CN110023298A - 异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂 - Google Patents
异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了抑制α‑KG转化为D‑2‑HG的化合物,其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,以及包含所述化合物的药物组合物。所述化合物和所述药物组合物能够有效地治疗IDH相关的疾病,包括癌症。
Description
发明领域
本发明涉及化合物,所述化合物抑制α-酮戊二酸(α-KG)向2-羟基戊二酸(2-HG)(如D-2-HG)的转化;包含所述化合物作为活性成分的药物组合物;以及所述化合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗与α-KG向D-2-HG转化相关的疾病。
背景技术
异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸(TCA)循环中细胞呼吸的必需酶,其催化异柠檬酸的氧化脱羧,从而产生阿尔法-酮戊二酸(α-酮戊二酸,α-KG)和CO2。在人体中,IDH以三种亚型存在:IDH3催化柠檬酸循环的第三步,同时在线粒体中将NAD+转化为NADH。IDH1和IDH2亚型在柠檬酸循环环境以外催化相同反应,并使用NADP+代替NAD+作为辅因子。它们位于胞质溶质以及线粒体和过氧化物酶体中。
在多种脑肿瘤中发现了IDH1的特异性突变,包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤,在几乎所有由低级胶质瘤发展出来的继发性胶质母细胞瘤病例中都发现了突变,但在原发性高级多形性胶质母细胞瘤中很少发现突变。肿瘤具有IDH1突变的患者存活期较长[“An integrated genomic analysis of human glioblastomamultiforme”,Parsons,D.W.等人,Science,(2008);“Analysis of the IDH1codon132mutation in brain tumors”,Balss,J.等人,Acta Neuropathol,(2008);Bleeker,F.E.等人,“IDH1mutations at residue p.R132(IDH1(R132))occur frequently inhigh-grade gliomas but not in other solid tumors”,Hum Mutat,(2009)]。IDH1和IDH2的突变发生在p53突变和1p/19q染色体丢失之前,并被认为是胶质瘤发生的第一事件[“IDH1mutations are early events in the development of astrocytomas andoligodendrogliomas”,Watanabe,T.等人,Am J Pathol,(2009);“Mutational landscapeand clonal architecture in grade II and III gliomas”,Suzuki,H.等人,Nat Genet,(2015);“Comprehensive,Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-GradeGliomas”,Brat,D.J.等人,N Engl J Med,(2015)]。此外,在高达20%的细胞遗传学正常的急性髓性白血病(AML)中发现了IDH2和IDH1的突变[“Recurring mutations found bysequencing an acute myeloid leukemia genome”,Mardis,E.R.等人,N Engl J Med,(2009)]。根据一些独立的后续研究,在细胞遗传学正常的AML中IDH1和IDH2的突变率约为20%[“Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemiagenome”,Mardis,E.R.等人,N Engl J Med,(2009);“Prognostic impact ofIDH2mutations in cytogenetically normal acute myeloid leukemia”,Thol,F.等人,Blood,(2010);“Acquired mutations in the genes encoding IDH1and IDH2both arerecurrent aberrations in acute myeloid leukemia:prevalence and prognosticvalue”,Abbas,S.等人,Blood,(2010);“The prognostic significance ofIDH1mutations in younger adult patients with acute myeloid leukemia isdependent on FLT3/ITD status”,Green,C.L.等人,Blood,(2010);“IDH1mutations aredetected in 6.6%of 1414AML patients and are associated with intermediaterisk karyotype and unfavorable prognosis in adults younger than 60years andunmutated NPM1status”,Schnittger,S.等人,Blood,(2010);“Genomic and epigenomiclandscapes of adult de novo acute myeloid leukemia”,N Engl J Med,(2013)]。在其他类型的癌症中,包括在75%的软骨肉瘤[“IDH1and IDH2mutations are frequentevents in central chondrosarcoma and central and periosteal chondromas butnot in other mesenchymal tumours”,Amary,M.F.等人,J Pathol,(2011);“Ollierdisease and Maffucci syndrome are caused by somatic mosaic mutations ofIDH1and IDH2”,Amary,M.F.等人,Nat Genet,(2011)],10-23%的肝内胆管癌[“Frequentmutation of isocitrate dehydrogenase IDH1and IDH2in cholangiocarcinomaidentified through broad-based tumor genotyping”,Borger,D.R.等人,Oncologist,(2012);“Mutations in isocitrate dehydrogenase 1and 2occur frequently inintrahepatic cholangiocarcinomas and share hypermethylation targets withglioblastomas”,Wang,P.等人,Oncogene,(2012)],以及一些血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤和黑素瘤的患者[“The consensus coding sequences of human breast andcolorectal cancers”,Sjoblom,T.等人,Science,(2006)]中,也报道了IDH的突变。到目前为止,IDH1和IDH2是人类癌症中最常发生突变的代谢酶基因。
已知这些突变能进一步将α-KG转化为2-HG(例如D-2-HG)。D-2-HG会累积至非常高的浓度,从而抑制依赖于α-酮戊二酸的酶的功能。这会导致DNA和组蛋白的高甲基化状态,从而导致能激活癌基因以及使肿瘤抑制基因失活的各种基因表达。最终,这可能会导致上文公开的癌症类型[“The consensus coding sequences of human breast andcolorectal cancers”,Sjoblom,T.等人,Science,(2006)]。
因此,需要开发出一种抑制α-KG转化为D-2-HG的过程的抑制剂。
发明概述
在一个方面,本公开提供了一种式(I)所示的化合物:
或其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或立体异构体。
在另一个方面,本公开提供了一种用于制备式(I)所示化合物的方法。
在另一个方面,本公开还提供了一种药物组合物,其包含一种或多种式(I)所示的化合物,其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体。
在又一个方面,本公开提供了式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或本公开所述药物组合物在制备药物中的用途,所述药物用于治疗与α-KG向D-2-HG转化相关的疾病,例如癌症。
在又一个方面,本公开提供了一种抑制α-KG向D-2-HG转化的方法。
在另一个方面,本公开提供了用于治疗与α-KG向D-2-HG转化相关的疾病的方法,所述方法是通过使用式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体或本公开所述药物组合物进行的。
在另一个方面,本公开提供了一种抑制突变体IDH、野生型IDH或上述两者的方法,所述方法是通过使用式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体或本公开所述药物组合物进行的。
附图说明
图1表示由野生型和突变体IDH1/2催化而进行的反应。
图2A表示亲代HT1080细胞和过表达Flag标记的D-2-HG DH的稳定的HT1080中2-HG的细胞内水平通过GC-MS分析测得(修改自“‘D-2-hydroxyglutarate is essential formaintaining oncogenic property of mutant IDH-containing cancer cells butdispensable for cell growth’,Ma,S.等人,Oncotarget,(2015)”)。
图2B表示通过D-2-HG标准物进一步证实了2-HG峰,通过使用主碎片m/z 433进行定量。
图3表示对IDH1-R132H、IDH1-R132C和IDH1-WT蛋白中的每一个进行的考马斯染色。
图4A表示野生型IDH1相对于其1μg至3μg的蛋白质水平绘制的酶活性。
图4B表示IDH1 R132C相对于其25μg至150μg的蛋白质水平绘制的酶活性。
图5表示在用10μM的化合物1-16中的每一种和阴性对照(DMSO)处理后D-2-HG的浓度。
发明详述
化合物
在一个方面,本发明提供了式(I)所示的化合物:
以及其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或立体异构体,
其中,
X和Y独立地选自CH和N;
Z是键或羰基;
W是O、S或NRa;
A是直链或支链C1-6亚烷基;
Q是C6-12芳基、C6-12杂芳基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基;
