CN112914547A - 内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 - Google Patents
内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112914547A CN112914547A CN202010204903.7A CN202010204903A CN112914547A CN 112914547 A CN112914547 A CN 112914547A CN 202010204903 A CN202010204903 A CN 202010204903A CN 112914547 A CN112914547 A CN 112914547A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- neural stem
- stem cells
- endogenous
- vitro
- tracing technology
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 110
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 31
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 23
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 6
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 2
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001951 dura mater Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 1
- 230000008558 metabolic pathway by substance Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
- A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves
- A61B5/055—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves involving electronic [EMR] or nuclear [NMR] magnetic resonance, e.g. magnetic resonance imaging
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
- A61D1/00—Surgical instruments for veterinary use
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Surgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及脑内内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法，本发明通过体外对神经干细胞的波谱特征分析获得波谱特征，该波谱特征峰值可作为神经干细胞在体内外的生物学标记，在动物活体水平验证后在活体水平对人脑内内源性神经干细胞进行检测，结果显示，海马区存在少量神经干细胞，随年龄的增加，其数量减少。本发明的示踪技术体系可利用MRS在活体水平示踪脑内内源性神经干细胞的分布和生物学行为，该技术体系对于临床神经科学及临床评估脑内神经再生、再生指数等提供了直观的、无创的技术方法，具有重要的临床价值和意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及脑内内源性神经干细胞的影像学示踪技术体系，具体涉及脑内内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法，本发明的示踪技术体系可利用MRS在活体水平示踪脑内内源性神经干细胞的生物学行为。
背景技术
研究公开了成年哺乳类动物脑内有产生新生神经元的能力，这些神经元由位于侧脑室下区和海马的神经干细胞(NSCs)产生，所述NSCs具有自我更新和产生子代细胞的能力。研究显示，NSCs在体内和体外能生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，这为利用NSCs修复因神经退行性疾病和外伤而受损或缺失的神经组织提供了可能。目前，在神经科学的若干领域均有涉及NSCs的研究，且进展迅速，但是，在活体水平无创性观察到NSCs在脑内的分布鲜有报道，基于NSCs重要临床应用价值，其已成为本领域技术人员关注的热点课题。
本发明的研究团队的前期研究中，在体外成功培养出NSCs，并利用超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)标记NSCs，将其移植于脑外伤患者脑内后用MRI观察到其在脑内的迁徙，实现了无创观察移植NSCs在宿主脑内的迁徙和分布(发表于新英格兰医学杂志)，在此基础上，进一步利用锰增强磁共振(ME-MRI)技术检测到移植的NSCs在大鼠脑损伤区域的功能活动，但是，上述研究均是基于外源性NSCs及对移植NSCs在宿主脑内的迁徙和功能的阶段性研究结果。
关于宿主脑内内源性NSCs的分布以及如何用无创的方法观察到其在体内的生物学行为已成为近年来脑科学研究领域中的又一热点。NSCs体内鉴定和示踪技术的发展将进一步加深人们对NSCs发生潜能的认识，目前，临床研究实践中采用正电子发射CT扫描、单光子CT扫描以及MRI技术均需要事先在体外用放射性标记物或超顺磁性氧化铁粒子SPIO标记NSCs，因此，不适于在活体水平检测大脑内源性NSCs。
