CN110028545A - 一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法 - Google Patents

一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法。该方法是以桔梗总皂苷为原料，通过碱水解获得桔梗皂苷体内代谢的主要次生皂苷，再利用中压制备液相色谱对所得桔梗次生皂苷进行分离，获得桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696两种主要桔梗次生皂苷。桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696可以有效改善细胞膜的通透性，辅助药物进入细胞，可用于辅助药物递送。

Description

一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法
技术领域
本发明属于化学提取技术领域，涉及一种制备能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备技术。
背景技术
桔梗为桔梗科植物Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的根，始载于《神农本草经》，《本草纲目》释名曰：“此草之根结实而梗直故名”。桔梗性味苦、辛、平，归肺经，具有抗炎、祛痰、镇咳、抗溃疡、降血压、扩张血管、解热镇痛镇静、降血糖、抗胆碱、促进胆酸分泌等广泛的药理作用。桔梗是临床上治肺的常用中药，被誉为舟楫之剂。据《本草求真》记载：“桔梗系开提肺气之品，可为诸药舟楫”，是指桔梗在方剂中的配伍增效作用而言，比喻桔梗主升主浮，善能载药上升的特殊功效而言。具体是指桔梗能引导方剂中的主药上行，用以治疗上焦疾病，为心肺经“引经报使”之首选。
近年来从桔梗中已经分离得到了皂苷、黄酮、酚酸、多烯和固醇等百余种化合物，其中桔梗皂苷被认为是主要的药效成分，目前报道有近70种[Zhang L等.JEthnopharmacol.2015,164(2015):147-161；Lee JW等.Int J Mol Sci.2015,16(11):26786-96]。桔梗皂苷以三萜皂苷为主，其结构上的共同特点是C12位为烯键和C28位为羧基。其苷元结构变化主要发生在C24位，有-CH3，-CH2OH以及-COOH等3种主要类型，而化学结构的复杂性和多样性则主要表现在C3,28位糖酯化所连接的不同的糖及其衍生物。根据皂苷元的不同其主要皂苷元有四种：桔梗皂苷元(Platycodigenin,I)，远志酸(polygalacicacid,II)，桔梗酸A(platycogenic acid A,III)，桔梗酸A内脂(platycogenic acid Alactone,IV)。研究发现桔梗的入血的次生皂苷主要为桔梗皂苷682和桔梗皂苷696[TangZY等.RSC Adv.2017，7：37459–37466]，其分别来源于桔梗总皂苷的体内代谢产物。
现代药理研究表明：桔梗皂苷具有改善心血管、神经保护、抗肿瘤和抗病毒等作用[Nyakudya E等.Prev Nutr Food Sci.2014,19(2):59-68；Chun J等.Planta Med.2013,79(8):639-45；Wu J等.Biol Pharm Bull.2012,35(8):1216-21；Xie Y等.ChemBiodivers.2010,7(1):178-85]。桔梗皂苷D(platycodin D)作为代表性的化合物，已报道具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种活性[Khan M等.J Cell Mol Med.2016,20(3):389-402；Zhao R等.J Cancer.2015,6(7):623-31；Jang KJ等.Int J Mol Med.2013,31(6):1357-66；Wang B等.Biomed Pharmacother.2016；84:1108-1112]。尽管桔梗总皂苷体外有较强的溶血作用[Sun H等.Int Immunopharmacol.2011,11(12):2047-56]，但口服桔梗提取物小鼠的半数致死量为24g/kg，桔梗总皂苷为420mg/kg，而皂苷D的安全剂量超过2g/kg[Lee WH等.Toxicological Research.2011,27:217-224]。目前桔梗被广泛地用于治疗呼吸系统疾病的治疗[Ishimaru N等.J Complement Integr Med.2013,11(1):51-4；Tao W等.IntImmunopharmacol.2015,27(1):138-47]，其能显著增加呼吸道黏液分泌量，有明显的祛痰、镇咳作用[Ryu J等.Phytomedicine.2014,21(4):529-33；Choi JH等.Food and ChemicalToxicology.2009,47:1272-1279]。
