sensitive, nested PCR detection scheme for the pseudorabies virus
WO2005066364A1 (ja) * 2003-12-26 2005-07-21 Takeshi Nagasaka 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法
WO2006033488A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Genomictree Inc. Method for detecting methylation of promoter using restriction enzyme and dna chip
CN101153340A (zh) * 2007-09-30 2008-04-02 中国农业大学 一种用于鉴定未知基因序列的连接片断pcr检测方法
CN102827828A (zh) * 2011-06-16 2012-12-19 华东医学生物技术研究所 一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6068974A (en) * 1998-04-29 2000-05-30 Klann; Richard Chris Specific, highly sensitive, nested PCR detection scheme for the pseudorabies virus
WO2005066364A1 (ja) * 2003-12-26 2005-07-21 Takeshi Nagasaka 核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット及びこれを用いた癌の検査方法
WO2006033488A1 (en) * 2004-09-21 2006-03-30 Genomictree Inc. Method for detecting methylation of promoter using restriction enzyme and dna chip
CN101153340A (zh) * 2007-09-30 2008-04-02 中国农业大学 一种用于鉴定未知基因序列的连接片断pcr检测方法
CN102827828A (zh) * 2011-06-16 2012-12-19 华东医学生物技术研究所 一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李巍等: "应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫", 《吉林农业大学学报》 *
蒋磊等: "限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究", 《四川大学学报(医学版)》 *
郑秀红等: "猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用", 《中国兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110592198A (zh) * 2019-09-10 2019-12-20 中山大学附属第七医院(深圳) 高灵敏度检测flt3/d835y基因突变的方法、系统和试剂盒
CN110592198B (zh) * 2019-09-10 2023-09-29 中山大学附属第七医院(深圳) 高灵敏度检测flt3/d835y基因突变的方法、系统和试剂盒

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