氢核磁共振波谱(H-NMR)已被广泛用于体外检测低含量的已知代谢物和体液、组织中的未知复合物；H-NMR能检测神经元特有的代谢物如NAA和胶质细胞特有的产物如Cho；这些复合物已被作为分离组织中相应细胞种类可靠的生物标记物；但是，实践表明，H-NMR不能用于分析活体组织中的物质代谢情况。
基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供脑内内源性神经干细胞的影像学示踪技术体系及其建立方法，本发明的示踪技术体系可利用MRS在活体水平示踪脑内内源性神经干细胞的生物学行为。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的基础与现状，提供脑内内源性神经干细胞的影像学示踪技术体系，具体涉及内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系(即磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy,MRS)示踪技术)及建立方法，本发明基于MRS的技术体系可在体示踪人类脑内内源性神经干细胞NSCs的生物学特征及生物学行为。建立一种无创性磁共振示踪技术可在活体水平探测脑内内源性神经干细胞的分布和增殖情况。
本发明建立了内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系，其包括，在体外检测神经干细胞的波谱特征，在啮齿类动物活体水平进一步验证，在活体水平对人脑内内源性神经干细胞进行检测；尤其是MRS检测内源性神经干细胞NSCs的生物学特征及生物学行为。
更具体的，本发明的内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系通过下述方法建立，首先在体外对神经干细胞的波谱特征进行分析，确定其具特征性的峰值，位于1.28ppm处，该峰值随着神经干细胞浓度的升高而增加，而随着神经干细胞的分化其峰值则降低，；然后在啮齿类动物活体水平进一步验证，从不同年龄大鼠脑内分离出细胞，结果显示，随着年龄的增加，分离出的细胞中1.28ppm峰值逐渐减少；最后在活体水平对人脑内内源性神经干细胞进行检测，检测结果显示，海马区存在少量神经干细胞，随着年龄的增加，其数量减少。
本发明中，所述的位于1.28ppm处峰值的神经干细胞的波谱特征可作为神经干细胞在体内外的生物学标记。
本发明建立了一种在活体水平示踪脑内内源性神经干细胞的技术体系，在体外利用质谱仪检测获得体外培养神经干细胞的波谱特征，该波谱特征峰值可作为神经干细胞在体内外的生物学标记，可用于活体水平检测大鼠脑内神经干细胞的分布和生物学行为，该技术体系的建立对于临床神经科学至关重要，为临床评估脑内神经再生、再生指数等提供了直观的、无创的技术方法，具有重要的临床价值和意义。
本发明的在活体水平示踪脑内内源性神经干细胞的技术体系，其具有如下优点：
1)本发明在体外利用质谱仪检测体外培养神经干细胞的波谱特征，发现其具有特征性波峰，位于1.28ppm处；该1.28ppm峰值可作为神经干细胞在体内外的生物学标记；2)本发明利用H-MRS技术在活体水平检测大鼠脑内神经干细胞的分布和生物学行为；3)本发明能检测外源性神经干细胞移植到大鼠脑内后，利用MRS技术观测其在脑内的增殖情况；4)本发明进一步可在人体水平检测成人脑内内源性神经干细胞的生物学特征，利用MRS技术检测脑内内源性神经干细胞的生物学行为。
附图说明
图1：体外培养的神经干细胞波谱分析，其中，箭头表示神经干细胞的波峰在1.28ppm附近。
图2：NMR分析神经干细胞在分化培养液中向子代细胞分化后，发现1.28ppm的波峰下降，而NAA和Cho峰值升高(×103)。
图3：胚胎15天和出生后30天大鼠脑内神经干细胞、神经元和胶质细胞的波谱分析。
图4：正常大鼠左侧皮层移植神经干细胞、右侧皮层移植生理盐水后行波谱检测，发现移植神经干细胞侧皮层含有1.28ppm(A)，而移植生理盐水侧皮层则无1.28ppm波峰(B)。
图5：成人海马和皮层MRS检测示海马区可检测到少量1.28ppm波峰，其中，A，1.28ppm波峰(红色线)，B，皮层无1.28ppm波峰。
具体实施方式
实施例1大鼠胚胎NSCs的分离、培养与鉴定
(1)神经干细胞的原代培养：
选用14-16天孕鼠，用10％水合氯醛以0.32ml/100g体重腹腔麻醉后处死。常规消毒、开腹、取出胎鼠，并置于4℃PBS液中，取出胎脑后，剥除颅骨及脑膜，解剖显微镜下仔细分离出皮层组织和海马组织。采用机械消化法，将海马和皮层组织锐性切割成1mm3大小，转移至10ml细胞离心管，加入PBS至3ml，小心吹打后静置2分钟，吸出并收集上清液，在含有沉淀组织的离心管中加入相同体积的PBS液，再次吹打，如此反复，使组织体积逐渐减小直至形成单细胞悬液。800转/分钟离心5分钟，弃上清液。加入神经干细胞培养液，吹打均匀成单细胞悬液。台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞密度为1×106/ml。于每培养瓶中(24ml培养瓶)加入5×105个细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养。此后每5-7天机械分离克隆传代一次，3-5天半量换液。
(2)神经干细胞的传代培养：
显微镜下观察当50％神经球大小＞100μm时进行传代。将细胞悬液转移至10ml离心管，以800g离心5分钟，弃上清液。加入2ml全培养液，缓慢轻柔吹打细胞团块至单细胞悬液，调整细胞浓度后转移至培养瓶内。传代后的细胞悬液置于37℃，5％CO2培养箱中培养持续进行悬浮培养。连续传代4次以上，直至去除所有死细胞、细胞碎片和不规则细胞团块，形成规则的神经球。进行克隆分析时，取神经球用EDTA和机械消化法至大部分呈单细胞悬液。有限稀释法稀释细胞悬液后接种于96孔板，挑选含有单个细胞的培养孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3-5天更换培养液。显微镜下观察细胞形成克隆的情况。