在桔梗总皂苷的提取分离方面，中国专利分别公开了多项桔梗皂苷提取物的提取纯化方法[申请号：CN200610051607；CN200610014212；CN201010216536；CN201110257194；CN201410693281；CN20151026373；CN201610421238；CN201610263372；CN201811001707；CN201811001686]。其分别采用水(包括酸碱溶液)浸泡，仿生酶解等方法进行预处理，再采用乙醇、乙酸乙酯、水等溶剂提取，进一步通过树脂吸附解离的技术工艺纯化。此外，中国专利也公开了离子液体提取[申请号:CN201610263399]，以及采用超临界萃取[申请号:CN200710014170；CN201610263399]和微波萃取[申请号:CN200710015598]等技术方法。
关于桔梗皂苷中的单体成分的制备方法，中国专利仅公开了桔梗皂苷D的制备方法。其具体是在桔梗总皂苷提取的基础上，进一步通过硅胶柱[申请号:CN200710056248.X]，超滤、纳滤、重结晶[申请号:CN201410783514]等手段进一步纯化而制得。但目前还没有涉及桔梗皂苷中的药效成分、特别是桔梗次生皂苷的制备工艺和方法的报导。
发明内容
本发明目的是为了获取改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷，设计公开了一种桔梗次生皂苷的制备工艺和方法。
本发明的技术方案
一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，包括：
1)以桔梗科植物Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的根为原料，采用水或乙醇等溶剂提取，并通过大孔树脂吸附解离制备所要的桔梗总皂苷原料；
2)采用碱水解的方法获取桔梗次生皂苷，所述的碱限定为氢氧化钠，碱溶液的pH限定在pH12至pH14之间，碱水解的温度限定在80℃至100℃之间，碱水解的时间限定在1小时至5小时之间。其中优选条件为：pH13.2，温度93.4℃，时间4.5小时；
3)选用硅胶色谱柱的中压制备液相色谱分离纯化上述桔梗次生皂苷，并优选Flash Column Silica-CS色谱柱，洗脱体系为二氯甲烷-甲醇-水三元梯度洗脱的体系，具体包括四个洗脱梯度，分别是流动相A：二氯甲烷-甲醇-水＝7:1.5:0.15；流动相B：二氯甲烷-甲醇-水＝8:2:0.2；流动相C：二氯甲烷-甲醇-水＝9.8:2.8:0.3；流动相D：二氯甲烷-甲醇-水＝9.5:3:0.4。
4)所制备的具有活性的两种桔梗次生皂苷限定为桔梗次生皂苷682和696，其结构分别如化学式(I)、(II)所示：
5)所述的中压制备色谱的梯度洗脱体系中，桔梗次生皂苷的等梯度洗脱过程分别为：采用流动相A洗脱杂质，充分平衡后，采用流动相B洗脱桔梗次生皂苷682；然后采用流动相C平衡洗脱条件，充分平衡后，再采用流动相D洗脱桔梗次生皂苷696。
6)所方法制备的两种桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696均可以有效改善细胞膜的通透性，辅助药物进入细胞，可用于药物递送，其优选桔梗次生皂苷682。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，选用体外碱水解的方式将部分桔梗总皂苷的3位和17位糖链断裂，转化为桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696。所获得的两种桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696的混合物，经中压制备色谱进一步纯化获得单体成分。所获得的桔梗次生皂苷682和次生皂苷696可以有效改善细胞膜的通透性，辅助药物进入细胞，并提高药物的细胞递送程度，可用于辅助药物的递送。
附图说明
图1是桔梗总皂苷的分离制备图。
图2是桔梗总皂苷的解析图，其中(a)为桔梗总皂苷UPLC-Q/TOF检测图，(b)为桔梗皂苷类物质，(c)为桔梗酸类物质，(d)为桔梗次生皂苷682，(e)为桔梗次生皂苷696。
图3是桔梗次生皂苷水解条件的考察图，其中(a)为酸水解考察结果，(b)为碱水解考察结果。