R1是卤素、氰基、C1-12烷基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、C6-12芳氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基、-C(O)ORa、C6-12芳基烷氧基、-C(O)NRbRc、烷氧基烷基、杂环基烷基,上述基团可以任选地被下组中的一个或多个单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、叠氮基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基、-NHC(O)Rd;
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、C1-12烷基、C6-12芳基、C6-12芳基、C6-12芳基烷基,上述基团可以任选地被以下单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C5-10芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基;
任选地,Rb和Rc与它们所结合的氮原子一起形成4-至8-元杂环基,所述4-至8-元杂环基任选地包含一个或多个其他杂原子,所述其他杂原子选自N、S和O,
n是0至4的整数。
在一些实施方案中,X是N。
在一些实施方案中,Y是N。
在一些实施方案中,W是NRa。在一些实施方案中,W是NH。
在一些实施方案中,本公开的化合物由式(Ia)表示:
以及其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或立体异构体,
其中,
Z是键或羰基;
A是直链或支链C1-6亚烷基;
Q是C6-12芳基、C6-12杂芳基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基;
R1是卤素、氰基、C1-12烷基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、C6-12芳氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基、-C(O)ORa、C6-12芳基烷氧基、-C(O)NRbRc、烷氧基烷基、杂环基烷基,上述基团可以任选地被下组中的一个或多个单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、叠氮基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基、-NHC(O)Rd;
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、C1-12烷基、C6-12芳基、C6-12芳基、C6-12芳基烷基,上述基团可以任选地被以下单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C5-10芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基;
任选地,Rb和Rc与它们所结合的氮原子一起形成4-至8-元杂环基,所述4-至8-元杂环基任选地包含一个或多个其他杂原子,所述其他杂原子选自N、S和O,
n是0至4的整数。
在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的Ra是氢。
在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的A是支链C1-3亚烷基。在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的A是亚甲基、亚乙基或亚丙基。在一些实施方案中,A是1,1-亚乙基、1,2-亚乙基、1,1-亚丙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丙基或2,2-亚丙基。在一些实施方案中,A是1,1-亚乙基。
在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的Q是C6-12芳基或C6-12杂芳基。在一些实施方案中,Q是苯基。
在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的Z是键。在其他实施方案中,式(I)或式(Ia)中的Z是羰基。
在一些实施方案中,式(I)或式(Ia)中的R1选自下组:-C(O)OCH3、-OCH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CH=CH2、-CH2OCH2C≡CH、-CH2N3、-C(O)N(CH2CH3)2、
特别地,本公开所述式(I)或式(Ia)所示的化合物可以是如下化合物1-16:
为简洁起见,对于在单个实施方案的上下文中所公开的本公开的各种特征,也可以以单独的形式或者以任何合适的子组合的形式提供。
当用来指代化学基团时,本文使用的术语“取代的”是指所述化学基团具有一个或多个氢原子,所述一个或多个氢原子被除去并且被取代基取代。本文使用的术语“取代基”具有本领域已知的普通含义,是指与母体基团共价连接的或者在适当的条件下与其稠合的化学部分。本文使用的术语“任选地被取代的”是指所述化学基团可能不具有取代基(即未取代的)或者可能具有一个或多个取代基(即取代的)。应当理解,在给定原子处的取代受化合价的限制。
本文使用的术语“Ci-j”表示碳原子数的范围,其中i和j是整数,并且所述碳原子数的范围包括端点(即i和j)和其间的每个整数点,并且其中i∈{1、2、3、4、5、6、7、8、9或10},j大于i,j∈{2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40}。例如,C1-6表示1-6个碳原子的范围,包括一个碳原子、两个碳原子、三个碳原子、四个碳原子、五个碳原子和六个碳原子。
本文使用的术语“烷基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指饱和或不饱和的烃基基团,其可以是直链或支链。术语“Ci-j烷基”是指具有i至j个碳原子的烷基。在一些实施方案中,烷基基团含有1至12、1至8、1至6、1至4、1至3或1至2个碳原子。饱和的烷基基团的实例包括,但不限于,如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基的化学基团;如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等的高级同系物。不饱和烷基基团的实例包括,但不限于,如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、仲丁烯基、乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基等的化学基团。
本文使用的术语“烷氧基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指具有式-O-烷基的基团。术语“Ci-j烷氧基”是指烷氧基基团的烷基部分具有i至j个碳原子。在一些实施方案中,烷基部分具有1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个碳原子。烷氧基基团的实例包括,但不限于,甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如,正丙氧基和异丙氧基)、叔丁氧基等。
本文使用的术语“碳环基”是指任何环系,其中所有环原子都是碳并且其含有3至24个环碳原子、3至16个碳原子、3至8个碳原子以及4至8个碳原子。碳环基可以是芳族(芳基)或非芳族的。当碳环基是非芳族的时,它可以是饱和的或不饱和的。碳环基基团的实例包括单环、双环和三环环系。其他碳环基基团包括桥环系(例如双环[2,2,1]庚烯基)。
本文使用的术语“杂环基”是指这样的碳环基:其中一个或多个(例如1、2、3或4个)环原子被杂原子代替,所述杂原子包括,但不限于,氧、硫、氮、磷等。杂环基基团的具体实例是一个或多个环原子被杂原子代替的环烷基。含有一个杂原子的示例性杂环基基团包括吡咯烷、四氢呋喃和哌啶,含有两个杂原子的示例性杂环基基团包括吗啉和哌嗪,含有三个杂原子的示例性杂环基基团包括三唑基。杂环基基团的另一个具体实例是一个或多个环原子被杂原子代替的环烯基基团。
本文使用的术语“环烷基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指非芳族环状烃,包括环化的烷基和/或烯基基团。环烷基基团可以包括单环或多环(例如,具有2、3或4个稠环)基团和螺环。在一些实施方案中,所述环烷基是饱和环烷基。术语“i-j元环烷基”是指具有i至j个成环成员的环烷基。环烷基基团可以具有3、4、5、6、7、8个成环碳(C3-8)。环烷基基团的实例包括,但不限于,环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚三烯基等。在一些实施方案中,本文使用的环烷基可以与一个或多个芳环稠合(即,具有共同键),例如环戊烷、环己烷等的苯并或噻吩基衍生物。在一些实施方案中,含有稠合芳环的环烷基基团可以通过任何成环原子连接,所述成环原子包括所述稠合芳环的成环原子。
本文使用的术语“杂环烷基”是指环烷基基团,其中环系中的至少一个环原子是杂原子,并且其余环原子是碳原子。术语“i-j元杂环烷基”是指具有i至j个成环成员的杂环烷基。另外,所述环也可以具有一个或多个双键,但不具有完全共轭的系统。在一些实施方案中,杂环烷基是饱和的杂环烷基。杂原子的实例包括,但不限于,氧、硫、氮、磷等。在一些实施方案中,杂环烷基具有3至8、3至6、或4至6个成环碳。杂环烷基的实例包括,但不限于,氮杂环丁烷、氮丙啶、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。
本文使用的术语“芳基”或“芳族”,不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指在形成环的碳原子之间具有交替的双键和单键的单环或多环碳环环系基团。在一些实施方案中,所述芳基环系在一个或多个环中具有5至12、5至10、或5至8、6至12、6至10或6至8个碳原子。芳基基团的实例包括,但不限于,如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等的化学基团。
本文使用的术语“杂芳基”是指这样的芳基基团:其中芳香环中的至少一个环原子是杂原子,并且其余环原子是碳原子。术语“i-j元杂芳基”是指具有i至j个成环成员的杂芳基。杂原子的实例包括,但不限于,氧、硫、氮、磷等。在一些实施方案中,杂芳基可以具有5至10、5至8、或5至6个成环成员。在一些实施方案中,杂芳基是5元或6元杂芳基。杂芳基的实例包括,但不限于,呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吲哚基等。
在一些实施方案中,5元杂芳基可以是拥有具有五个环原子的环的杂芳基,其中一个或多个(例如,1、2或3个)环原子可以独立地选自N、O、P和S。示例性的5元杂芳基为噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基等。
在一些实施方案中,6元杂芳基可以是拥有具有六个环原子的环的杂芳基,其中一个或多个(例如,1、2或3个)环原子可以独立地选自N、O、P和S。示例性的6元杂芳基为吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基和哒嗪基。
本文使用的术语“芳烷基”或“芳基烷基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指具有式-烷基-芳基的基团。术语“Ci-j芳烷基”是指总碳数为i至j的芳烷基。在一些实施方案中,烷基部分具有1至6、1至4、1至3或1至2个碳原子。在一些实施方案中,所述芳烷基基团具有6-12、6-11、6-10、6-9、6-8或6-7个碳原子。芳烷基基团的实例包括,但不限于,各种-烷基-苯和-烷基-萘。