(3)NSCs的Nestin鉴定：
实验前一天将24孔培养板涂多聚赖氨酸，过夜；使用前D-HANKs液洗三次，每次10分钟。选取培养中的神经球，800g离心3分钟，用少量神经干细胞培养液重悬，种植于24孔培养板上，37℃，5％CO2培养箱中培养2小时使NSCs球贴壁，然后进行间接细胞免疫化学染色法鉴定，步骤如下：
1)、吸尽细胞培养液，加入4％多聚甲醛固定贴壁细胞30分钟；
2)、0.01％PBS洗3次；
3)、加入0.1％Triton破膜30分钟；
4)、各孔加封闭液(正常同羊血清)150μl封闭30分钟；
5)、0.01％PBS洗3次，每次5分钟；
6)、吸尽多余的PBS，加小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体工作液100μl，置于湿盒内4℃过夜；
7)、第二天用0.01％PBS洗3次，每次5分钟；
8)、吸尽多余的PBS，加入荧光二抗羊抗鼠IgG-CY3，置于湿盒内37℃避光孵育1小时；
9)、0.01％PBS洗3次，荧光显微镜下观察并拍照。
(4)NSCs的分化鉴定：
选取上述部分培养的神经球，800g离心3分钟，弃上清，用含有血清的神经干细胞分化液和神经元基础培养基(Neurobasal，含2％B27添加剂和0.5mM L-谷氨酰胺)重悬细胞，种植于预先涂有多聚赖氨酸(50μg/ml poly-D-lysine)的24孔培养板上，分别于24h后和7天后行细胞免疫化学鉴定。进行免疫荧光双标时，同时加入两种一抗进行孵育，先进行荧光二抗CY3染色，在荧光显微镜下观察到阳性细胞后，然后，再加入第二个荧光二抗FITC染色1小时，经0.01％PBS洗3次后在荧光显微镜下观察并拍照。
实施例2成人脑内NSCs的分离、培养与鉴定：
开放性脑损伤患者清创后收集暴露的脑组织置于PBS溶液中，反复用PBS冲洗去除血块和污物。吸管吹打至单细胞悬液，用含10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％B27和20ng/ml EGF和bFGF的Neurobasal培养基(Gibco)调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行悬浮培养，48小时后更换新鲜培养液。每3-4天更换一半培养液，每7-10天传代1次。鉴定方法同上。
实施例3大鼠颅内NSCs立体定向移植：
选取体外培养的神经干细胞球，胰酶消化成单细胞悬液，在立体定向下移植5ul(1X105NSCs)于大鼠右侧大脑皮层，具体方法：大鼠予腹腔注射10％水合氯醛(0.32ml/100g)麻醉后，俯卧固定于KOPF立体定向仪上，正中切开头皮，在bregman点右侧2mm、后方2mm形成2mmX2mm骨窗，垂直距离硬膜深约2.5mm，用Hamilton微量注射器注入5μL约含1×105个大鼠NSCs悬液，并保留针头在注射处5min以防漏液，然后在3min内逐渐拔出注射针头。移植完毕后缝合头皮，腹腔注射庆大霉素2000单位进行抗菌治疗，大鼠回笼饲养。对照组大鼠移植生理盐水。
体外神经干细胞H-NMR扫描：
(1)选取培养的神经干细胞球，消化后PBS重悬成细胞团，然后在500M质子波谱仪上检测波长，温度保持在35℃，PH为7.25，使用FID扫描，8389.3频率波宽内32768点，时间窗1.95秒，重复时间2秒，扫描128次。扫描前需最小化水峰信号，在工作站软件中经傅里叶变换后得出波形图；
(2)(2)将神经干细胞定向分化为神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞，并检测相应波长；
(3)将神经干细胞在分化培养液中培养7天后制备成细胞悬液检测其波长；
(4)将胚胎15天大鼠大脑取出，消化、过滤制成细胞悬液；将出生后30天大鼠大脑取出，消化、过滤制成细胞悬液，分别进行波谱检测；
(5)从成年大鼠皮层和海马分离出细胞制备成细胞悬液分别进行波谱测定；
(6)为明确神经干细胞特定波长的物质，将神经干细胞溶解于氯仿：甲醇(2：1)，然后在质子波谱仪上检测波长，以分析其组成成分。
体外培养神经干细胞的波谱特征：
选取培养的神经干细胞球，消化后PBS重悬成细胞团，放在细胞检测管中，然后在500M质子波谱仪上检测波长，温度保持在35℃，PH为7.25，使用FID扫描，8389.3频率波宽内32768点，时间窗1.95秒，重复时间2秒，扫描128次。扫描前需最小化水峰信号，在工作站软件中经傅里叶变换后得出波形图(如图1所示)，不同浓度的神经干细胞球亦分别经波谱检测，获得1.28ppm波峰值与神经干细胞的数量呈正比例关系；选取培养的神经干细胞球，将NSCs分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，然后在500M质子波谱仪上分别检测波长，并未发现1.28ppm。
神经干细胞体外培养后波谱测定：
将神经干细胞在分化培养液中向子代细胞分化，第1和7天后在500M质子波谱仪上分别检测波长，温度保持在35℃，PH为7.25，使用FID扫描，8389.3频率波宽内32768点，时间窗1.95秒，重复时间2秒，扫描128次。扫描前需最小化水峰信号，在工作站软件中经傅里叶变换后得出波形图，发现1.28ppm的波峰下降，而NAA和Cho峰值升高(如图2所示)。
不同胎龄大鼠脑内细胞分离后波谱测定：
从胚胎15天(E15)和生后30(P30)天大鼠脑中分离、培养出细胞，分别进行波谱测定。结果显示与胚胎15天大鼠相比，出生30天大鼠脑内分离的细胞其1.28ppm生物标记物的含量减少，而终末分化细胞的特定波峰增加(如图3所示)。