图4是桔梗次生皂苷水解条件的优化图。
图5是桔梗次生皂苷682和次生皂苷696的制备图，其中(a)为流动相B洗脱部分，(b)为流动相C洗脱部分，(c)为流动相D洗脱部分。
图6是桔梗次级皂苷682的纯度考察及结构确证图，其中(a)为桔梗次生皂苷682UPLC-Q/TOF考察结果，(b)为桔梗次生皂苷682核磁考察结果。
图7是桔梗次级皂苷696的纯度考察及结构确证图，其中(a)为桔梗次生皂苷696UPLC-Q/TOF考察结果，(b)为桔梗次生皂苷696核磁考察结果。
图8是桔梗次级皂苷改善的细胞膜通透性的效果考察图Ⅰ，其中(a)流式细胞仪检测的荧光细胞计数图，(b)为各组细胞内荧光强度变化的统计图。
图9是桔梗次级皂苷改善的细胞膜通透性的效果考察图Ⅱ，其中(a)为给药前后细胞内荧光变化的共聚焦成像图，(b)为各组细胞内荧光强度变化的统计图。
图10是桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696结构图。
具体实施方式
实施例1：桔梗总皂苷的分离制备
取桔梗饮片2.5公斤(购于西安天瑞生物技术有限公司，批号TR-170810)，加入10倍量的蒸馏水25升，加热回流提取2小时。趁热过滤，取滤液减压浓缩至约500毫升。冷却后加入无水乙醇至1500毫升，使其乙醇比例达到70％，混匀后静置过夜。过滤取上清，减压浓缩后得桔梗皂苷粗提物210克。取其中200克加入蒸馏水20升溶解，配置成1％的溶液，并上样于AB-8大孔吸附树脂(直径：5.5厘米；柱高：30厘米)，分别以不同浓度的乙醇溶液(0％→30％→70％→100％乙醇)梯度洗脱，每步分别用3倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液并采用HPLC检测其中皂苷的洗脱情况。
HPLC色谱条件：Phenomenex Luna C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流速1.0毫升/分钟；PDA检测器，检测波长210nm；样品进样量：20.0微升；柱温30℃；流动相：A为0.1％磷酸-水溶液，B为乙腈；二元梯度洗脱：0～10分钟，4％～23％B；10～15分钟，23％～28％B；15～30分钟，28％B；30～40分钟，28％～40％B；40～55分钟，40％～90％B；55～65分钟，90％B。
结果如图1所示，70％乙醇洗脱部分桔梗皂苷含量最高。因此收集70％乙醇洗脱部分，减压浓缩后得到桔梗总皂苷4.7克，收率约为0.94％。
实施例2：桔梗总皂苷的解析
桔梗皂苷主要为五环三萜类皂苷，其主要有桔梗皂苷元和桔梗酸类皂苷元。采用UPLC-Q/TOF解析实施例1的桔梗总皂苷发现其主要含有10种桔梗皂苷(见图2)。推测其入血的次生皂苷桔梗皂苷682和桔梗皂苷696，分别来源于上述桔梗皂苷元类皂苷和桔梗酸类皂苷成分的体内代谢产物。
UPLC-Q/TOF实验条件：
1)液相色谱条件：
色谱柱Waters ACQUITYBEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；流速0.4毫升/分钟；PDA检测器，检测波长210nm；样品进样量：5.0微升；柱温30℃；流动相：A为0.1％甲酸-水溶液，B为乙腈；二元梯度洗脱：0～2分钟，5％～15％B；2～18分钟，15％～35％B；18～23分钟，35％～55％B；23～27分钟，55％～100％B；27～29分钟，100％B；29～30分钟，100％～5％B；30～32分钟，5％B。
2)质谱条件：
离子源为软电离模式ESI电喷雾离子源，数据采集工作站为Waters MassLynx 4.1工作站。
在负离子模式下，毛细管电压2.5kV；离子源温度110℃；锥孔电压30V；雾化气高纯氮气的流速为600L/小时，雾化器温度设定为350℃；离子质量扫描范围50～1900Da，扫描频率0.1秒，扫描间隔延时0.02秒；校正液采用亮氨酸脑啡肽([M-H]-＝553.2775)。
UPLC-Q/TOF检测结果如图2(a)所示，经质谱m/z解析以及与标准品的MS/MS文献比对，共标注了10个主要成分，具体见表1。
表1.桔梗中主要化学成分的解析
实施例3：桔梗次生皂苷水解条件的考察
采用桔梗皂苷D(上海柏卡化学技术有限公司，批号：J-013-161216)作为反应底物(1毫克/毫升)，在85℃水浴中进行水解条件的考察。分别探讨酸(pH＝1)和碱(pH＝14)对水解效率的影响。并通过实施例1的HPLC法考察桔梗次级皂苷682和696的生成情况。结果如图3所示，碱水解的次生皂苷682的产率明显好于酸水解的效果，因此确定使用碱水解的方法优化下一步水解条件。