本文使用的术语“芳基烷氧基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指具有式-烷氧基-芳基的基团。术语“Ci-j芳基烷氧基”是指总碳数为i至j的芳基烷氧基。在一些实施方案中,烷氧基部分具有1至6、1至4、1至3或1至2个碳原子。在一些实施方案中,所述芳基烷氧基基团具有6-12、6-11、6-10、6-9、6-8或6-7个碳原子。芳基烷氧基基团的实例包括,但不限于,各种-烷氧基-苯和-烷氧基-萘。
本文使用的术语“亚烷基”不管是作为另一术语的一部分还是独立地使用,都是指二价烷基。亚烷基基团的实例包括,但不限于,亚甲基、1,1-亚乙基、1,2-亚乙基、1,1-亚丙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丙基、2,2-亚丙基等。
本文使用的术语“烯基”是指具有一个或多个双键的直链或支链烃链。术语“Ci-j烯基”是指总碳数为i至j的烯基。在一些实施方案中,所述烯基基团具有2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个碳原子。烯基基团的实例包括,但不限于,烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基、3-辛烯基等。任选地,双键碳中的其中一个可以是所述烯基取代基的连接点。
本文使用的术语“炔基”是指具有一个或多个三键的直链或支链烃链。术语“Ci-j炔基”是指总碳数为i至j的炔基。在一些实施方案中,所述炔基基团具有2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个碳原子。炔基基团的实例包括,但不限于,乙炔基、炔丙基、3-己炔基等。任选地,三键碳中的其中一个可以是所述炔基取代基的连接点。
本文使用的术语“芳基氧基”是指具有式-O-芳基的基团,其中芳基基团如先前公开所示。“Ci-j芳基氧基”是指芳基氧基基团的芳基部分具有i至j个碳原子。在一些实施方案中,芳基部分具有5至10、5至8或5至6个碳原子。
本文使用的术语“n元”,其中n是整数,通常与环系组合使用来描述所述环系中成环原子的数目。例如,哌啶基是6元杂环烷基环的实例,吡唑基是5元杂芳基环的实例,吡啶基是6元杂芳基环的实例,以及1,2,3,4-四氢-萘是10元环烷基基团的实例。
本文使用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
本文使用的术语“氰基”是指具有式-CN的基团。
本文使用的术语“羟基”是指具有式-OH的基团。
本文使用的术语“叠氮基”是指具有式-N3的基团。
本文使用的术语“化合物”旨在包括所示结构的所有立体异构体(例如,对映异构体和非对映异构体)、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另有说明,否则本文中通过名称或结构被鉴定为一种特定的互变异构形式的化合物应当包括其他互变异构形式。
本文公开的化合物可以是不对称的(例如,具有一个或多个立体中心)。除非另有说明,否则应当包括所有的立体异构体,例如对映异构体和非对映异构体。可以将含有不对称取代的碳原子的本公开的化合物分离成光学活性的或外消旋的形式。关于如何从光学惰性的起始材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的,例如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性的合成。在本文公开的化合物中也可以存在许多烯烃、碳-碳双键等的几何异构体,并且所有这些稳定的异构体都包括在本公开内容中。公开了本申请化合物的顺式和反式几何异构体,并且可以将其分离成异构体的混合物或分离的异构形式。
本文公开的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式包括质子性互变异构体,其是具有相同经验式和总电荷的异构质子化态。示例性的质子互变异构体包括酮-烯醇对,酰胺-亚胺酸对,内酰胺-内酰亚胺对,烯胺-亚胺对和质子可以占据杂环系的两个或更多个位置的环状形式,例如1H-和3H-咪唑,1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑,1H-和2H-异吲哚,以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式可以是平衡的或者通过适当的取代被空阻锁定成一个形式。
本文公开的化合物还可以包括存在于中间体或最终化合物中的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的原子。例如,氢的同位素包括氕、氘和氚。在一些实施方案中,所述氢的同位素是氕和氘。
本公开的化合物还可以用作药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或代谢物的形式。所述药学上可接受的盐包括无机酸和有机酸的碱金属盐,所述酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苹果酸、乙酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、马来酸、水杨酸、苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸。当本公开的化合物包含酸性官能团(如羧基)时,则本领域技术人员熟知合适的药学上可接受的羧酸阳离子,包括碱金属、碱土金属、铵、季铵阳离子。
除非另有说明,否则“IDH”或“野生型IDH”是指催化异柠檬酸向α-KG转化的正常的IDH酶。示例性的正常的IDH酶包括:
人IDH1蛋白(NCBI登记号:O75874.2,SEQ ID NO:1)
人IDH2蛋白(NCBI登记号:P48735.2,SEQ ID NO:2)
本文使用的术语“IDH的突变”是指IDH酶的任何突变,其使得“IDH突变体”、“突变体IDH”或“突变的IDH”能够催化α-KG转化为D-2-HG。在一些实施方案中,“突变体IDH”能催化α-KG向D-2-HG的转化以及异柠檬酸向α-KG的转化。这些突变包括但不限于IDH1中的R132H、R132C、R132G、R132L、R132S;或IDH2中的R172K、R172M、R172W。
在一些实施方案中,本公开的化合物抑制α-KG向D-2-HG的转化。在一些实施方案中,本公开的化合物抑制异柠檬酸向α-KG的转化。在一些实施方案中,本公开的化合物抑制α-KG向D-2-HG的转化以及异柠檬酸向α-KG的转化。在一些实施方案中,本公开的化合物可以选择性地抑制α-KG向D-2-HG的转化,但不抑制异柠檬酸向α-KG的转化。
在一些实施方案中,本公开的化合物抑制突变体IDH。在一些实施方案中,本公开的化合物抑制野生型IDH。在一些实施方案中,本公开的化合物抑制突变体IDH和野生型IDH。在一些实施方案中,本公开的化合物可以选择性地抑制突变体IDH但不抑制野生型IDH。
在一些实施方案中,本公开的化合物抑制野生型IDH和/或突变体IDH,IC50值为0.01-1000μM,优选0.01-500μM、0.01-100μM、0.01-80μM、0.01-50μM、0.01-40μM、0.01-30μM或0.01-20μM,更优选0.01-10μM、0.01-5μM或0.01-1μM。
本文使用的术语“选择性地抑制”是指化合物对野生型IDH的IC50至少比化合物对IDH突变体的IC50高2倍、3倍、4倍、5倍,优选10倍、20倍、30倍或50倍。
合成方法
在下面的一般合成方案中说明了本文所提供的化合物(包括其盐、酯、水合物或溶剂化物或立体异构体)的合成。本文所提供的化合物可以使用任何已知的有机合成技术制得,并且可以根据多种可能的合成途径中的任何一种合成,因此这些方案仅是说明性的,并不旨在限制可用于制备化合物的其他可能的方法。此外,方案中的步骤用于更好地说明,并且可以根据需要进行更改。实施例中化合物的实施方案是在中国合成的,用于研究目的并可能会提交给管理机构。
用于制备本公开化合物的反应可在合适的溶剂中进行,有机合成领域的技术人员可以方便地对这些溶剂进行选择。合适的溶剂可以在进行反应的温度(例如,从溶剂的冻结温度至溶剂的沸腾温度的温度)下基本上不与原料(反应物)、中间体或产物发生反应。可以在一种溶剂或超过一种溶剂的混合物中进行给定的反应。技术人员可以根据特定的反应步骤选择用于特定反应步骤的合适的溶剂。
本公开化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和去保护。本领域技术人员可以很容易地确定是否需要保护和去保护以及选择适当的保护基团。保护基团的化学性质可以在例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,3rdEd.,Wiley&Sons,Inc.,New York(1999)中找到,其通过引用并入本文。
可以根据本领域已知的任何合适方法来监测反应。例如,可以通过光谱手段,如核磁共振光谱(例如,1H或13C)、红外光谱、分光光度法(例如,UV-可见光)、质谱,或通过色谱方法,如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)或薄层色谱(TLC)法,来监测产物的形成。本领域技术人员可以通过多种方法纯化化合物,包括高效液相色谱法(HPLC)(“Preparative LC-MS Purification:Improved Compound Specific MethodOptimization”Karl F.Blom,Brian Glass,Richard Sparks,Andrew P.CombsJ.Combi.Chem.2004,6(6),874-883,其通过引用整体并入本文)和正相二氧化硅色谱法。
可以如方案1至2中所示合成式(Ia)的化合物。
方案1:式(Ia)的化合物的合成
步骤1:使化合物1001与化合物1002和TEA在二噁烷中反应,得到化合物1003,其中Q的定义如上所述。
步骤2:使THF中的化合物1003与水中的NaOH反应,得到化合物1004。
步骤3:使DMF中的化合物1004与化合物1005、HATU和DIPEA反应,得到目标化合物,其中R1的定义如上所述。
方案2:式(Ia)的化合物的合成
步骤1:使THF中的化合物1006与化合物1005和TEA反应,得到化合物1007,其中R1的定义如上所述。
步骤2:使二噁烷中的化合物1007与化合物1002和TEA反应,得到目标化合物,其中Q的定义如上所述。
药物组合物
本公开提供了药物组合物,所述药物组合物包含至少一种本文公开的化合物。在一些实施方案中,所述药物组合物包含超过一种本文公开的化合物。在一些实施方案中,所述药物组合物包含一种或多种本文公开的化合物,以及药学上可接受的运载体。
所述药学上可接受的运载体是本领域的常规药物运载体,其可以以药学领域熟知的方式制得。在一些实施方案中,本文公开的化合物可以与药学上可接受的运载体混合以用于制备药物组合物。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型:其在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而无过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症,与合理的利益/风险比相称。在一些实施方案中,药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型是指用于动物(更特别地,用于人)的由管理机构(例如美国食品和药物管理局、中国食品药品管理局或欧洲药品管理局)批准的或通常在公认的药典(例如美国药典、中国药典或欧洲药典)中列出的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文使用的术语“药学上可接受的运载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物,例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料,其涉及将本文提供的化合物从一个位置、体液、组织、器官(内部或外部)或身体的一部分携带或运输至另一个位置、体液、组织、器官或身体的一部分。药学上可接受的运载体可以是媒介物、稀释剂、赋形剂或可用于接触动物的组织而无过多毒性或副作用的其他材料。示例性的药学上可接受的运载体包括糖、淀粉、纤维素、麦芽、黄蓍胶、明胶、林格氏溶液、海藻酸、等渗盐水、缓冲剂等。可用于本公开的药学上可接受的运载体包括本领域通常已知的运载体,例如在“RemingtonPharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.,New Jersey(1991)中公开的运载体,该文章通过引入并入本文。