实施例4大鼠脑内神经干细胞H-MRS扫描：
(1)第一组正常大鼠：采用德国Siemens公司3.0T磁共振仪和动物线圈扫描，以高分辨率的T2图像选择扫描范围(VOI＝2.5mm3)，分别定位于大鼠皮层和海马，使用多体素波谱序列扫描，扫描参数如下：TE/TR＝8ms/2000ms，2048数据采集点，波幅范围为16.01ppm(6410Hz)，扫描时间10分钟。数据经奇值变换法(SVD)处理；
(2)第二组大鼠：一侧皮层移植神经干细胞，另一侧皮层移植生理盐水。亦采用上述方法检测相应皮层的波谱。数据分别经奇值变换法(SVD)和傅里叶变换法处理。
成人脑内神经干细胞MRS扫描：
使用德国Siemens公司临床3T机器扫描，3位青春期(20岁以下)、3位成年人(30-40岁)和3位老年人(60岁以上)健康志愿者分别测定皮层和海马，扫描参数为：TE/TR＝30ms/2,000ms,海马voxel size 30x12x12mm3，皮层voxel size16x16x16mm3，spectral width2,000Hz，1,024points,128averages，扫描时间4min 55sec，数据经奇值变换法(SVD)处理。
比较两组数据时采用t检验，用SPSS 16.0软件进行统计学分析处理(t检验)；比较三组或以上数据时采用变量分析法(ANOVA)，以P＜0.05表示统计学有差异，P＜0.01表示统计学有显著性差异。
NSCs移植到大鼠脑内后波谱检测：
正常大鼠左侧皮层移植神经干细胞，右侧皮层移植生理盐水。采用德国Siemens公司3.0T磁共振仪和动物线圈扫描，以高分辨率的T2图像选择扫描范围(VOI＝2.5mm3)，分别定位于两侧皮层，使用多体素波谱序列扫描，扫描参数如下：TE/TR＝8ms/2000ms，2048数据采集点，波幅范围为16.01ppm(6410Hz)，扫描时间10分钟。数据分别经奇值变换法(SVD)和傅里叶变换法处理。结果显示NSCs移植侧皮层含有1.28ppm波峰(如图4A所示)，而对照侧则未检测到1.28ppm波峰(如图4B所示)。
成人脑内神经干细胞MRS示踪：
使用德国Siemens公司的临床3T机器扫描，对3位成年人(30-40岁)健康志愿者分别测定皮层和海马波谱。MRS扫描参数为：TE/TR＝30ms/2000ms,海马voxel size30x12x12mm3，皮层voxel size16x16x16mm3，spectral width 2000Hz，1024points,128averages，扫描时间4min 55sec。数据经后处理，结果显示海马区可检测到少量1.28ppm波峰(如图5A所示)，而皮层则无1.28ppm波峰(如图5B所示)，结果表明海马区存在少许神经干细胞，可通过MRS的方法检测到。
Claims (7)
1.内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系，其特征在于，所述的示踪技术为磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy,MRS)示踪技术，其包括，体外检测神经干细胞的波谱特征，在啮齿类动物活体水平进一步验证，在活体水平对人脑内内源性神经干细胞进行检测；基于MRS检测内源性神经干细胞NSCs的分布和增殖及生物学特征及生物学行为。
2.按权利要求1所述的内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系，其特征在于，所述的体外检测的神经干细胞的波谱特征峰值，位于1.28ppm处。
3.按权利要求2所述的内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系，其特征在于，所述的波谱特征峰值随神经干细胞浓度的升高而增加，随神经干细胞的分化其峰值则降低。
4.权利要求1所述的内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系的建立方法，其特征在于，其包括步骤，
首先在体外对神经干细胞的波谱特征进行分析，确定其特征性的峰值，位于1.28ppm处，该峰值随着神经干细胞浓度的升高而增加，而随着神经干细胞的分化其峰值则降低；然后在啮齿类动物活体水平进一步验证，从不同年龄大鼠脑内分离出细胞，结果显示，随着年龄的增加，分离出的细胞中1.28ppm峰值逐渐减少；最后在活体水平对人脑内内源性神经干细胞进行检测，检测结果显示，海马区存在少量神经干细胞，随着年龄的增加，其数量减少。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的特征性的峰值位于1.28ppm处。
6.权利要求1或2所述的体外检测的神经干细胞的波谱特征峰值在制备作为神经干细胞在体内外的生物学标记物中的用途。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的特征性的峰值在活体水平对人脑内内源性神经干细胞检测显示，海马区存在少量神经干细胞，随着年龄的增加，其数量减少。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010204903.7A CN112914547A (zh) | 2020-03-22 | 2020-03-22 | 内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010204903.7A CN112914547A (zh) | 2020-03-22 | 2020-03-22 | 内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112914547A true CN112914547A (zh) | 2021-06-08 |
Family