实施例4：桔梗次生皂苷水解条件的优化
利用软件Minitab17响应曲面试验优化碱水解条件，采用实施例1制备的桔梗总皂苷作为反应底物，进行水解条件的考察，综合考察pH值、温度和时间对水解效率的影响。并通过实施例1的HPLC法考察桔梗次级皂苷682和696的生成情况。
首先通过单因素试验确定pH、温度和时间三个因素的范围，再通过响应面实验确定最佳水解条件。具体响应曲面设计方案及试验结果见表2。
表2.响应曲面设计方案及试验结果
结果如图4所示，根据此中心点设计响应曲面试验，最终确定同时得到次生皂苷682和次生皂苷696的最优水解条件为：pH＝13.21，温度＝93.4℃，时间＝4.5小时。
实施例5：桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696的制备
按上述实施例4所述最优水解条件(pH13.21，温度93.4℃，4.5小时)，水解上述实施例1所得桔梗总皂苷5克。再采用浓盐酸酸化至pH 4-5，4℃静置过夜，析出沉淀。1000转离心，弃上清，收集沉淀，干燥，得1.6克桔梗次生苷粗粉。
采用中压制备液相色谱(Biotage Isolera One)，选用色谱柱Flash ColumnSilica-CS(80克)，采用等梯度洗脱体系分离桔梗次生皂苷。首先采用流动相A(二氯甲烷-甲醇-水＝7:1.5:0.15)洗脱杂质，充分平衡后，再采用流动相B(二氯甲烷-甲醇-水＝8:2:0.2)洗脱桔梗次生皂苷682。采用流动相C(二氯甲烷-甲醇-水＝9.8:2.8:0.3)平衡洗脱条件后，再采用流动相D(二氯甲烷-甲醇-水＝9.5:3:0.4)洗脱桔梗次生皂苷696。收集每步洗脱部分，采用实施例1的HPLC检测条件考察制备效果。
并通过实施例1的HPLC法考察桔梗次级皂苷682和696的分离效果。合并流动相B洗脱的次生皂苷682部分，减压浓缩后得桔梗次生皂苷682，128.5毫克，纯度在98％以上；合并流动相D洗脱的次生皂苷696部分，减压浓缩后得桔梗次生皂苷696，15.9毫克，纯度在98％以上(图5)。
实施例6：桔梗次生皂苷682化学式(I)的结构确证
分别采用UPLC-Q/TOF和核磁法鉴定实施例5中所制备的桔梗次生皂苷682。
UPLC-Q/TOF实验条件：
1)液相色谱条件：
色谱柱Waters ACQUITYBEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；流速0.35毫升/分钟；PAD检测器，检测波长210nm；样品进样量：5.0微升；柱温30℃；流动相：A为0.1％甲酸-水溶液，B为0.1％甲酸-乙腈；二元梯度洗脱：0～10分钟，5％～20％B；10～20分钟，20％～40％B；20～25分钟，40％～85％B；25～25.5分钟，85％～100％B；25.5～27分钟，100％B。
2)质谱条件：
离子源为软电离模式ESI电喷雾离子源，数据采集工作站为Waters MassLynx 4.1工作站。在正离子模式下，毛细管电压3.0kV；离子源温度110℃；锥孔电压30V；雾化气高纯氮气的流速为600L/小时，雾化器温度设定为350℃；离子质量扫描范围50～1900Da，扫描频率0.1秒，扫描间隔延时0.02秒；校正液为亮氨酸脑啡肽([M+H]+＝555.2931)。
桔梗次生皂苷682的检测结果如图6(a)所示，正离子模式下桔梗次生皂苷682的m/z为683，特征碎片为[M+H-glu]+521，[M+H]+683，[2M+H]+1365。
采用全数字核磁共振仪(Bruker 400M)进行核磁鉴定。核磁结果见图6(b)，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.48(s,1H),5.22(d,J＝3.9Hz,1H),4.97(s,2H),4.71(d,J＝4.5Hz,1H),4.53(dt,J＝18.4,5.1Hz,2H),4.32(s,1H),4.23(d,J＝7.7Hz,1H),4.11(s,1H),4.05–3.96(m,3H),3.80–3.61(m,3H),3.49–3.36(m,3H),3.15(d,J＝13.3Hz,4H),3.05(d,J＝8.0Hz,2H),2.88(dd,J＝14.3,4.5Hz,1H),2.21(t,J＝13.4Hz,1H),1.84(tdd,J＝28.1,10.0,5.9Hz,4H),1.72–1.45(m,5H),1.31(s,6H),1.17(d,J＝15.8Hz,5H),1.09–1.03(m,1H),0.96(dd,J＝12.4,4.4Hz,1H),0.90(s,3H),0.83(s,3H),0.67(s,3H).
