CN102827828A

CN102827828A - 一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法

Info

Publication number: CN102827828A
Application number: CN2011101616799A
Authority: CN
Inventors: 周国华; 王璐茜
Original assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Current assignee: Huadong Rearch Institute for Medicine and Biotechnics
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2031-06-16
Also published as: CN102827828B

Abstract

本发明属生物技术领域，公开一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法。设计上游引物和/或下游引物时引入目标序列中不含有的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列；向PCR反应体系中加入IIs型限制性内切酶，进行入IIs型限制性内切酶酶切反应后直接进行PCR扩增，当PCR反应体系中存在扩增产物污染时，IIs型限制性内切酶能够识别扩增产物上的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列，并完全切割掉扩增产物上与引物互补的部分，使扩增产物无法作为下一轮扩增的模板，从而消除聚合酶链式反应扩增产物对PCR反应的污染。本发明方法可选择性消除污染，不影响正常扩增效率和特异性，扩增产物可以正常进行下游操作。

Description

一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种基于IIs型限制性内切酶消除PCR扩增产物污染的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一种高灵敏的核酸扩增技术，但是，PCR技术过高的灵敏度导致其极易污染，产生假阳性结果，严重干扰PCR检测的准确性。PCR扩增时最主要的污染源是与目标序列相同的扩增产物，高浓度的PCR产物在实验操作过程中极易飞溅或形成气溶胶，对空气、试剂、移液器以及操作人员的手套衣物造成污染。

国内外的研究者提出了许多种PCR防污染技术，其中紫外照射法、酸水解法、酶消化法、化学修饰法等。紫外照射法和酸水解法降解所有核酸，无选择性消除污染；酶消化中需开管有再次引入污染的可能，UNG酶法引入尿嘧啶对下游操作造成了影响；化学修饰法引入的化学物质有致癌性，且会干扰PCR扩增。本方法采取IIs型限制性核酸内切酶建立一种新型防污染方法，克服上述方法的缺点，选择性的消除污染。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是应用IIs酶消化法来消除PCR污染，直接通过引物引入酶的识别位点，位点需靠近3’端，引物3’端的错配会严重影响PCR的扩增，所以我们采取新的IIs型限制性核酸内切酶，切割位点与识别位点相距一段碱基，建立一种新的防污染方法，有效消除污染的同时不会影响扩增效率。

本发明构思：防污染技术原理的构建思路是利用酶或化学物质作为工具来消除扩增产物污染，如何设计使工具能够区分模板和产物，是达到特异性消除污染的关键之处。本课题中的工具酶是IIs型限制性核酸内切酶，在扩增中，通过设计引物使产物得到修饰，与模板区分开来，修饰的“标志物”就是酶的识别位点。

防污染方法的引物上设计内切酶的识别位点，对正常引物的碱基序列前加入识别位点的碱基和保护碱基或是通过突变来造成错配碱基，模板不含酶识别位点，用含酶识别位点的引物进行PCR，得到的扩增产物序列中就包含了酶的识别位点。这样酶就可以识别并切割扩增产物，使产物失去与引物互补序列的核酸片段，即使扩增产物落入扩增体系中，引物也不能与残缺的产物结合，无法作为下一轮PCR反应的模板正常扩增。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，设计上游引物和/或下游引物时引入目标序列中不含有的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列；向PCR反应体系中加入IIs型限制性内切酶，对PCR反应体系进行入IIs型限制性内切酶酶切反应后直接进行PCR扩增，当PCR反应体系中存在扩增产物污染时，IIs型限制性内切酶能够识别扩增产物上的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列，并完全切割掉扩增产物上与引物互补的部分，使扩增产物无法作为下一轮扩增的模板，从而消除聚合酶链式反应扩增产物对PCR反应的污染；由于目标序列中不含有IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列，当PCR反应体系未被扩增产物污染时，IIs型限制性内切酶不会对目标序列进行切割。

其中，所述的IIs型限制性内切酶优选FokI。

引物中引入的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列可以通过合成引物时在引物中加入识别位点碱基和保护碱基实现。

其中，加入的保护碱基个数为1-5个。

所述的识别位点个数为1-4个，每个识别位点的碱基数目为4-6个。

引入所述的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列的位置是引物的近5’端，优选上游引物的近5’端。

引物中引入的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列还可以通过定向突变引物上的碱基形成能被IIs型限制性内切酶识别的错配碱基实现。