ID=76163114
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010204903.7A Pending CN112914547A (zh) | 2020-03-22 | 2020-03-22 | 内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112914547A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115624632A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-01-20 | 无锡市第二人民医院 | 近红外探针CelTrac1000在示踪神经干细胞中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170056347A1 (en) * | 2015-09-01 | 2017-03-02 | First Wave Biopharma | Methods and compositions for treating conditions associated with an abnormal inflammatory responses |
| CN106619722A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-10 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液 |
| CN110055279A (zh) * | 2019-03-15 | 2019-07-26 | 复旦大学附属华山医院 | 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法 |
-
2020
- 2020-03-22 CN CN202010204903.7A patent/CN112914547A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170056347A1 (en) * | 2015-09-01 | 2017-03-02 | First Wave Biopharma | Methods and compositions for treating conditions associated with an abnormal inflammatory responses |
| CN106619722A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-10 | 上海安集协康生物技术股份有限公司 | 一种治疗脑部损伤类疾病的神经干细胞注射液 |
| CN110055279A (zh) * | 2019-03-15 | 2019-07-26 | 复旦大学附属华山医院 | 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 张小年;张皓;: "创伤性颅脑损伤国内研究进展", 中国康复理论与实践, no. 02, pages 7 - 10 * |
| 李宗芳等: "大鼠面神经高位损伤后面神经核区磁共振波谱成像", 《重庆医学》, vol. 43, no. 28, pages 3757 - 3759 * |
| 李铭华等: "1H-MRS及行为学综合评价神经干细胞与脑源性神经营养因子联合治疗APP/PS-I转基因AD小鼠的疗效", 《中国中西医结合学会医学影像专业委员会第十五次全国学术大会暨上海市中西医结合学会医学影像专业委员会2017年学术年会暨》, pages 627 * |
| 汤海亮: "神经干细胞脑内示踪研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, no. 12, pages 066 - 13 * |
| 沈智伟: "多模态影像评估和监测神经干细胞移植治疗阿尔兹海默病的实验研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, no. 2, pages 071 - 2 * |
| 王广天等: "神经干细胞在缺血性脑卒中的示踪研究", 《中国药理学与毒理学杂志》, vol. 32, no. 9, pages 680 * |
| 白守民;薛卫平;刘宜敏;毕卓菲;梁碧玲;: "氧化铁标记神经干细胞对大鼠放射性脑损伤的磁共振成像研究", 中华细胞与干细胞杂志(电子版), no. 01, pages 37 - 41 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115624632A (zh) * | 2022-10-14 | 2023-01-20 | 无锡市第二人民医院 | 近红外探针CelTrac1000在示踪神经干细胞中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5753505A (en) | Neuronal progenitor cells and uses thereof | |
| Shichinohe et al. | In vivo tracking of bone marrow stromal cells transplanted into mice cerebral infarct by fluorescence optical imaging | |
| Drobyshevsky et al. | Developmental changes in diffusion anisotropy coincide with immature oligodendrocyte progression and maturation of compound action potential | |