13C NMR(1010MHz,DMSO-d6)δ178.7,122.0,104.7,77.3,77.2,74.2,73.4,70.6,62.0,61.5,47.8,47.1,47.0,46.8,44.7,41.7,36.8,35.6,35.0,33.4,33.1,31.9,30.7,26.9,24.6,23.5,18.6,17.7,17.3.
实施例7：桔梗次生皂苷696化学式(II)的结构确证
分别采用UPLC-Q/TOF法和核磁法鉴定实施例5中所制备的桔梗次生皂苷696。
具体实验条件见实施例6。UPLC-Q/TOF检测桔梗次生皂苷696结果如图7(a)所示。正离子模式下桔梗次生皂苷696的m/z为697，特征碎片为[M+H-glu]+535，[M+H]+697，[2M+H]+1393。
核磁结果见图7(b)，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.21(d,J＝3.7Hz,2H),5.04(s,2H)4.76(d,J＝18.1Hz,1H),4.33(s,2H),4.21(s,1H),3.79–3.61(m,4H),3.43(dd,J＝11.4,5.2Hz,5H),3.16(d,J＝7.8Hz,2H),3.04(pd,J＝8.9,3.7Hz,3H),2.88(dd,J＝14.1,4.5Hz,1H),2.21(t,J＝13.5Hz,1H),1.81(d,J＝32.0Hz,5H),1.73–1.54(m,3H),1.44(dd,J＝23.7,9.0Hz,3H),1.31(d,J＝6.8Hz,4H),1.23(s,1H),1.21–1.11(m,2H),1.06(d,J＝9.0Hz,4H),0.90(s,4H),0.83(s,3H),0.67(s,3H).
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ178.7167.5,121.8,104.8,77.3,77.2,74.3,73.4,70.5,68.7,61.5,55.5,48.1,47.7,46.7,41.6,36.3,35.6,33.4,30.7,26.9,24.6,17.4,15.3.
