CN110055279A - 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法 - Google Patents

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Abstract

利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，将编码磁小体的关键基因mms6导入至外源细胞基因组内，诱导外源细胞表达mms6蛋白，此蛋白可以结合内源性铁离子，在体内合成内源性铁磁性纳米颗粒；将外源细胞移植入体内后，定期进行核磁共振扫描，通过核磁共振T2豫驰像检测出内源性的铁磁性纳米颗粒信号，可即时定位移植的外源细胞的位置。本发明中磁小体编码基因mms6所产生的示踪信号可传代给子代细胞，让外源细胞示踪信号持续存在，实现外源细胞的长期活体示踪。

Description

利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法
技术领域
本发明属于外源细胞示踪领域，具体涉及一种利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法。
背景技术
目前，干细胞替代治疗已经成为一种非常有潜力治疗手段，基础研究和临床研究中，干细胞治疗均显示出比较优越的治疗效果。
近年我国大力支持干细胞临床研究，逐步将干细胞治疗推上日程。这使得干细胞治疗成为一种非常有市场价值的治疗方法。目前，神经干细胞可以用于治疗帕金森病、脑瘫、脑卒中、脑外伤、多发性硬化、脊髓损伤等多种疾病。
评价干细胞的治疗效果非常关键，这是决定一种干细胞治疗是否能够在临床上开展的重要因素。干细胞示踪是评价干细胞替代治疗效果的第一步工作，即干细胞在体内是否仍然存在，有没有迁徙到其他位置，这些都是说干细胞治疗有效的前提。
干细胞示踪需要解决的关键问题是长期示踪，由于干细胞移植入体内到功能整合需要经历很多阶段，第一阶段是在宿主体内存活并增殖，第二阶段是迁徙到准确的位置，第三阶段神经干细胞分化为目的神经元，与宿主发生突触联系，变成有功能的神经细胞。这些过程需要历经数月时间，必须需要长期示踪干细胞才能够说明干细胞在治疗中发挥了作用。
20余年来，干细胞示踪主要围绕在研发新的示踪材料上，但是，这些材料都存在一个弊端，以四氧化三铁磁性纳米颗粒为例，在移植初期，其示踪信号虽然可以被核磁共振等影像学设备识别，但由于示踪材料是外源性提供的，并不会随着细胞的增殖而无限传代下去，事实上，示踪信号会不断的稀释，而且不断的随着代谢排出体外，这样就不能实现长期示踪，解决不了示踪的根本性问题。
而报告基因的方法是导入一段基因，使细胞内产生影像技术可识别的信号，从而实现活体示踪。这种方法虽然可以实现长期干细胞示踪，但是，目前大多数影像学报告基因产生的影像学识别信号需要借助特殊设备，对于一些穿透性特别差、难以通过目前临床应用的影像学设备识别的干性细胞，不能活体示踪外源性细胞。
除了干细胞的活体示踪，其他细胞的活体示踪也面临同样的问题，如肿瘤的细胞治疗中使用T细胞；免疫治疗中使用的DC细胞或者CIK细胞等，这些外源性提供的细胞虽然可以治疗效果中得到评估，但是对于细胞的状态和位置分布难以准确判断。
因此，实现外源性细胞的长期活体示踪，是外源性细胞示踪领域面临的最关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，利用磁小体编码基因对外源细胞进行基因修饰，使外源细胞内表达mms6蛋白，此种蛋白可使哺乳动物体内合成内源性铁磁性纳米颗粒，产生核磁共振T2超顺磁示踪信号，这种示踪信号可传代给子代细胞，让细胞示踪信号持续存在，从而实现细胞的长期示踪，克服了传统细胞示踪方法中不能长期活体示踪的弊端。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，包括以下步骤：
1)基因修饰
使用mms6慢病毒质粒转染外源细胞；其中，所述外源细胞的汇集度在50-60％，mms6慢病毒质粒数目：外源细胞数目＝5-10：1，转染后使用嘌呤霉素筛选稳定表达mms6蛋白的外源细胞，嘌呤霉素浓度为2-5μg/ml；
2)诱导磁小体基因的表达
将筛选出的外源细胞转入铁离子培养基中培养5-12天，外源细胞内生成内源性铁磁性纳米颗粒；
其中，所述的铁离子培养基以DMEM/F12为基本培养基，含有柠檬酸铁40-160μM、胎牛血清0.1-1.0vol％和维生素C 100-400μM；
3)示踪定位
将外源细胞移植入体内，移植后定期进行核磁共振扫描，使用T2序列，或SWI序列，或QSM序列扫描，可即时定位移植的外源细胞的位置，进行外源细胞的长期活体示踪。
进一步，步骤1)中，进行转染时，体系中加入慢病毒增强试剂10-20μl/ml。
又，步骤3)中，所述外源细胞在移植前进行共培养，使外源细胞包被2-6倍的细胞支架凝胶。
进一步，所述外源细胞为干细胞、T细胞、DC细胞或者CIK细胞。
优选地，所述干细胞为神经干细胞。
进一步，步骤2)中，所述的铁离子培养基中还含有神经营养因子N2 0.5-1.5vol％、B-27 0.5-1.5vol％、b-FGF 2-5ng/ml。
又，所述mms6慢病毒质粒为经过密码子优化的慢病毒质粒mms6-GFP-Puro，其序列如SEQ NO.1所示。
一种经过密码子优化的磁小体编码基因慢病毒质粒，其序列如SEQ NO.1所示。
自然界中存在一种古老细菌，其体内可以产生一种四氧化三铁的磁性纳米颗粒，这种颗粒使这种细菌可以在磁场中做定向运动，这种细菌又称之为趋磁细菌。这种磁性纳米颗粒可以随着趋磁细菌的繁殖而存在每个细菌体内，这种磁性纳米颗粒又称为磁小体，是一种天然的核磁共振T2造影剂，通过静脉将磁小体注入动物体内，在核磁共振下可以很清晰地识别出来，而且这种磁小体的豫驰性能要优于传统的四氧化三铁磁性纳米颗粒。
本发明利用指导磁小体合成的mms6基因，其为编码内源性磁性纳米颗粒合成的基因中的关键基因，它编码合成的mms6蛋白可将无序的变成有序铁纳米颗粒，从而形成有初步的含铁晶体结构，这是一种超顺磁结构晶体，在核磁共振T2像可有明显的信号，可用于外源细胞示踪。