可用作药学上可接受的运载体的材料的一些实例包括:(1)糖,如乳糖,葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠,乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉末状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)滑石粉;(8)赋形剂,如可可脂和栓剂蜡;(9)油,如花生油,棉籽油,红花油,芝麻油,橄榄油,玉米油和豆油;(10)二醇,如丙二醇;(11)多元醇类,如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)醇,如乙醇和丙醇;(20)磷酸盐缓冲溶液;和(21)药物制剂中使用的其他无毒相容物质,如丙酮。
所述药物组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质,例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等,例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
药物组合物的形式取决于许多标准,包括,但不限于,施用途径、疾病程度或施用剂量。
所述药物组合物可以被配制成用于口服施用、鼻腔施用、直肠施用、经皮施用、静脉内施用或肌肉内施用。根据所需的施用途径,可以将所述药物组合物配制成以下形式:片剂、胶囊、丸剂、糖锭、粉末、颗粒、小袋剂、扁囊剂、锭剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(固体的形式或者在液体介质中)、喷雾、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、贴片、吸入剂或栓剂。
通过采用本领域已知的方法,可以将所述药物组合物配制成使得在施用给患者后能快速、持续或延迟释放活性成分。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制成持续释放形式。本文使用的术语“持续释放形式”是指从药物组合物中释放出活性剂,使得其能够在延长的时间段内(延长释放)或者在某个位点(控制释放)在受试者中(主要在所述受试者的胃肠道中)被生物吸收。在一些实施方案中,所述延长的时间段可以是约1小时至24小时、2小时至12小时、3小时至8小时、4小时至6小时、1至2天或更长。在某些实施方案中,所述延长的时间段为至少约4小时,至少约8小时,至少约12小时或至少约24小时。所述药物组合物可以配制成片剂的形式。例如,活性剂的释放速率不仅可以通过所述活性剂在胃肠液中的溶解并且随后以不依赖于pH的方式从片剂或药丸中扩散出来来进行控制,而且还会受所述片剂的崩解和侵蚀的物理过程的影响。在一些实施方案中,在以下文献中中所公开的聚合物材料可用于持续释放:“Medical Applications of Controlled Release,”Langer和Wise(编辑),CRC出版社,Boca Raton,Florida(1974);“Controlled Drug Bioavailability,”Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York(1984);Ranger和Peppas,1983,J Macromol.Sci.Rev.Macromol Chem.23:61;还有Levy等人,1985,Science 228:190;During等人,1989,Ann.Neurol.25:351;Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105。以上参考文献通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中,所述药物组合物包含约0.01mg至约1000mg的本文所提供的化合物(例如,约0.01mg至约10mg、约0.1mg至约10mg、约1mg至约10mg、约5mg至约10mg、约5mg至约20mg、约5mg至约30mg、约5mg至约40mg、约5mg至约50mg、约10mg至约100mg、约20mg至约100mg、约30mg至约100mg、约40mg至约100mg、约50mg至约100mg、约50mg至约200mg、约50mg至约300mg、约50mg至约400mg、约50mg至约500mg、约100mg至约200mg、约100mg至约300mg、约100mg至约400mg、约100mg至约500mg、约200mg至约500mg、约300mg至约500mg、约400mg至约500mg、约500mg至约1000mg、约600mg至约1000mg、约700mg至约1000mg、约800mg至约1000mg、或者约900mg至约1000mg)。每位受试者每天的合适剂量可以是约5mg至约500mg,优选地,约5mg至约50mg,约50mg至约100mg,或者约50mg至约500mg。
在某些实施方案中,可以将所述药物组合物配制成单位剂型,每剂含有以下量的本文公开的化合物:约0.01mg至约10mg、约0.1mg至约10mg、约1mg至约10mg、约5mg至约10mg、约5mg至约20mg、约5mg至约30mg、约5mg至约40mg、约5mg至约50mg、约10mg至约100mg、约20mg至约100mg、约30mg至约100mg、约40mg至约100mg、约50mg至约100mg、约50mg至约200mg、约50mg至约300mg、约50mg至约400mg、约50mg至约500mg、约100mg至约200mg、约100mg至约300mg、约100mg至约400mg、约100mg至约500mg、约200mg至约500mg、约300mg至约500mg、约400mg至约500mg、约500mg至约1000mg、约600mg至约1000mg、约700mg至约1000mg、约800mg至约1000mg、或约900mg至约1000mg。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位,其适合用作用于人受试者和其他哺乳动物的单位剂量,每个单位含有预定量的活性物质,所述预定量经过计算能与合适的药物运载体一起产生所需的治疗效果。
在一些实施方案中,所述药物组合物包含一种或多种本文公开的化合物作为第一活性成分,并且还包含第二活性成分。
在一些实施方案中,第二活性成分可以是本领域已知的其他IDH1或IDH2抑制剂。在一些实施方案中,第二活性剂是一种或多种其他IDH1或IDH2抑制剂,包括但不限于AG-120(Agios,Celgene)、AG-221(Agios,Celgene)、AG-881(Agios,Celgene)、IDH-305(Novatis)。
在一些实施方案中,所述第二活性成分可以是本领域已知的任何抗癌剂。用于治疗癌症或肿瘤的抗癌剂的代表性实例可以包括,但不限于,细胞信号转导抑制剂(例如,伊马替尼、吉非替尼、硼替佐米、厄洛替尼、索拉非尼、舒尼替尼、达沙替尼、伏立诺他、拉帕替尼、替西罗莫司、尼罗替尼、依维莫司、帕唑帕尼、曲妥珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、雷珠单抗、培加他尼、帕尼单抗等),有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇、长春新碱、长春碱等),烷化剂(例如顺铂、环磷酰胺、色氨酸、卡莫司汀等),抗代谢物(例如,甲氨蝶呤、5-FU等),嵌入(intercalating)抗癌剂(例如,放线菌素、蒽环霉素、博来霉素、丝裂霉素-C等),拓扑异构酶抑制剂(例如,伊立替康、托泊替康、替尼泊苷等),免疫治疗剂(例如,白细胞介素、干扰素等)和抗激素剂(例如他莫昔芬、雷洛昔芬等)。在一些实施方案中,所述第二活性剂是一种或多种抗癌剂,包括但不限于依鲁替尼、维奈妥拉(Venetoclax)、甲磺酸伊马替尼、盐酸尼洛替尼、博苏替尼、达沙替尼、依托泊苷、磷酸氟达拉滨、帕纳替尼、硫酸长春新碱、甲氨蝶呤、环磷酰胺、洛莫司汀、替尼泊苷、替莫唑胺、福莫司汀、卡莫司汀、贝伐单抗、Picibanil、氟尿嘧、美法仑(Melphalan)、盐酸吉西他滨。
在一些实施方案中,所述第二活性剂可以是一种或多种用于治疗神经胶质瘤的抗癌剂,包括但不限于贝伐单抗、替莫唑胺、盐酸尼莫司汀、丁硫氨酸磺胺亚胺、OlaptesedPegol、美耐华(Minerval)、吉马替康、抗新普拉通A10、INXN-2001(ZIOPHARM Oncology)、半胱胺亚硝脲(Cystemustine)、MK-8628(Mitsubishi Tanabe Pharma、Merck)、对甲苯磺酸宁格替尼(HEC Pharm)、KX2-361(Athenex、Xiangxue)。
治疗方法
本公开提供了一种治疗与IDH相关的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或者本文公开的药物组合物。
在一些实施方案中,所述一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或者本文公开的药物组合物,经由肠胃外途径或非肠胃外途径进行施用。在一些实施方案中,所述一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或者所述药物组合物,通过以下方式进行施用:口服施用、经口施用、口腔施用、经鼻施用、鼻内施用、经粘膜施用、表皮施用、透皮施用、皮肤施用、眼部施用、肺部施用、舌下施用、直肠施用、阴道施用、局部施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、鞘内施用、囊内施用、腹膜内施用、心内施用、皮内施用、腹膜内施用、经气管内施用、表皮下施用、关节内施用、囊下施用、蛛网膜下施用、脊柱内或胸骨内施用。
本文提供的化合物可以以纯的形式施用,与其他活性成分组合施用或以本公开的药物组合物的形式施用。在一些实施方案中,本文提供的化合物可以同时或依次与本领域已知的一种或多种抗癌剂组合施用于有需要的受试者。在一些实施方案中,所述施用以每天一次、一天两次、一天三次、或每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次进行。
在某些实施方案中,本公开提供了所述化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或者本公开的药物组合物在制备用于治疗与α-KG转化为D-2-HG相关的疾病的药物中的用途。在某些实施方案中,本公开提供了所述化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体,或者本公开的药物组合物在制备用于治疗与突变体IDH相关的疾病的药物中的用途。
在某些实施方案中,与α-KG转化为D-2-HG相关的疾病是与突变体IDH相关的疾病,包括癌症。
特别地,所述癌症包括但不限于,白血病、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、软骨肉瘤、胆管癌、骨肉瘤、淋巴瘤、肺癌、腺瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、肾上腺皮质癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、脑癌、食道癌、骨癌、睾丸癌、皮肤癌、肾癌、间皮瘤、神经母细胞瘤、甲状腺癌、头颈癌、食道癌、眼癌、前列腺癌、鼻咽癌或口腔癌。在一些实施方案中,所述癌症是白血病、胶质母细胞瘤或胆管癌。
本公开的化合物及其药物组合物可用于预防或治疗哺乳动物(尤其是人)中与α-KG转化为D-2-HG相关的任何疾病或病症的发作或发展。在一些实施方案中,本公开的化合物及其药物组合物可用于预防或治疗哺乳动物(尤其是人)中与突变体IDH相关的任何疾病或病症的发作或发展。
在这种情况下,本发明还提供了一种筛选适合用本公开的化合物或药物组合物单独地或与其他成分(例如第二活性成分,如其他IDH1或IDH2抑制剂、抗癌剂)组合治疗的患者的方法。所述方法包括对来自患者的肿瘤样品进行测序并检测所述患者中D-2-HG的积累或检测所述患者中IDH的突变状态。
实施例
下面进一步解释了本公开的一般方法。可以通过本领域已知的方法制备本公开的化合物。以下说明了本公开的优选的化合物的详细制备方法。然而,它们决不限制本公开化合物的制备方法。
合成实施例
以下实施例所示的化合物的结构通过核磁共振(NMR)或/和质谱(ESI)进行表征。NMR的位移(δ)以10-6(ppm)为单位给出。在Varian Mercury VX 400光谱仪上以四甲基硅烷(TMS)作为内标,在二甲基亚砜-d6(DMSO-d6)或CDCl3中记录了1H-NMR光谱。
使用Agilent 1260-6230TOF LC-MS质谱仪进行了ESI-HRMS的测量。
使用Phenomen C18柱(4.6mm*150mm,0.4μm)在Agilent 1200LC上进行了高效液相色谱(HPLC)的测量。
使用烟台黄海的HSGF254硅胶板进行了薄层色谱分析。用于薄层色谱分析(TLC)的硅胶板为0.15mm~0.2mm。用于通过TLC分离和纯化产物的硅胶板为0.4mm~0.5mm。
纯化的色谱柱以所述硅胶为运载体(200~300目,烟台黄海公司生产)。
本公开的已知起始材料可以通过使用或根据本领域已知的方法合成,或者可以从Alfa Aesar、Langcaster、TCI、Aldrich、Bepharm和Scochem购得。
除非另有说明,否则实施例中的反应均在氩气或氮气氛下进行。氩气或氮气氛是指反应烧瓶与体积约为1L的氩气或氮气球连接。氢化通常在真空下进行,充满氢气,并重复三次。除非另有说明,否则实施例中的反应温度为环境温度,即20℃~30℃。
通过TLC监测实施例中所示的反应进程。用于所述反应的洗脱液系统包括二氯甲烷-甲醇系统和石油醚-乙酸乙酯系统。根据化合物的不同极性调节溶剂的体积比。
用于纯化化合物的柱色谱洗脱系统以及TLC的洗脱系统包括二氯甲烷-甲醇系统和石油醚-乙酸乙酯系统。根据化合物的不同极性调节溶剂的体积比。可加入少量碱性或酸性试剂如三乙胺和乙酸用于调节。
合成实施例1
(2S,4R)-4-甲氧基-N-苯基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案1制备本公开的化合物1。具体地,根据方案3制备本公开的化合物1。
方案3
步骤1
(S)-2-((1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-甲酸甲酯
向2-氯嘧啶-4-甲酸甲酯(30.00g,173.84mmol)的二噁烷(300mL)溶液中加入TEA(26.39g,260.77mmol)和(S)-1-苯基乙胺(25.28g,208.61mmol)。加完后,将其在50℃加热4小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(200mL)中,用水(100mL x 2)和盐水(100mL)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=60:1洗脱)纯化粗产物,得到呈浅黄色固体状的所需产物(38.00g,产率85.0%)。
步骤2
(S)-2-((1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-甲酸
向(S)-2-((1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-甲酸甲酯(35.00g,136.03mmol)的THF(200mL)溶液中加入NaOH(13.60g,340.09mmol)的水(150mL)溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌5小时。TLC表明反应完成。浓缩混合物以去除大部分THF,用水(50mL)稀释,并通过加入2N HCl溶液酸化至pH 7。过滤收集所得沉淀物,用水(20mL)洗涤并在75℃下真空干燥,得到呈白色固体状的所需产物(23.00g,产率69.5%)。
步骤3
(2S,4R)-4-甲氧基-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
向(S)-2-((1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-甲酸(5.00g,20.55mmol)的DMF(50mL)溶液中加入(2S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-甲酸甲酯(3.60g,22.61mmol)、DIPEA(3.98g,30.83mmol)和HATU(10.16g,26.72mmol)。加完后,将其在环境温度下搅拌5小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(100mL)中,用水(60mL x 2)和盐水(60mL)洗涤。浓缩分离的有机层,并通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=40:1洗脱)纯化粗产物,得到呈白色固体状的所需产物(6.10g,产率77.2%)。
步骤4
(2S,4R)-4-甲氧基-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酸
向(2S,4R)-4-甲氧基-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(4.00g,10.41mmol)的THF(25mL)溶液中加入NaOH(1.04g,26.01mmol)的水(15mL)溶液。将反应混合物在环境温度下搅拌5小时。TLC表明反应完成。浓缩混合物以去除大部分THF,用水(10mL)稀释,并通过加入2N HCl溶液酸化至pH 7。过滤收集所得沉淀物,用水(10mL)洗涤并在75℃下真空干燥,得到呈白色固体状的所需产物(2.80g,产率72.7%)。
步骤5
(2S,4R)-4-甲氧基-N-苯基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺
向(2S,4R)-4-甲氧基-1-(2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酸(500mg,1.35mmol)的DMF(10mL)溶液中加入苯胺(151mg,1.62mmol)、DIPEA(262mg,2.02mmol)和HATU(667mg,1.76mmol)。加完后,将其在环境温度下搅拌10小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(20mL)中,用水(15mL x 2)和盐水(15mL)洗涤。浓缩分离的有机层,通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=30:1洗脱)纯化粗产物,得到呈白色固体状的化合物1(261mg,产率43.4%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.52~7.40(m,4H),7.29(s,1H),7.28~7.10(m,4H),7.07~7.6.99(m,2H),5.01-4.95(m,1H),4.50~4.37(m,2H),4.29~4.21(m,1H),3.61(br,1H),3.28~3.16(m,1H),2.39-2.31(m,2H),1.98~1.91(m,2H),1.55(d,J=6.8Hz,3H)。ESI-MS m/z 446.2[M+H]。
合成实施例2
(S)-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
通常,根据方案1制备本公开的化合物2。合成方法与合成实施例1类似,不同之处在于步骤3中的(2S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-甲酸甲酯被(S)-吡咯烷-2-甲酸甲酯代替,并且步骤4和5被去除。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H),7.47~7.39(m,4H),7.22(m,1H),7.15~7.04(m,2H),5.01-4.95(m,1H),4.56~4.41(m,2H),4.39~4.28(m,1H),3.38(s,3H),3.28~3.16(m,2H),1.97~1.85(m,4H),1.47(d,J=6.5Hz,3H)。ESI-MS m/z 355.2[M+H]。
合成实施例3
(2S,4R)-4-(苄氧基)-N-苯基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案1制备本公开的化合物3。合成方法与合成实施例1类似,不同之处在于步骤3中的(2S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-甲酸甲酯被(2S,4R)-4-苄氧基吡咯烷-2-甲酸甲酯代替。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.52~7.45(m,4H),7.39(s,1H),7.33~7.19(m,8H),7.17~7.10(m,2H),5.01-4.95(m,1H),4.50~4.37(m,2H),4.29~4.21(m,1H),4.01(s,2H),3.28~3.16(m,2H),2.39-2.31(m,1H),2.09~1.99(m,2H),1.51(d,J=6.9Hz,3H)。ESI-MS m/z522.2[M+H]。
合成实施例4
((2S,4R)-4-甲氧基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-基)(吗啉代)甲酮
通常,根据方案1制备本公开的化合物4。合成方法与合成实施例1类似,不同之处在于步骤5中的苯胺被吗啉代替。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H),7.36(m,1H),7.28~7.10(m,4H),7.08-6.99(m,1H),5.01-4.95(m,1H),4.50~4.37(m,2H),4.29~4.21(m,1H),3.62-3.44(m,10H),2.39-2.31(m,1H),1.98~1.91(m,2H),1.51(d,J=6.8Hz,3H)。ESI-MS m/z 440.2[M+H]。
合成实施例5
(2S,4R)-N,N-二乙基-4-甲氧基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案1制备本公开的化合物5。合成方法与合成实施例1类似,不同之处在于步骤5中的苯胺被二乙胺代替。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.42~7.31(m,4H),7.07~7.6.99(m,2H),5.01-4.95(m,1H),4.50~4.37(m,2H),4.29~4.21(m,1H),3.61(br,1H),3.58(s,3H),3.28~3.16(m,2H),2.39-2.31(m,1H),1.98~1.91(m,4H),1.51~1.42(m,3H),1.21(t,J=7.0Hz,3H),1.09(t,J=7.0Hz,3H)。ESI-MS m/z 426.2[M+H]。
合成实施例6
(R)-N-苄基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-羰基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案1制备本公开的化合物6。合成方法与合成实施例1类似,不同之处在于步骤3中的(2S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-2-甲酸甲酯被(S)-吡咯烷-2-甲酸甲酯代替,并且步骤5中的苯胺被苄胺代替。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),7.52~7.40(m,4H),7.29(s,1H),7.28~7.10(m,4H),7.07~7.6.99(m,2H),5.01-4.95(m,1H),4.50~4.37(m,2H),4.29~4.21(m,1H),3.61(br,1H),3.28~3.16(m,2H),2.39-2.31(m,1H),1.98~1.91(m,4H),1.51~1.42(m,3H)。ESI-MS m/z430.2[M+H]。
合成实施例7
4-((S)-2-((4-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物7。具体地,根据方案4制备本公开的化合物7。
方案4
步骤1
(S)-1-(2-氯嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
在0℃下,向2,4-二氯嘧啶(50.00g,335.62mmol)的THF(500mL)溶液中加入TEA(84.90g,839.05mmol)和(S)-吡咯烷-2-甲酸甲酯盐酸盐(61.14g,369.18mmol)。加完后,使反应混合物逐渐达到环境温度并搅拌10小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(300mL)中,用水(200mL x 2)和盐水(200mL)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩,得到呈棕色固体状的所需产物(75.00,产率92.5%),将其不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤2
(S)-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-yl)吡咯烷-2-甲酸甲酯
向(S)-1-(2-氯嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(75.00g,310.34mmol)的二噁烷(500mL)溶液中加入TEA(47.10g,465.50mmol)和(R)-1-苯基乙胺(45.13g,372.40mmol)。加完后,将其在60℃加热6小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(400mL)中,用水(200mL x 2)和盐水(200mL)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=40:1洗脱)纯化粗产物,得到呈浅黄色固体状的所需产物(62.50g,产率61.7%)。
步骤3
((S)-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)甲醇
将(S)-1-(2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(20.00g,61.28mmol)溶于THF(300mL)中。将其冷却至0-5℃并加入NaBH4(2.78g,73.53mmol)和LiCl(3.12g,73.53mmol)。然后,将EtOH(200mL)缓慢加入反应混合物中。加完后,使其达到环境温度并搅拌5小时。TLC表明反应完成。通过加入1N HCl溶液至pH 3使其淬灭并再搅拌0.5小时。将反应混合物真空浓缩以去除溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯(200mL)和水(150mL)中,通过加入2N NaOH溶液碱化至pH 9-10。将分离的有机层用水(100mL x 2)和盐水(100mL)洗涤,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=30:1洗脱)纯化粗产物,得到呈白色固体状的所需产物(12.30g,产率67.3%)。
步骤4
4-甲基苯磺酸((S)-1-(2-(((S)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)甲酯
在0-5℃下,向((S)-1-(2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)甲醇(12.00g,40.22mmol)的DCM(120mL)溶液中加入吡啶(20mL)和TsCl(9.20g,48.26mmol)。加完后,将其在环境温度下搅拌12小时。TLC表明反应完成。将溶液用水(50mL x 2)、10%柠檬酸溶液(50mL x 2)和盐水(50mL x 2)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩,得到呈黄色固体状的所需产物(16.30g,产率89.6%),将其不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤5
4-((S)-2-(叠氮基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
向4-甲基苯磺酸((S)-1-(2-(((R)-1-苯基乙基)氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)甲酯(3.00g,6.63mmol)的DMSO(25mL)溶液中加入NaN3(560mg,8.62mmol)。加完后,将其加热至70℃并保持3小时。TLC表明反应完成。将混合物冷却至环境温度并用乙酸乙酯(70mL)稀释,用水(50mL x 3)和盐水(50mL x 2)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=50:1洗脱)纯化粗产物,得到呈白色固体状的所需产物(1.60g,产率74.6%)。
步骤6
4-((S)-2-((4-苯基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
向4-((S)-2-(叠氮基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺(500mg,1.55mmol)在混合溶液(甲苯(8mL),t-BuOH(2mL))中的溶液中加入苯基乙炔(189mg,1.86mmol)、CuI(15mg,79μmol)和DIPEA(400mg,3.09mmol)。将混合物在环境温度下搅拌10小时。TLC表明反应完成。通过真空浓缩去除溶剂,将残余物溶于乙酸乙酯(30mL)中,用水(20mL x 2)和盐水(20mL)洗涤。将分离的有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱法(用DCM:MeOH=40:1洗脱)纯化粗产物,得到呈白色固体状的所需产物(312mg,产率47.4%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(s,1H),7.69(d,J=7.5Hz,2H),7.53(s,1H),7.35(t,J=7.4Hz,2H),7.31-7.23(m,5H),7.19(s,2H),5.39(s,1H),4.95(s,1H),4.55(s,3H),4.38(s,1H),2.97(d,J=30.6Hz,2H),2.01-1.75(m,5H),1.48(d,J=6.6Hz,3H)。ESI-MS m/z426.2[M+H]。
合成实施例8
(S)-N,N-二乙基-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物8。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于去除步骤3-6,并且在步骤1和2之后,根据合成实施例1的步骤4和5进行接下来的两个步骤,其中合成实施例1的步骤5中的苯胺被二乙胺代替。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(s,1H),7.60(d,J=5.3Hz,1H),7.46-7.32(m,4H),7.31-7.19(m,1H),5.49(s,1H),5.21-4.82(m,1H),4.49(s,1H),4.32(s,1H),3.44-3.25(m,6H),2.36-2.25(m,1H),2.01-1.88(m,2H),1.79-1.68(m,1H),1.41(d,J=6.3Hz,3H),1.24(t,J=7.0Hz,3H),1.09(t,J=7.0Hz,3H)。ESI-MS m/z 368.2[M+H]。
合成实施例9
(S)-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-甲酸甲酯
通常,根据方案2制备本公开的化合物9。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于去除步骤3-6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J=5.5Hz,1H),7.42-7.25(m,5H),5.67(d,J=5.5Hz,1H),5.08(br,1H),4.07(s,1H),3.56(d,J=12.2Hz,1H),3.46-3.31(m,2H),3.23(s,3H),2.21-2.09(m,4H),1.53(d,J=6.5Hz,3H)。ESI-MS m/z 327.2[M+H]。
合成实施例10
(S)-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-基)-N-(吡啶-3-基)吡咯烷-2-甲酰胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物10。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于去除步骤3-6,并且在步骤1和2之后,根据合成实施例1的步骤4和5进行接下来的两个步骤,其中合成实施例1的步骤5中的苯胺被3-氨基吡啶代替。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.71(s,1H),8.58(s,1H),8.50(s,1H),8.33-8.30(m,1H),7.71(d,J=5.3Hz,1H),7.43-7.11(m,5H),7.00(s,1H),5.31-5.28(m,1H),4.86~4.88(m,1H),4.07(s,1H),3.34~3.38(m,1H),2.61~2.65(m,1H),2.01-1.74(m,4H),1.37(d,J=6.9Hz,3H)。ESI-MS m/z 389.2[M+H]。
合成实施例11
4-((S)-2-(烯丙氧基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物11。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于步骤5中的NaN3被烯丙醇代替并且去除步骤6。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.71(d,J=5.3Hz,1H),7.43-7.11(m,7H),7.00(s,1H),5.81-5.69(m,2H),5.331-5.28(m,2H),4.98(s,1H),3.97(s,3H),2.01-1.74(m,5H),1.37(d,J=6.7Hz,3H)。ESI-MS m/z 339.2[M+H]。
合成实施例12
4-((S)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物12。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于步骤5中的NaN3被甲醇代替并且去除步骤6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J=5.7Hz,1H),7.30(d,J=7.4Hz,2H),7.24(t,J=7.2Hz,2H),7.15(dd,J=17.2,10.0Hz,1H),5.60(s,1H),5.20(s,1H),5.11-4.95(m,1H),4.04(s,1H),3.55(s,1H),3.39-3.21(m,6H),2.04-1.72(m,4H),1.45(d,J=6.7Hz,3H)。ESI-MS m/z 313.2[M+H]。
合成实施例13
N-((S)-1-苯基乙基)-4-((S)-2-((丙-2-炔基氧基)甲基)吡咯烷-1-基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物13。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于步骤5中的NaN3被3-羟基丙炔代替并且去除步骤6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J=5.9Hz,1H),7.44-7.16(m,5H),5.68(s,1H),5.21-5.02(m,1H),4.25-4.06(m,3H),3.82(s,1H),3.41(d,J=8.5Hz,2H),2.40(s,1H),2.30-2.09(m,6H),1.52(d,J=6.8Hz,3H)。ESI-MS m/z 337.2[M+H]。
合成实施例14
4-((S)-2-(叠氮基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物14。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于去除步骤6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J=5.8Hz,1H),7.42-7.18(m,5H),5.67(d,J=5.9Hz,1H),5.04(s,1H),4.07(s,1H),3.56(d,J=12.2Hz,1H),3.49-3.34(m,2H),3.23(s,1H),2.19-2.01(m,5H),1.53(d,J=6.5Hz,3H)。ESI-MS m/z 324.2[M+H]。
合成实施例15
4-((S)-2-(苄氧基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-苯基乙基)嘧啶-2-胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物15。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于步骤5中的NaN3被苄醇代替并且去除步骤6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J=5.7Hz,1H),7.42-7.17(m,9H),7.13(t,J=6.9Hz,1H),5.58(d,J=4.5Hz,1H),5.21(s,1H),4.94(s,1H),4.47(s,2H),4.05(dd,J=13.8,6.6Hz,1H),3.66(s,1H),3.22(d,J=62.7Hz,3H),1.92(dt,J=61.4,21.0Hz,4H),1.42(d,J=6.7Hz,3H)。ESI-MS m/z 389.2[M+H]。
合成实施例16
N-(((S)-1-(2-((S)-1-苯基乙基氨基)嘧啶-4-基)吡咯烷-2-基)甲基)苯甲酰胺
通常,根据方案2制备本公开的化合物16。合成方法与合成实施例7类似,不同之处在于步骤5中的NaN3被苯甲酰胺代替并且去除步骤6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J=5.7Hz,1H),7.67(d,J=7.7Hz,3H),7.48-7.15(m,8H),5.74(s,1H),5.33(s,1H),4.77(s,1H),4.29(d,J=12.5Hz,1H),3.46(dd,J=23.9,15.0Hz,2H),3.22(s,1H),2.07(d,J=25.6Hz,4H),1.85(d,J=14.4Hz,2H),1.26(t,J=7.3Hz,3H)。ESI-MS m/z 402.2[M+H]。
生物学评估
试验1:野生型和突变体IDH蛋白的纯化
IDH1蛋白的纯化
本公开提供了在大肠杆菌中纯化突变体和野生型重组IDH1蛋白的方法。
将含有野生型或突变体人IDH1cDNA序列的pSJ3质粒转化到BL21菌株中。在5ml LB培养基中将单个菌落在37℃培养过夜。随后将该5ml起始培养物在2L LB培养基中扩增直至培养物密度达到OD600为0.5-0.6。用0.5mM IPTG在20℃过夜诱导蛋白质的表达。通过离心收集细胞并将细胞重悬于补充有蛋白酶抑制剂PMSF的TBS缓冲液(50mM Tris pH7.5,150mMNaCl)中。通过超声处理制备细胞裂解物并通过离心去除沉淀。将上清液上样到镍琼脂糖凝胶(Ni Separose 4B)(购自GE Lifescience)柱中。用含30mM咪唑的TBS溶液洗涤柱子,并用含300mM咪唑的TBS溶液洗脱IDH蛋白质。通过Amicon 3,000Da MWCO过滤装置过滤出咪唑。在-80℃下将蛋白质储存在含有10%甘油的TBS溶液中。通过使用来自生工生物工程(上海)股份有限公司的Bradford试剂盒完成对蛋白质浓度的定量。
IDH2蛋白的纯化
鉴于其N-末端的线粒体靶向信号,IDH2蛋白是不溶的,不能从大肠杆菌中纯化得到。本公开提供了一种通过利用昆虫细胞中的杆状病毒来表达和纯化IDH2蛋白的新方法。也可以使用同样的技术表达和纯化类似于IDH1(R132)突变体的人IDH2(R172K或R172S)突变体。
另一种纯化IDH2蛋白的方法是使用人293-F悬浮细胞建立稳定的细胞来表达野生型和突变体IDH2,然后进行亲和及离子交换纯化。
试验2:化合物对IDH的抑制和选择性的生物化学测定
本公开提供了一种生化测定方法,用于通过直接检测IDH的酶活性来检测化合物对于IDH的抑制和选择性。
图1显示了由野生型和突变体IDH1/2催化的反应。野生型IDH酶在催化产生α-KG的反应时可将NADP+转化为NADPH。突变体IDH酶在催化产生D-2-HG的反应时可将NADPH转化为NADP+。NADPH是发荧光的(激发340nm,发射460nm),但NADP+不是。通过监测NADPH荧光的变化来测定野生型或突变体IDH的催化反应速率。通过监测NADPH的荧光,快速(仅3-5分钟)有效地测定酶活性。化合物的IC50可以仅通过5-10个反应来测定。
用于检测野生型IDH的反应混合物的配方是:50mM Tris-HCl pH7.5,40μM异柠檬酸,20μM NADP+,2mM MnCl2和100nM重组IDH野生型蛋白。用于检测突变体IDH的反应混合物的配方是:50mM Tris-HCl pH7.5,0.5mMα-KG,40μM NADPH,2mM MnCl2和500nM重组IDH突变蛋白。每个样品孔使用300μl缓冲液,将化合物稀释至不同浓度,并在样品孔中加入1μl的各种浓度的每种化合物,并用Hitachi F-1000荧光光谱仪监测吸收。绘制在不同浓度的每种化合物存在下IDH的相对活性,并计算每种化合物的IC50。
试验3:针对化合物对IDH的抑制作用和选择性的基于细胞的测定法
本公开还提供了一种基于细胞的方法,用于测定化合物在人纤维瘤细胞系HT1080和胆管癌细胞系HCCC 9810中对IDH的抑制和选择性,所述HT1080和HCCC 9810分别含有内源杂合的IDH1 R132C和R132H突变并积累有D-2-HG。肿瘤来源的IDH突变体失去了产生α-KG的正常活性,并获得了产生D-2-HG的新活性。D-2-HG是在IDH突变的肿瘤样品中特异性升高的代谢物。其在正常组织中的浓度可忽略不计,并且在正常组织中不具有任何已知的生理功能。因为突变体IDH1和IDH2获得了在正常细胞中不具有功能的新的催化活性,因此突变体IDH酶的抑制剂应该会有效抑制表达突变体IDH的肿瘤细胞的生长,但不影响正常细胞的生长。因此,该方法可用于筛选对具有突变体IDH的细胞具有高特异性并且对正常细胞具有低毒性的化合物。
通过用有效的IDH抑制剂处理HT1080和HCCC 9810细胞,阻断了D-2-HG的合成,并且通过由D-2-HG脱氢酶催化的氧化反应而降低了D-2-HG的浓度。因此,本公开的化合物对IDH的抑制活性和选择性可以通过细胞代谢物中D-2-HG的减少来测得。
为了进行基于细胞的IDH抑制剂测定,在补充有10%FBS的DMEM中培养HT1080和HCCC 9810细胞(或带有不同的IDH突变的其他细胞系)。用各种不同浓度的本公开的化合物处理细胞。在处理后的各个时间点(4-24小时),除去细胞培养上清液,用PBS洗涤细胞一次或两次。通过以下步骤提取细胞代谢物:向细胞中加入80%的甲醇(在-80℃下预冷却过),在室温下提取5min,离心除去任何不溶性组分。将代谢物(来自前一步骤的澄清上清液)冻干并在含有20%MTBSTFA(N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺,Sigma Aldrich)的吡啶中重构,并且通过在70℃下加热衍生30分钟。通过Agilent7890A-5750GC/MS系统分析衍生出的代谢物(包括D-2-HG)。将1μl衍生出的代谢物注入Agilent 7890A-5750中进行D-2-HG浓度的分析。GC柱箱的温度设定为从140℃至260℃(10℃/min),从260℃至310℃(8℃/min),并在310℃保持5min。载气的流速为1ml/min。质谱仪以70eV的电子轰击(EI)模式进行操作。将D-2-HG对内源性谷氨酸进行基准化。
不同化合物浓度条件下的IDH的酶活性以此化合物浓度条件下的D-2-HG水平与阴性对照条件下的D-2-HG水平相比的相对值表示,然后据此计算化合物的IC50值和评估化合物的抑制性和选择性。
试验4:针对化合物对IDH的抑制作用和选择性的改进的基于细胞的测定法
本公开还提供了针对化合物对IDH的抑制作用和选择性的改进的基于细胞的测定法,所述方法涉及在HT1080和HCCC9810细胞中稳定地过表达D-2-HG脱氢酶。
根据先前的报道,D-2-HG脱氢酶的过表达会降低HT1080细胞中D-2-HG的半衰期(图2A和2B)[“D-2-hydroxyglutarate is essential for maintaining oncogenicproperty of mutant IDH-containing cancer cells but dispensable for cellgrowth”,Ma,S.等人,Oncotarget,(2015)],从而使得细胞更敏感于突变体IDH1抑制剂对D-2-HG合成的阻断。这会大大提升这种基于细胞的测定法的灵敏度和准确性。在改进的基于细胞的测定法中,所有其他步骤如试验3中所公开的那样进行。
试验5:对IDH突变细胞的非贴壁依赖性生长的抑制
众所周知,非贴壁依赖性细胞生长是癌细胞的基本性质。非贴壁依赖性生长的能力与体内肿瘤细胞的致瘤和转移潜能紧密相关。
先前的工作显示,HT1080中突变体IDH1的缺失对正常培养条件下的细胞增殖影响不大,但会强烈抑制具有IDH1 R132C突变的HT1080细胞系的非贴壁依赖性生长[“D-2-hydroxyglutarate is essential for maintaining oncogenic property of mutantIDH-containing cancer cells but dispensable for cell growth”,Ma,S.等人,Oncotarget,(2015)]。突变体IDH1的缺失也消除了HT1080细胞中D-2-HG的产生。在本公开中,非贴壁依赖性生长(在软琼脂中形成细胞集落)也被用作方便且有用的体外测定法,用于测定化合物在肿瘤抑制中的活性。
使用本公开的化合物来处理IDH-突变的癌细胞系,如含有IDH1 R132C的HT1080和含有IDH1 R132H的HCCC9810,并测试这些化合物是否会影响软琼脂中的细胞生长。将化合物加入到软琼脂以及软琼脂上方的培养基中,化合物的浓度高于由试验2和3中的结果计算得到的每种化合物的IC50值。通过显微镜观察集落形成。在实验结束时,将软琼脂平板用结晶紫染色,从而看到细胞集落以进行定量。在软琼脂测定法中证实,IDH1的抑制能阻碍非贴壁依赖性生长,这为测定突变体IDH抑制剂在肿瘤抑制中的活性提供了有用、有效且方便的测定法。该测定法特别有用,因为对突变体IDH1的抑制不影响正常培养条件下HT 1080细胞的生长。
试验6:在患者来源的异种移植模型中对IDH突变体肿瘤生长的抑制作用
先前的工作通过异种移植实验表明,抑制突变体IDH1 R132C可以阻碍HT1080的肿瘤生长[“D-2-hydroxyglutarate is essential for maintaining oncogenic propertyof mutant IDH-containing cancer cells but dispensable for cell growth”,Ma,S.等人,Oncotarget,(2015)]。在本文中使用患者来源的异种移植小鼠(PDX)模型作为方便且有用的体内测定法,用于测定化合物在肿瘤抑制中的活性。作为初步实验,已经从具有IDH1的R132H突变的Bt142神经胶质瘤的脑干细胞系建立了IDH1突变的神经胶质瘤PDX模型[“Anin vivo patient-derived model of endogenous IDH1-mutant glioma”,Luchman,H.A.等人,Neuro Oncol,(2012)]。该小鼠模型用于测试本公开的化合物在抑制具有IDH1 R132H突变的神经胶质瘤中的功效。本公开的化合物在异种移植模型中抑制了带有IDH1 R132H突变的肿瘤的生长。
工作实施例
实施例1:IDH1 WT/R132H/R132C蛋白的纯化
将pSJ3-IDH1-R132H、pSJ3-IDH1-R132C和pSJ3-IDH1-WT质粒分别转化到BL21菌株中。根据生物学评价部分的试验1中所公开的方法诱导和纯化IDH1 WT/R132H/R132C蛋白。通过Bradford测定法确定了每种纯化蛋白质的浓度。图3显示了IDH1-R132H、IDH1-R132C和IDH1-WT蛋白中每一种的考马斯染色,其证明了蛋白质的成功表达和纯化。
实施例2:化合物抑制IDH1 R132C的活性
根据生物学评估部分的试验2中公开的配方制备反应混合物。首先,将纯化的野生型或R132C突变体IDH1蛋白加入反应混合物中,然后通过Hitachi F-1000荧光光谱仪监测反应混合物。根据图4A和图4B,野生型和R132C突变体IDH1的酶活性分别与其1μg至3μg和10μg至150μg的蛋白质水平成比例。
对于化合物评估,每个样品孔使用300μl反应混合物,并通过添加6μg纯化的重组IDH1 R132C蛋白(或1μg纯化的IDH1 WT蛋白)和任选的各种浓度的化合物1-16中的一种而开始反应,将纯化的蛋白质和稀释的化合物的总体积控制为小于3μl。将每个样品梯度1:1稀释成5至10个浓度,将每个浓度设定在单个孔中。半数最大抑制浓度(IC50)表示用于抑制一半IDH酶活性的所需化合物浓度。通过生物学评估部分的试验2中公开的方法计算IC50值,结果显示在表1中。
表1:化合物1-20对IDH突变体的IC50值
传统的化疗通常对患者具有总体的非特异性和毒性作用。在本实施例中测试的化合物显示在靶向突变体IDH方面具有比靶向野生型IDH更高的特异性。这种更高的特异性使得能够使用相对低剂量的化合物,以避免因对内源性野生型酶的抑制而引起的副作用。因此,靶向突变体IDH使得在药物设计和加工方面具有了灵活性。
实施例3:化合物抑制了IDH1 R132C产生D-2-HG的活性
在35mm平板中培养HT1080细胞,并用化合物1-16中的每一种以10μM处理12h,并根据生物学评估部分的试验3中所公开的方法分析D-2-HG的浓度。图5显示了在用一些化合物处理后的D-2-HG的浓度。
实施例4:化合物抑制了IDH突变癌细胞的非贴壁依赖性生长
将HT1080或HCCC9810细胞培养在35mm平板中并在指数生长期收获,并根据生物学评估部分试验5中的描述将其用于软琼脂中。本公开的化合物能抑制IDH-突变的癌细胞的非贴壁依赖性生长。
实施例5:化合物抑制了PDX模型中IDH突变的肿瘤的生长
根据生物学评价部分的试验6中的描述进行了动物试验。本公开的化合物能抑制PDX模型中带有IDH1 R132C或IDH1 R132H突变的肿瘤的生长。
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Claims (14)
1.一种式I所示的化合物:
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或溶剂化物,
其中,
X和Y独立地选自CH和N;
Z是键或羰基;
W是O、S或NRa;
A是直链或支链C1-6亚烷基;
Q是C6-12芳基、C6-12杂芳基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基;
R1是卤素、氰基、C1-12烷基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、C6-12芳氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基、-C(O)ORa、C6-12芳基烷氧基、-C(O)NRbRc、烷氧基烷基、杂环基烷基,上述基团可以任选地被下组中的一个或多个单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、叠氮基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基、-NHC(O)Rd;
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、C1-12烷基、C6-12芳基、C6-12芳基、C6-12芳基烷基,上述基团可以任选地被以下单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C5-10芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基;
任选地,Rb和Rc与它们所结合的氮原子一起形成4-至8-元杂环基,所述4-至8-元杂环基任选地包含一个或多个其他杂原子,所述其他杂原子选自N、S和O,
n是0至4的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物,其中所述化合物具有式(Ia)所示的化学结构:
或其药学上可接受的盐、酯、水合物或溶剂化物,
其中,
Z是键或羰基;
A是直链或支链C1-6亚烷基;
Q是C6-12芳基、C6-12杂芳基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基;
R1是卤素、氰基、C1-12烷基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、C6-12芳氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元饱和或不饱和杂环烷基、-C(O)ORa、C6-12芳基烷氧基、-C(O)NRbRc、烷氧基烷基、杂环基烷基,上述基团可以任选地被下组中的一个或多个单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、叠氮基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C6-12芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基、-NHC(O)Rd;
Ra、Rb、Rc和Rd独立地选自氢、C1-12烷基、C6-12芳基、C6-12芳基、C6-12芳基烷基,上述基团可以任选地被以下单取代或者独立地多取代:卤素、羟基、氰基、C1-12烷基、C2-12链烯基、C2-12炔基、C5-10芳基、C1-12烷氧基、3-10元饱和或不饱和环烷基、3-10元杂环烷基、或3-10元杂芳基、C5-10芳氧基;
任选地,Rb和Rc与它们所结合的氮原子一起形成4-至8-元杂环基,所述4-至8-元杂环基任选地包含一个或多个其他杂原子,所述其他杂原子选自N、S和O,
n是0至4的整数。
3.根据权利要求1或2所述的化合物,其中Ra是氢。
4.根据权利要求1或2所述的化合物,其中A是支链C1-3亚烷基。
5.根据权利要求1或2所述的化合物,其中Q是C6-12芳基或C6-12杂芳基。
6.根据权利要求5所述的化合物,其中Q是苯基。
7.根据权利要求1或2所述的化合物,其中Z是键。
8.根据权利要求1或2所述的化合物,其中Z是羰基。
9.根据权利要求1或2所述的化合物,其中R1选自下组:-C(O)OCH3、-OCH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CH=CH2、-CH2OCH2C≡CH、-CH2N3、-C(O)N(CH2CH3)2、
10.根据权利要求1所述的化合物,其选自下组:
11.一种药物组合物,其包含根据前述权利要求中任一项所述的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体作为第一活性成分,以及药学上可接受的运载体。
12.一种治疗疾病的方法,其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体或根据权利要求11所述的药物组合物,其中所述疾病是与α-KG转变为D-2-HG相关的疾病,优选癌症。
13.一种抑制α-KG转化为D-2-HG的方法,所述方法是通过使用根据权利要求1至10中任一项所述的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体或根据权利要求11所述的药物组合物进行的。
14.一种抑制突变体IDH、野生型IDH或上述两者的方法,所述方法是通过使用根据权利要求1至10中任一项所述的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体或根据权利要求11所述的药物组合物进行的。
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