实施例8：桔梗次生皂苷改善的细胞膜通透性的考察I
采用流式细胞仪(BD，ACSVerse，美国)考察上述实施例5中所得桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696对细胞膜通透性的影响。取人肺上皮细胞(BEAS-2B)置于含有10％胎牛血清和1％双抗体(100U/毫升)的RPMI-1640培养基中，37℃，5％CO2条件下在6孔细胞培养板中进行培养。待细胞生长至80％至90％时，取出培养液，并用PBS洗涤两次。实验分别设为空白组、磺酰罗丹明B组和给药组；其中给药组分为4组，包括实施例1所制备的桔梗总皂苷组、桔梗皂苷D组、桔梗次生皂苷682组和桔梗次生皂苷696组。每组所用药物分别用细胞培养液配置成10微克/毫升的溶液，加药后孵育1.5小时后，采用流式细胞仪在488nm激发波长，575nm发射波长下，检测细胞内荧光强度的变化，每组平行3次。
结果显示如图8a所示，桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696所孵育的BEAS-2B细胞组，细胞平均荧光强度较磺酰罗丹明B组有明显升高，其中以桔梗次生皂苷682的提升效果更为明显；而经桔梗皂苷D或桔梗总皂苷组，其细胞平均荧光强度与磺酰罗丹明B组无明显差异(图8b)，(与空白组相比，*,p<0.05；**,p<0.01)。
实施例9：桔梗次生皂苷改善的细胞膜通透性的考察II
采用实施例5中所得桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696联合染料FITC，考察桔梗次生皂苷682及桔梗次生皂苷696对药物进入细胞的影响。
将BEAS-2B细胞置于共聚焦细胞培养皿中培养，具体细胞培养条件见实施例8。首先将FITC配成1×10-5摩尔/升的细胞培养液，分别加入不同的实验组中。实验分别设为空白组(正常培养液)、桔梗次生皂苷682组(5×10-4摩尔/升)和桔梗次生皂苷696组(5×10-4摩尔/升)。待加入FITC10分钟后，分别加入桔梗次生皂苷682和696。并立即在共聚焦显微镜下动态观察FITC进入细胞的状况。检测最大激发波长和最大发射波长分别为488nm和519nm。
结果如图9a所示，空白组的FITC几乎没有进入细胞。与空白组相比，图9a的桔梗次生皂苷682组和696组均在2分钟时对FITC进入细胞有明显的促进作用。每组随机选择10个细胞，使用ImageJ软件进行分析，统计细胞内外的荧光强度的变化。结果如图9b所示，与696组相比，682组的促进作用更为明显，(给药组/空白组，***,p<0.001；682组/696组,###,p<0.001)。
综上所述，本发明所获得的桔梗次生皂苷682和次生皂苷696(见图10)，可以有效改善细胞膜的通透性，辅助药物进入细胞，并提高药物的细胞递送程度，可用于辅助药物的递送。

Claims (9)

1.一种能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，以桔梗总皂苷为原料，通过碱水解获得桔梗次生皂苷，并利用中压制备液相色谱对其中的桔梗次生皂苷进行制备分离；所获得的桔梗次生皂苷能有效改善细胞膜的通透性，辅助药物进入细胞，能够用于药物递送。
2.根据权利要求1所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述桔梗总皂苷是以桔梗科植物Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的根为原料，采用水或乙醇为溶剂进行提取，并通过大孔树脂吸附解离所制备的桔梗总皂苷。
3.根据权利要求1所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述通过碱水解获得桔梗次生皂苷的方法的条件是，所述的碱为氢氧化钠，碱溶液的pH在pH12至pH14之间，碱水解的温度在80℃至100℃之间，碱水解的时间在1小时至5小时之间；优选条件为：pH＝13.2，温度93.4℃，时间4.5小时。
4.根据权利要求1所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述中压制备液相色谱限定在选用硅胶色谱柱的中压制备色谱的梯度洗脱体系；优选Flash Column Silica-CS色谱柱，洗脱体系为四个洗脱梯度，分别是流动相A：二氯甲烷-甲醇-水＝7:1.5:0.15；流动相B：二氯甲烷-甲醇-水＝8:2:0.2；流动相C：二氯甲烷-甲醇-水＝9.8:2.8:0.3；流动相D：二氯甲烷-甲醇-水＝9.5:3:0.4。
5.根据权利要求1所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述的桔梗次生皂苷为桔梗次生皂苷682和桔梗次生皂苷696。
6.根据权利要求5所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述的桔梗次生皂苷682为桔梗皂苷类化合物，其结构如化学式(I)所示：
7.根据权利要求5所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述的桔梗次生皂苷696为桔梗酸类化合物，其结构如化学式(II)所示：
8.根据权利要求4和5所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述的中压制备色谱的梯度洗脱体系中，桔梗次生皂苷682的洗脱体系限定为流动相B，即首先采用流动相A洗脱杂质，充分平衡后，采用流动相B洗脱桔梗次生皂苷682。
9.根据权利要求8所述的能改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷的制备方法，其特征在于，所述的中压制备色谱的梯度洗脱体系中，桔梗次生皂苷696的洗脱体系限定为流动相D，即采用流动相C平衡洗脱条件，充分平衡后，再采用流动相D洗脱桔梗次生皂苷696。
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