| Yano et al. | In vivo fluorescence tracking of bone marrow stromal cells transplanted into a pneumatic injury model of rat spinal cord | |
| Jendelová et al. | Magnetic resonance tracking of transplanted bone marrow and embryonic stem cells labeled by iron oxide nanoparticles in rat brain and spinal cord | |
| Song et al. | In vivo visualization of the facial nerve in patients with acoustic neuroma using diffusion tensor imaging–based fiber tracking | |
| Gensert et al. | In vivo characterization of endogenous proliferating cells in adult rat subcortical white matter | |
| González-Martínez et al. | Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain | |
| US5887588A (en) | Automated method for classification and quantification of human brain metabolism | |
| Oka et al. | Autologous transplantation of expanded neural precursor cells into the demyelinated monkey spinal cord | |
| Friedrich et al. | Callosal microstructure affects the timing of electrophysiological left-right differences | |
| Aggarwal et al. | Diffusion MR microscopy of cortical development in the mouse embryo | |
| CN112914547A (zh) | 内源性神经干细胞磁共振无创性示踪技术体系及建立方法 | |
| CN110354281A (zh) | 一种双靶向多模态分子影像探针及其制备方法和应用 | |
| Xu et al. | In vitro and in vivo magnetic resonance tracking of sinerem-labeled human umbilical mesenchymal stromal cell-derived schwann cells | |
| Guzman et al. | Striatal grafts in a rat model of Huntington's disease: time course comparison of MRI and histology | |
| Lian et al. | Distribution heterogeneity of muscle spindles across skeletal muscles of lower extremities in C57BL/6 mice | |
| CN114983389A (zh) | 基于磁共振扩散张量成像的人脑轴突密度定量评估方法 | |
| Mao et al. | Type IIB focal cortical dysplasia with balloon cells in medial temporal lobe epilepsy: Clinical, neuroimaging, and histopathological findings | |
| CN105985999B (zh) | 建立用于评估神经功能的分析模块的方法 | |
| Okoye et al. | Migration of A7 immortalized astrocytic cells grafted into the adult rat striatum | |
| US11529054B2 (en) | Method and system for post-traumatic stress disorder (PTSD) and mild traumatic brain injury (mTBI) diagnosis using magnetic resonance spectroscopy | |
| WO2018019038A1 (zh) | 一种检测肿瘤组织边界或肿瘤基质细胞分布范围的方法 | |
| MX2014009489A (es) | Metodo y sistema de seleccion de neurogenesis que utiliza celulas madre derivadas del tejido adiposo. | |
| Herynek et al. | Metabolic changes in the rat brain after a photochemical lesion treated by stem cell transplantation assessed by 1H MRS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |