CN110045027B - 一种菠菜果实的质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菠菜果实的质量控制方法，属于中药及药食两用资源开发利用领域，方法用薄层色谱法鉴别菠菜果实中指标性成分β‑蜕皮激素或采用高效液相色谱法控制菠菜果实中指标性成分β‑蜕皮激素。本发明采用化学和现代分析技术手段，建立菠菜果实的快速、准确真伪鉴别和基于化学活性指标成分的质量控制体系，突破传统仅凭性状和经验鉴别方法控制菠菜果实真伪优劣，为菠菜果实科学、准确、快速鉴定和检测提供技术依据，基于鉴定和检测方法，采用改进一般常用放冷过滤的方法，采取低温冷藏处理样品后过滤，从而减少种子内蛋白、脂类等杂质，创造性地增加了鉴别方法的灵敏度，提高鉴别可信度，使整个质量控制体系更加完善。

Description

一种菠菜果实的质量控制方法
技术领域
本发明属于中药及药食两用资源开发利用领域，具体涉及一种菠菜果实的质量控制方法。
背景技术
菠菜果实来源于藜科菠菜属植物菠菜（Spinacia oleracea L.）的果实，菠菜既可食用，又能做药用，其药用最早见于唐代《食疗本草》，据《中华本草》记载，菠菜具有止血、养血、平肝、润燥之功效，而菠菜果实（又称菠菜子、菠薐菜子）具有清肝明目，止咳平喘之效，主治风火目赤肿痛，咳喘。菠菜果实含有小龙骨素B、蜕皮甾酮、α-菠菜甾醇、豆甾烯醇、豆甾烷醇等，前期预实验研究发现菠菜果实（菠菜种子）中含有β-蜕皮激素，β-蜕皮激素能促进人表皮细胞的分化，能对慢性脑血管痉挛具有治疗作用，是菠菜果实活性物质之一。
菠菜在种植过程中会发生变异、变种现象，出现栽培学上的“圆叶菠菜”、“尖叶菠菜”，两种菠菜果实都容易和其他植物果实混淆，如“尖叶菠菜”果实多具有刺，极像蒺藜果实，仅凭性状特征难以鉴别其真伪，目前缺乏菠菜果实或干燥果实快速、准确的薄层色谱定性鉴别体系，制约菠菜果实的资源开发利用和作为药用原料的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种菠菜果实的质量控制方法，以解决目前缺乏定性定量鉴定菠菜果实真伪和质量评价的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种菠菜果实的质量控制方法，该方法采用薄层色谱法鉴别菠菜果实中特征性化学成分或采用高效液相色谱法控制菠菜果实中指标性成分β-蜕皮激素。
薄层色谱法包括以下步骤：
A、供试品制备：
取菠菜果实粗粉0.5-20重量份，加甲醇1-200体积份，密塞称量后加热回流提取或超声波提取1-60min，取出放冷至室温，用甲醇补足减失重量，滤过，将滤液浓缩至0.1-20体积份，于-4- -20℃下低温处理0.5-24h，再次滤过，即得到菠菜果实供试品溶液；低温条件与室温形成温差梯度，从而改变供试品溶液的溶解性，影响溶质在溶剂中的分配，加之种子类材料富含油脂、蛋白质、糊精、淀粉等成分，此类成分鉴别专属不明显，容易造成干扰，在温度较高条件下可一定程度溶于甲醇，在低温条件下则易聚集、凝结，其他被检测类成分和杂质形成溶解差，需要至少0.5h才能形成较好的溶解分配差，再次过滤能够除去杂质及其他影响鉴别的干扰成分，使被检测成分鉴别专属性更好，更灵敏；
B、对照品制备：
取β-蜕皮激素对照品0.01-0.5重量份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素对照品溶液作为母液；精密吸取上述母液0.04-0.4体积份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素目标浓度溶液；
C、薄层色谱鉴别：
吸取步骤A和步骤B的两种溶液各0.01-0.05体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇的体积比1-15：0.2-4为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和5-40min，展开，取出，晾干，喷以0.1-20%硫酸乙醇溶液，加热或热风吹至斑点于日光下显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。
步骤A中所述菠菜果实粗粉为10-200目。
步骤B中所述对照品溶液的浓度为0.067mg/ml。
步骤C中所述展开剂为三氯甲烷-甲醇的体积比8：2。
高效液相色谱法包括以下步骤：
A、供试品制备：
取菠菜果实0.5-20重量份，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇1-200体积份，密塞，称量，超声处理1-60min，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液作为菠菜果实供试品溶液；
B、对照品制备：
取β-蜕皮激素对照品0.01-0.5重量份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素对照品溶液作为母液；精密吸取上述母液0.04-0.4体积份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素目标浓度溶液；
C、高效液相色谱测定：
分别吸取步骤A得到的菠菜果实供试品溶液和步骤B得到的β-蜕皮激素对照品溶液各0.005-0.05体积份，注入高效液相色谱仪，测定，色谱条件为：
固定相：反相C18色谱柱；
流动相：乙腈-水；
洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为：0-4min，18-22%；4-8min，18-25%；8-15min，25-19%；15-20min，23-18%；
流速：0.2-1.2ml/min；
检测波长：240-254nm；
柱温：20-45℃。β-蜕皮激素(CAS NO：5289-74-7,MF：C27H44O7)属于甾酮类物质，含有多元酚羟基，空间结构复杂，极性较大，易溶于乙醇，在丙酮中略溶，在乙酸乙酯、氯仿及热水中微溶，在乙醚中几乎不溶。对其吸收波长和检测条件进行分析和实验，在最大吸收波长条件下，其检测等度洗脱效果一直不理想，因此，为了达到更好的分离和检测效果，在进一步优化流动相种类的基础上，改变等度洗脱方法，采取梯度洗脱，最终菠菜果实中β-蜕皮激素HPLC检测条件满足要求，可准确、快速检测菠菜果实中β-蜕皮激素含量。
步骤A和B中甲醇的浓度为10-100%。
步骤C中所述梯度洗脱时以乙腈的体积比为参照：0-4min，20%；4-8min，20→23%；8-15min，23→21%；15-20min，21→20%；
步骤C中所述流速为1ml/min，检测波长为240nm，柱温为25℃。
步骤C中乙腈的浓度为100%。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
由于菠菜果实不同于菠菜，具有不同药用价值，本发明旨在建立菠菜果实真伪鉴别方法和菠菜果实中β-蜕皮激素含量测定方法，从而鉴别菠菜及其变种的真伪及评价质量，填补目前菠菜果实质量控制技术空白，并为菠菜果实法定质量控制标准制订提供依据。
本发明采用化学和现代分析技术手段，建立菠菜果实的快速、准确真伪鉴别和基于化学活性指标成分的质量控制体系，突破传统仅凭性状和经验鉴别方法控制菠菜果实真伪优劣，为菠菜果实科学、准确、快速鉴定和检测提供技术依据，基于鉴定和检测方法，采用改进一般常用放冷过滤的方法，采取低温冷藏处理样品后过滤，从而减少种子内蛋白、脂类等杂质，创造性地增加了鉴别方法的灵敏度，提高鉴别可信度，使整个质量控制体系更加完善。
本发明的菠菜果实鉴定方法建立了菠菜果实（含变种）的薄层鉴别方法，所建立的薄层色谱鉴别方法采用低温处理浓缩样品再过滤，除去样品中杂质及果实中油脂类、蛋白质类，极大提高了薄层鉴别斑点分离度和灵敏性，所建立的薄层鉴别方法适用于菠菜变种果实鉴别，薄层鉴别方法适用性好，专属性强，重现性好，可以有效检验菠菜果实真伪；建立了菠菜果实（含变种）中β-蜕皮激素含量检测方法，该方法准确性、灵敏度性高，稳定性好，符合准确、简便、灵敏、快速、可靠的原则，可以有效检测菠菜果实质量。
附图说明
图1为本发明中菠菜果实多批次样品低温处理薄层色谱图；
其中，从左到右，为β-蜕皮激素对照品和菠菜果实（圆叶菠菜）样品；
图2为本发明中菠菜果实多批次样品低温处理薄层色谱图；
其中，从左到右，为β-蜕皮激素对照品和菠菜果实（尖叶菠菜）样品；
图3为本发明中β-蜕皮激素对照品及菠菜果实（含变种）样品重叠高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
菠菜果实标本采自甘肃省兰州市，样品收集来源于源全国，经鉴定为藜科菠菜属植物菠菜（Spinacia oleracea L.）及其变种的干燥或新鲜果实。
薄层鉴别所用试剂为分析纯，高效液相色谱含量测定所用试剂为色谱纯，其余试药未特殊说明均为普通市售。
实施例1：
1）供试品溶液制备：取菠菜果实粗粉（40目）1g，加甲醇10ml，称量，超声处理15分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，滤过，滤液浓缩至约1.5ml，浓缩液-4℃处理0.5h后，过滤，作为供试品溶液备用；
2）对照品溶液制备：取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用。
3）点样与展开：照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述两种溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（8：2）为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。
4）显色与检视：喷以10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点日光下显色清晰；置紫外光灯365nm下检视；
5）结果：图1-2所示多批次供试品色谱中，在与β-蜕皮激素色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，多批次重复鉴别样品具有相同的薄层鉴别特征，所建立方法专属性好，灵敏度高，重现性好，可用于菠菜果实的质量控制。
实施例2：
1）供试品溶液制备：取菠菜果实粗粉（10目）0.5g，加甲醇5ml，称量，超声处理10分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，滤过，滤液浓缩至约1.5ml，浓缩液-20℃处理1h后，过滤，作为供试品溶液备用；
2）对照品溶液制备：取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用。
3）点样与展开：照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述两种溶液20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（6：1.5）为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。
4）显色与检视：喷以20%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点日光下显色清晰；置紫外光灯365nm下检视；
5）结果：图1-2所示多批次供试品色谱中，在与β-蜕皮激素色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，多批次重复鉴别样品具有相同的薄层鉴别特征，所建立方法专属性好，灵敏度高，重现性好，可用于菠菜果实的质量控制。
实施例3：
1）供试品溶液制备：取菠菜果实粗粉（200目）20g，加甲醇200ml，称量，超声处理60分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，滤过，滤液浓缩至约20ml，浓缩液-10℃处理24h后，过滤，作为供试品溶液备用；
2）对照品溶液制备：取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用。
3）点样与展开：照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（7.5：1.9）为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。
4）显色与检视：喷以0.5%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点日光下显色清晰；置紫外光灯365nm下检视；
5）结果：图1-2所示多批次供试品色谱中，在与β-蜕皮激素色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，多批次重复鉴别样品具有相同的薄层鉴别特征，所建立方法专属性好，灵敏度高，重现性好，可用于菠菜果实的质量控制。
实施例4：
1）供试品溶液制备：取菠菜果实粗粉（100目）10g，加甲醇100ml，称量，超声处理30分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，滤过，滤液浓缩至约10ml，浓缩液-15℃处理10h后，过滤，作为供试品溶液备用；
2）对照品溶液制备：取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用。
3）点样与展开：照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述两种溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（7：1.8）为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。
4）显色与检视：喷以5%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点日光下显色清晰；置紫外光灯365nm下检视；
5）结果：图1-2所示多批次供试品色谱中，在与β-蜕皮激素色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，多批次重复鉴别样品具有相同的薄层鉴别特征，所建立方法专属性好，灵敏度高，重现性好，可用于菠菜果实的质量控制。
实施例5：
1）供试品溶液制备：取菠菜果实粗粉（60目）5g，加甲醇50ml，称量，超声处理20分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，滤过，滤液浓缩至约5ml，浓缩液-5℃处理5h后，过滤，作为供试品溶液备用；
2）对照品溶液制备：取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用。
3）点样与展开：照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，分别吸取上述两种溶液15μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（6.5：1.6）为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和10分钟，展开，取出，晾干。
4）显色与检视：喷以15%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点日光下显色清晰；置紫外光灯365nm下检视；
5）结果：图1-2所示多批次供试品色谱中，在与β-蜕皮激素色谱相应位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，多批次重复鉴别样品具有相同的薄层鉴别特征，所建立方法专属性好，灵敏度高，重现性好，可用于菠菜果实的质量控制。
实施例6：
1)供试品溶液制备：精密称取菠菜果实粗粉（40目）2.5g，加甲醇25ml，称定重量，超声处理15分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，0.45μm滤膜滤过，取续滤液备用，作为供试品溶液；
2)标准品溶液制备：另取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用，照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）试验，分别吸取上述两种溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，测定。
3)洗脱梯度：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
4）色谱系统适应性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6μm×25cm）(C18,5μm)，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，检测波长240nm，柱温30℃，理论板数以β-蜕皮激素计，应不低于10000。
5)重复性考察：取菠菜果实粉末4份，制备供试品溶液，对照品溶液，依法检测，连续进样，计算样品中β-蜕皮激素峰面积RSD值。结果见表1。
Figure 544598DEST_PATH_IMAGE002
结果表明，样品中β-蜕皮激素峰面积RSD值<5，说明方法重现性良好。
6)稳定性考察：取β-蜕皮激素对照品溶液4份，在制备后0、6、12、24小时进样，如检测方法所示，依法检测，连续进样，计算β-蜕皮激素峰面积RSD值。结果见表2。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果表明，样品中β-蜕皮激素峰面积RSD值<2.5，说明方法稳定性性良好。
实施例7：
1)供试品溶液制备：精密称取菠菜果实粗粉（60目）1.0g，加甲醇10ml，称定重量，超声处理30分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，0.45μm滤膜滤过，取续滤液备用，作为供试品溶液；
2)标准品溶液制备：另取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用，照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）试验，分别吸取上述两种溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，测定。
3)洗脱梯度：
Figure 337104DEST_PATH_IMAGE004
4）色谱系统适应性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6μm×25cm）(C18,5μm)，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，检测波长242nm，柱温25℃，理论板数以β-蜕皮激素计，应不低于10000。
其他步骤同实施例6。
实施例8：
1)供试品溶液制备：精密称取菠菜果实粗粉（200目）20.0g，加甲醇200ml，称定重量，超声处理60分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，0.45μm滤膜滤过，取续滤液备用，作为供试品溶液；
2)标准品溶液制备：另取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用，照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）试验，分别吸取上述两种溶液各5μl，分别注入高效液相色谱仪，测定。
3)洗脱梯度：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
4）色谱系统适应性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6μm×25cm）(C18,5μm)，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，检测波长254nm，柱温45℃，理论板数以β-蜕皮激素计，应不低于10000。
其他步骤同实施例6。
实施例9：
1)供试品溶液制备：精密称取菠菜果实粗粉（10目）0.5g，加甲醇5ml，称定重量，超声处理10分钟，取出放冷，加甲醇补足减失重量，0.45μm滤膜滤过，取续滤液备用，作为供试品溶液；
2)标准品溶液制备：另取β-蜕皮激素对照品适量，加甲醇制成1ml含β-蜕皮激素0.067mg/ml的溶液，作为对照品溶液备用，照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）试验，分别吸取上述两种溶液各50μl，分别注入高效液相色谱仪，测定。
3)洗脱梯度：
Figure 929891DEST_PATH_IMAGE006
4）色谱系统适应性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6μm×25cm）(C18,5μm)，以乙腈-水为流动相梯度洗脱，检测波长245nm，柱温35℃，理论板数以β-蜕皮激素计，应不低于10000。
其他步骤同实施例6。
5）不同批次菠菜果实β-蜕皮激素含量测定结果如表3所示，HPLC图谱如图2所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
根据上述实验结果，所建立HPLC含量测定方法可准确、快速测定菠菜果实中β-蜕皮激素含量，可用于菠菜果实的质量控制，不同菠菜果实β-蜕皮激素含量在60-250μg/mg之间。

Claims (7)

1.一种菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：该方法采用高效液相色谱法控制菠菜果实中指标性成分β-蜕皮激素，包括以下步骤：
A、供试品制备：
取菠菜果实0.5-20重量份，精密称定，置锥形瓶中，精密加甲醇1-200体积份，密塞，称量，超声处理1-60min，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液作为菠菜果实供试品溶液；
B、对照品制备：
取β-蜕皮激素对照品0.01-0.5重量份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素对照品溶液作为母液；精密吸取上述母液0.04-0.4体积份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素目标浓度溶液；
C、高效液相色谱测定：
分别吸取步骤A得到的菠菜果实供试品溶液和步骤B得到的β-蜕皮激素对照品溶液各0.005-0.05体积份，注入高效液相色谱仪，测定，色谱条件为：
固定相：反相C18色谱柱；
流动相：乙腈-水；
洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中乙腈的体积比随时间变化为：0-4min，20%；4-8min，20%→23%；8-15min，23%→21%；15-20min，21%→20%；
流速：0.2-1.2ml/min；
检测波长：240-365nm；
柱温：20-45℃。
2.根据权利要求1所述的菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：该方法还包括采用薄层色谱法鉴别菠菜果实中特征性化学成分，包括以下步骤：
A、供试品制备：
取菠菜果实粗粉0.5-20重量份，加甲醇1-200体积份，密塞称量后加热回流提取或超声波提取1-60min，取出放冷至室温，用甲醇补足减失重量，滤过，将滤液浓缩至0.1-20体积份，于-4- -20℃下低温处理0.5-24h，再次滤过，即得到菠菜果实供试品溶液；
B、对照品制备：
取β-蜕皮激素对照品0.01-0.5重量份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素对照品溶液作为母液；精密吸取上述母液0.04-0.4体积份，加甲醇1-10体积份，制成β-蜕皮激素目标浓度溶液；
C、薄层色谱鉴别：
吸取步骤A和步骤B的两种溶液各0.01-0.05体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇的体积比6-8：1.5-2为展开剂，薄层板置于展开缸中饱和5-40min，展开，取出，晾干，喷以0.5-20%硫酸乙醇溶液，加热或热风吹至斑点于日光下显色清晰，置紫外光灯365nm下检视。
3.根据权利要求2所述的菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：采用薄层色谱法鉴别菠菜果实中特征性化学成分的步骤A中所述菠菜果实粗粉为10-200目。
4.根据权利要求3所述的菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：采用薄层色谱法鉴别菠菜果实中特征性化学成分的步骤B中所述对照品溶液的浓度为0.067mg/ml。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用薄层色谱法鉴别菠菜果实中特征性化学成分的步骤C中所述展开剂为三氯甲烷-甲醇的体积比8：2。
6.根据权利要求1所述的菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：采用高效液相色谱法控制菠菜果实中指标性成分β-蜕皮激素的步骤A和B中甲醇的浓度为10% -100%。
7.根据权利要求6所述的菠菜果实的质量控制方法，其特征在于：采用高效液相色谱法控制菠菜果实中指标性成分β-蜕皮激素的步骤C中所述流速为1ml/min，检测波长为240nm，柱温为25℃。
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