其中，所述的突变的碱基数目为1-5个。

所述的错配碱基位于引物的3’端或5’端起5-20个碱基。

本发明的有益效果

1，本发明方法可选择性消除污染，不影响正常扩增效率和特异性，扩增产物可以正常进行下游操作。

2，本发明方法的反应体系仍然是PCR的标准体系，只需在反应前向原有PCR体系中加入IIs型限制性内切酶，反应时在PCR反应程序前加一步酶切程序，无需改变PCR反应，即可消除上一轮PCR反应的扩增产物造成的污染。

3，本发明的方法中采用的工具酶为IIs型内切酶，这种酶比II型酶更适于应用在酶消化法防污染技术，IIs型酶由于其切割位点的位置在识别位点下游较远，酶能够完全切割掉模板上与引物互补的部分，使引物无法再与切割后的模板退火结合。而II型酶的识别位点和切割位点是在一起，不能完全切掉模板上与引物互补的部分，引物还是有可能再次与残余模板退火进而延伸扩增出产物，不能完全达到防污染的目的。

附图说明

图1.实施例1酶切特异性试验结果

其中(A)、(C)、(E)是以含FokI酶识别位点碱基序列的双链D-SRY作为模板，模板浓度分别是10⁵copies、10⁴copies、10³copies；(B)、(D)、(F)是以不含FokI酶识别位点碱基序列的单链S-SRY作为模板，模板浓度分别是10⁵copies、10⁴copies、10³copies。

图2.实施例2酶切特异性试验结果

其中(A)、(C)、(E)是PPAR-236作为模板，模板浓度分别是10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies；(B)、(D)、(F)是PPAR-N作为模板，模板浓度分别是10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies。

具体实施方式

下面以具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。IIs型内切酶FokI为NEB公司产品，引物和探针均由美国Invitrogen公司合成。

实施例1

为了考察本方法对单链模板扩增后的产物污染的消除效果，以单链探针连接产物S-SRY为单链模板，10μl连接反应体系组成：人全血中提取的基因组DNA(100～200ng)，探针1和探针2混合物(各5fmol)，1U Ampligase，20mM Tris-HCl(pH8.3)，25mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM NAD，0.01％Triton X-100。探针连接条件为94℃预扩增5min，随后94℃1min，60℃4min，共10个循环。得到的连接产物经过纯化后逐级稀释制备。

以单链模板S-SRY的序列为目标序列设计一对引物，上下游引物与目标基因顺序匹配，但上游引物在5’端前加入由识别位点碱基和保护碱基组成的FokI酶识别位点碱基序列。实施例1探针和引物顺序示于表1，其中加粗斜体标识的为识别位点碱基，下划线标识的是保护碱基。

表1.实施例1探针与引物顺序

PCR反应体系总体积为25μL，未加入DNA模板的PCR空白反应体系为2.5mmol/L MgCl₂，0.5mmol/L dNTP，1×PCR Buffer(100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，1％

X-100)，1U Taq酶，10pmol引物，0.4×SYBG染料，2U FokI酶。

单链模板S-SRY酶切条件为37℃温育30min，扩增条件为94℃预扩增5min，随后85℃15s，55℃10s，70℃15s，共35个循环，读板温度为76℃。扩增后的双链产物D-SRY纯化后作为污染源。

为了评价方法消除污染的特异性，我们在上述条件下，将D-SRY和S-SRY两种核酸片段作为模板(其中S-SRY是不含FokI酶识别位点的单链DNA，D-SRY是含FokI酶识别位点的双链DNA)，分别在不同浓度下FokI酶切后，进行实时荧光PCR，实时荧光曲线变化结果示于图1。其中(A)、(C)、(E)是以含FokI酶识别位点碱基序列的双链D-SRY作为模板，模板浓度分别是10⁵copies、10⁴copies、10³copies；(B)、(D)、(F)是以不含FokI酶识别位点碱基序列的单链S-SRY作为模板，模板浓度分别是10⁵copies、10⁴copies、10³copies。由图1可见模板经酶切后，D-SRY模板浓度分别为10⁵copies、10⁴copies、10³copies时经酶切后模板量降为0，完全被酶消化；S-SRY模板浓度分别为10⁵copies、10⁴copies、10³copies时经酶切后Ct值变化均小于0.5，模板量基本没有降低。由此可以表明不同浓度下，不含识别位点的核酸片段S-SRY基本不会被切割，含识别位点的D-SRY核酸片段会被完全切割，本方法特异性良好，能够在不影响模板扩增的前提下降低污染。

对污染产物的消除效果决定于酶切效率的高低，为了考察酶切效率，实验中在PCR的空白体系中加入不同量的双链产物D-SRY作为污染模板，在上述条件下酶切后，进行实时荧光PCR，对污染模板的酶切效率进行定量计算。酶切效率＝(酶切前模板copies-酶切后模板copies)/酶切前模板copies×100％。每个样本重复3次，定量计算结果示于表2。表2表明污染模板浓度在10⁵copies到10⁷copies时，酶切效率均在99.999％以上，酶切效率的SD均在0.001％，酶切效率很稳定。

表2.实施例1酶切效率试验结果

模板量/copies	酶切效率/％	SD
			1.00E+07	99.992％	0.001％
1.00E+06	100.000％	0.000％
			1.00E+05	100.000％	0.000％

实施例2

为了考察本发明方法对双链模板扩增后的产物污染的消除效果，以短核酸片段PPAR-N为目标双链模板，设计一对引物，上下游引物与目标基因顺序匹配，但上游引物引入能被IIs型限制性内切酶识别的错配碱基。实施例2模板及引物顺序示于表3，其中下划线标识的为错配碱基。

表3.实施例2引物顺序

PCR反应体系总体积为25μL，未加入DNA模板的PCR空白反应体系为2mmol/L MgCl₂，0.5mmol/L dNTP，1×PCR Buffer(100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，1％X-100)，1U Taq酶，10pmol引物，0.4×SYBG染料，0.6U FokI酶。

双链模板PPAR-N酶切条件为37℃温育40min，扩增条件为94℃预扩增3min，随后94℃20s，58℃20s，72℃25s，共35个循环，读板温度为77℃。扩增后的双链产物PPAR-236纯化后作为污染源。

为了评价方法消除污染的特异性，将不同浓度的含识别位点的核酸片段PPAR-236(污染源)和不含识别位点的核酸片段PPAR-N加入PCR空白体系中，经FokI酶切后进行实时荧光PCR，实时荧光曲线变化结果示于图2。其中(A)、(C)、(E)是PPAR-236作为模板，模板浓度分别是10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies；(B)、(D)、(F)是PPAR-N作为模板，模板浓度分别是10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies。由图2可见，模板经酶切后，PPAR-236模板浓度分别为10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies的(A)、(C)、(E)中Ct值分别增加了12.8、8.55、6.30，相当于模板量降低了约2-3个数量级；PPAR-N模板浓度分别为10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies的(B)、(D)、(F)中Ct值变化均小于0.5，模板量基本没有降低。表明不同浓度下，不含识别位点的核酸片段PPAR-N基本不会被切割，含识别位点的PPAR-236核酸片段会被切割，本方法特异性良好，能够在不影响模板扩增的前提下降低污染。

为了考察本方法消除PCR产物污染能力，在PCR的空白体系中加入不同量的PPAR-236作为污染模板，在上述条件下酶切后，进行实时荧光PCR定量考察。酶切效率＝(酶切前模板copies-酶切后模板copies)/酶切前模板copies×100％。每个样本重复3次，定量分析结果结果示于表4。由表4可见污染模板浓度越高，酶切效率及酶切稳定性越好。

表4.实施例2酶切效率试验结果

模板量/copies	酶切效率/％	SD
			1.00E+07	99.34％	0.19％
1.00E+06	98.50％	0.31％
			1.00E+05	81.84％	11％

Claims

1.一种消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于设计上游引物和/或下游引物时引入目标序列中不含有的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列；向PCR反应体系中加入IIs型限制性内切酶，对PCR反应体系进行入IIs型限制性内切酶酶切反应后直接进行PCR扩增，当PCR反应体系中存在扩增产物污染时，IIs型限制性内切酶能够识别扩增产物上的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列，并完全切割掉扩增产物上与引物互补的部分，使扩增产物无法作为下一轮扩增的模板，从而消除聚合酶链式反应扩增产物对PCR反应的污染；由于目标序列中不含有IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列，当PCR反应体系未被扩增产物污染时，IIs型限制性内切酶不会对目标序列进行切割。

2.根据权利要求1所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于所述的IIs型限制性内切酶为FokI。

3.根据权利要求2所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于引物中引入的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列通过合成引物时在引物中加入识别位点碱基和保护碱基实现。

4.根据权利要求3所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于加入的保护碱基个数为1-5个。

5.根据权利要求3所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于所述的识别位点个数为1-4个，每个识别位点的碱基数目为4-6个。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于引入所述的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列的位置是引物的近5’端，优选上游引物的近5’端。

7.根据权利要求1或2所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于引物中引入的IIs型限制性内切酶识别位点碱基序列通过定向突变引物上的碱基形成能被IIs型限制性内切酶识别的错配碱基实现。

8.根据权利要求7所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于所述的突变的碱基数目为1-5个。

9.根据权利要求8所述的消除聚合酶链式反应扩增产物污染的方法，其特征在于所述的错配碱基位于引物的3’端或5’端起5-20个碱基。