本发明的技术构思是这样的：铁元素是哺乳动物体内最丰富的金属元素，通过将磁小体编码基因mms6转染至外源细胞内，表达磁小体编码基因mms6可以动员体内铁元素，实现体内自主合成示踪信号，因此，在稳定表达mms6的外源细胞内，可以把这种示踪信号不断的传代给子代细胞，让外源细胞示踪信号持续存在，以此可以实现外源细胞的长期示踪。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中，经过修饰及体外增强信号诱导合成的外源细胞具有T2像增强信号，使外源细胞及其子代稳定表达mms6，这种蛋白可以利用体内的铁源自主合成铁磁性纳米颗粒，是天然的示踪信号，不会随细胞分裂传代而被稀释，相反，其在体内的示踪信号会逐渐增加，对于外源细胞的定位非常直接，在移植外源细胞1-3个月后，外源细胞的活体示踪仍能进行。
本发明使用基因修饰的方法，使外源性细胞的表达活体可见的信号，直观的获得这些细胞的位置分布情况，可作为治疗效果评估工作的循证医学的证据，这对于了解治疗机制也有很大的帮助。
附图说明
图1为本发明实施例1中慢病毒质粒mms6-GFP-Puro的结构示意图。
图2为本发明实施例1中未转染的神经外源细胞与转染后的神经外源细胞T2序列的象图。
图3为本发明实施例1中转染经筛选后的神经干细胞免疫荧光图。
图4为本发明实施例1中转染后的外源细胞利用普鲁士蓝染色结果。
图5为本发明实施例1的外源细胞体内示踪信号的核磁成像。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中神经干细胞取材于上海动物实验中心wistar大鼠24小时新生鼠，取材经培养后观察成球较好，背景相对清楚，10倍镜下10-15个神经干细胞球/视野时即可用于基因修饰。
实施例1一种利用编码磁小体基因对神经干细胞进行长期活体示踪的方法，包括如下步骤：
1)磁小体基因修饰
将神经干细胞胰酶消化吹散，使用6孔板使神经干细胞的汇集度约50-60％。
加入干细胞培养基2.0-2.5ml，使用磁小体慢病毒质粒mms6-GFP-Puro(图1)与神经干细胞比例为5-10：1，同时使用EnvirusTM慢病毒增强试剂10-20μl/ml，混匀，置入37℃，5％CO2温箱，转染24小时。
24小时后离心收集转染后的细胞，用新鲜干细胞培养基换液，培养3天后，加入嘌呤霉素继续培养5-7天进行筛选，筛选出能稳定表达磁小体基因的干细胞，其中，嘌呤霉素浓度2-5μg/ml。
将未转染的神经干细胞与转染后稳定表达的神经干细胞，分别经离心沉淀后进行核磁扫描，获得T2序列的象图参见图2，其中，未转染T2值为123ms，转染mms6的神经干细胞T2值为71.4ms。
干细胞培养基中包括：DMEM/F12，神经营养因子N2 0.5-1.5％、B-270.5-1.5％，胎牛血清：0.1％-1％。
使用荧光显微镜观察神经干细胞(图3)，绿色荧光表达90％以上，证实神经干细胞成功稳定表达磁小体编码基因mms6。
2)诱导磁小体基因的表达
使用铁离子培养基继续培养筛选的神经干细胞，每3-4天更换新的铁离子培养基，培养时间约为7-12天。
铁离子培养基的具体配方为：DMEM/F12，添加神经营养因子N20.5-1.5％、B-270.5-1.5％，胎牛血清：0.1％-1％，b-FGF 2-5ng/ml，柠檬酸铁40-160μM，维生素C 100-400μM。
3)移植前细胞准备
将上述神经干细胞离心，细胞沉淀后转移至200微升EP管内，通过核磁共振T2豫驰像检测磁性纳米颗粒表达，确认T2值30-80时，即可用于神经干细胞的体内移植，且普鲁斯蓝染色确认细胞内具有蓝染的铁磁性纳米颗粒(参见图4，箭头指示处)。
将神经干细胞胰酶吹散后，1000-1200rpm离心获得细胞，将2-6倍细胞支架凝胶collagan与神经干细胞混匀，以此获得用于细胞移植的神经干细胞。
4)神经干细胞的移植和定位
以10％水合氯醛腹腔注射麻醉所需移植的wistar大鼠，局部以酒精消毒大鼠头部皮肤，剪开皮肤暴露颅骨及前囟点。双氧水局部消毒，颅钻与移植靶点所对应的颅骨表面钻孔。
吸取经磁小体基因修饰过的神经干细胞约10微升，通过立体定向设备注射入大鼠脑内核团，缝合后，连续3天腹腔注射青霉素预防感染。
一个月后可以复查头颅核磁，示踪神经干细胞的位置，参见图5，可见，在QSM序列上，神经干细胞注射部位(箭头指示处)的T2信号明显较周围组织低，可明确看到神经干细胞所在位置。
序列表
<110> 复旦大学附属华山医院
朱剑虹
<120> 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法
<130> 1911057
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> magnetotactic bacteria
<400> 1
tccggtgaat tcgccaccat gggatccgcc accatgcctg ctcagatcgc caacggcgtg 60
atatgtcctc ctggtgctcc tgccggaaca aaagccgctg ctgccatggg cgagatggaa 120
agagaaggcg ccgctgctaa agccggcgct gcaaaaacag gcgctgccaa gactggaacc 180
gtggccaaaa caggcattgc cgccaaaact ggcgtggcca cagctgttgc tgctccagct 240
gctcctgcta atgtggccgc tgctcaaggc gctggcacaa aagttgctct cggagccgga 300
aaagctgccg ctggcgctaa agttgtcggc ggcacaatct ggacaggcaa aggactcgga 360
ctcggccttg gtcttggact cggagcttgg ggacctatca tcctgggagt tgttggagct 420
ggcgccgtgt acgcctacat gaagtccaga gatatcgaga gcgcccagag cgacgaggaa 480
gtggaactta gggacgctct ggctggatcc tcggtaccaa gcttaagtga ctacaaggat 540
gacgatgaca aggattacaa agacgacgat gataaggact ataaggatga tgacgacaaa 600
taaagatcca tc 612

Claims (8)

1.利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，包括以下步骤：
1)基因修饰
使用mms6慢病毒质粒转染外源细胞；其中，所述外源细胞的汇集度在50-60％，mms6慢病毒质粒数目：外源细胞数目＝5-10：1，转染后使用嘌呤霉素筛选稳定表达mms6蛋白的外源细胞，嘌呤霉素浓度为2-5μg/ml；
2)诱导磁小体基因的表达
将筛选出的外源细胞转入铁离子培养基中培养5-12天，外源细胞内生成内源性铁磁性纳米颗粒；
其中，所述的铁离子培养基以DMEM/F12为基本培养基，含有柠檬酸铁40-160μM、胎牛血清0.1-1.0vol％和维生素C 100-400μM；
3)示踪定位
将外源细胞移植入体内，移植后定期进行核磁共振扫描，使用T2序列，或SWI序列，或QSM序列扫描，可即时定位移植的外源细胞的位置，进行外源细胞的长期活体示踪。
2.根据权利要求1所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，步骤1)中，进行转染时，体系中加入慢病毒增强试剂10-20μl/ml。
3.根据权利要求1所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，步骤3)中，所述外源细胞在移植前进行共培养，使外源细胞包被2-6倍的细胞支架凝胶。
4.根据权利要求1-3任一项所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，所述外源细胞为干细胞、T细胞、DC细胞或者CIK细胞。
5.根据权利要求4所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，所述干细胞为神经干细胞。
6.根据权利要求5所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的铁离子培养基中还含有神经营养因子N2 0.5-1.5vol％、B-27 0.5-1.5vol％、b-FGF 2-5ng/ml。
7.根据权利要求1所述利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，其特征在于，所述mms6慢病毒质粒为经过密码子优化的磁小体编码基因慢病毒质粒mms6-GFP-Puro，其序列如SEQ NO.1所示。
8.一种经过密码子优化的磁小体编码基因慢病毒质粒，其序列如SEQ NO.1所示。
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