CN109991355B - 一种鉴定动物体内nab代谢产物的方法和评价nab在动物体内暴露风险的方法 - Google Patents

一种鉴定动物体内nab代谢产物的方法和评价nab在动物体内暴露风险的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法和评价NAB在动物体内暴露风险的方法。评价NAB暴露风险的方法包括：1)将动物血液样品进行离心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均匀后静置，得到混合样品；2)将混合样品进行离心，取上清液，固液分离，将所得液体进行超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测；3)将分子量测量值与NAB的代谢产物的理论分子量相比对，依据比对结果，鉴定动物体内NAB的代谢产物；4)计算NAB及其代谢产物的AUC值，根据AUC值计算α‑羟基化系数，预测NAB对动物体的暴露风险。该方法可以为NAB在动物体内的代谢规律研究提供有效支撑，进而为评价NAB的潜在暴露风险提供量化指标。

Description

一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法和评价NAB在动物体内 暴露风险的方法
技术领域
本发明属于动物体内烟草特有亚硝胺的代谢分析领域，具体涉及一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法和评价NAB在动物体内暴露风险的方法。
背景技术
烟草中的一些有害成分，特别是具有致癌作用的烟草特有亚硝胺(TSNAs)，一直是吸烟与健康问题研究的热点。TSNAs是一类仅存在于烟草及烟气中的氮亚硝胺类化合物，是在烟草调制和发酵过程中由烟草生物碱通过亚硝化作用而形成的。目前已鉴别出8种TSNAs，研究者关注较多的是含量较高的4种常见的亚硝胺，即N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和4-(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)。TSNAs属于器官特异性致癌物质，可诱导实验动物产生多种癌症。目前认为，TSNAs的致癌作用是通过在生物体内的代谢活化而产生，因此研究TSNAs在生物体内的代谢历程显得尤为必要。
由于NNN和NNK的致癌性最强，被国际癌症研究中心(IARC)列为Ⅰ类人体致癌物质，与肺癌、胰腺癌、食道癌等癌症的发生有关，因此相关的研究较多，而且二者的代谢途径也较为清楚。NNN和NNK在生物体内主要通过三条途径进行代谢，其中NNK的代谢途径有羰基还原、吡啶-N-氧化和α-羟基化，NNN的代谢途径则为吡啶-N-氧化，吡啶环的羟基化和去甲基可替宁的形成。虽然NAB与NNK或NNN相比，具有相对较弱的毒性，但是在小鼠试验中发现，NAB和NNN对肺癌有相同的诱导作用。NAB总剂量达到100μmol时，饲喂30周后有90％的小鼠发现肿瘤，而对照组只有27％(Amin S,Desai D,Hecht S S,Hoffmann D.Synthesis oftobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of relatedbioassays[J].Critical reviews in toxicology,1996,26(2):139-147.)。然而，目前对NAB的代谢产物尚不清楚，在人体在尿液中，NAB的主要代谢物仅鉴定出有NAB-N-氧化物和NAB的吡啶-N-葡萄糖苷酸。因此，通过合适的手段对NAB的代谢途径进行鉴定分析对于研究NAB的毒性机理具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，以解决现有方法不能确定动物体内NAB的代谢产物的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种评价NAB在动物体内暴露风险的方法，以解决现有方法不能对NAB的暴露风险进行有效评价的问题。
为实现上述目的，本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法所采用的技术方案是：
一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，包括以下步骤：
1)将动物血液样品进行离心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均匀后静置，得到混合样品；
2)将混合样品进行离心，取上清液，固液分离，将所得液体进行超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测；
3)将步骤2)检测得到的分子量测量值与NAB的代谢产物的理论分子量相比对，依据比对结果，鉴定动物体内NAB的代谢产物；所述NAB的代谢产物为NAB-N-oxide，5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸。
本发明提供的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，利用超高效液相色谱-高分辨率质谱对动物血液样品中的NAB代谢物进行检测，通过检测得到的精确质量数与NAB代谢产物的理论分子量进行比对，实验表明，测量值与理论值的误差小于1.0ppm，相应的NAB的代谢产物的确认结果具有极高的可信度。利用该方法可方便鉴定出动物血液内存在3种NAB代谢物，该结果可以为NAB在动物体内的代谢规律研究提供有效支撑。
可以根据NAB在人体尿液中的代谢鉴定结果对NAB的代谢物进行预测。NAB和NNN的结构极其相似(图1)，唯一的不同是NAB吡啶环上相连的基团是个六元环，而NNN为五元环，结构的不同可能是导致NAB毒性较弱的主要原因。本发明中，基于其结构的同源性，可以根据NNN的代谢途径来推测NAB的代谢产物。NNN的代谢途径有吡啶氮氧化途径、2’-羟基化途径及6’-羟基化途径，相应的NAB的代谢产物为NAB-N-oxide，5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸。
为进一步实现NAB在动物体内代谢变化的示踪监测，优选的，步骤1)中，所述动物血液样品为使用NAB及其吡啶环氘代的同位素标记物NAB-pyridine-d4同步暴露动物后收集得到的暴露动物血液样品。
通过NAB及其代谢物的精确质量数检测与比对工作，可获得NAB及其代谢物的基本分子量信息，为进一步确定NAB及其代谢产物的信息，步骤3)中，提取NAB、NAB-pyridine-d4及其代谢物的母离子色谱峰，并进行质谱二级子离子质量信息比对，利用目标物与对应的氘代目标物的色谱保留时间一致和相应的二级子离子质量信息的一一对应，确证NAB的代谢产物。进一步的，该方案克服了放射性同位素标记法检测时灵敏度不高、放射性信号易丢失等缺点，利用了色谱保留信号成对出现和质谱分子质量信息具有高分辨率的双重技术优点，具有分析结果准确、可靠等先进性，可以为示踪鉴定NAB在动物体内的代谢途径提供有效支撑。
为进一步提高超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的色谱分析过程的灵敏度和分辨率，优选的，所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的色谱条件为：色谱柱：Waters Atlantis HILIC silica column；柱温：25℃；进样量5μL，流速0.5mL/min；流动相A：10mmol/mL甲酸铵溶液，B：乙腈；洗脱梯度：0-2min内B由95％下降至85％，2-6min内由85％降至75％，于0.1min内升至95％，维持2min。
为进一步提高超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的质谱分析过程的分辨率和可靠性，优选的，所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的质谱条件为：电加热喷雾离子源(HESI)，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS2，一级全扫描分辨率为70000，范围为100-250m/z，自动增益控制(AGC)为1e6，离子最大注入时间(Maximum inject time)为50ms；二级扫描为数据依赖扫描(Data dependent)，分辨率为17500，AGC为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量(NCE)为35％。
为最大程度降低对NAB的代谢产物的影响，提高检测结果的准确性，优选的，步骤1)中，所述静置在冰浴中进行，静置的时间为20-40min。
为避免离心过程对NAB的代谢产物产生不良影响，提高检测结果的准确性，优选的，步骤2)中，所述离心的温度为1-6℃。
本发明的评价NAB在动物体内暴露风险的方法所采用的技术方案是：
一种评价NAB在动物体内暴露风险的方法，包括以下步骤：
1)将NAB暴露动物血液样品进行离心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均匀后静置，得到混合样品；
2)将混合样品进行离心，取上清液，固液分离，将所得液体进行超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测；
3)将步骤2)检测得到的分子量测量值与NAB的α-羟基化代谢产物的理论分子量相比对，依据比对结果，鉴定动物体内NAB的α-羟基化代谢产物；所述NAB的α-羟基化代谢产物为5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸；
4)根据不同暴露时间下NAB及其α-羟基化代谢产物的浓度，绘制NAB及其α-羟基化代谢产物的浓度-时间曲线，计算曲线下面积AUC值，以α-羟基化代谢产物的AUC之和除以NAB的AUC计算α-羟基化系数；根据α-羟基化系数评价NAB的暴露风险。
本发明提供的评价NAB在动物体内暴露风险的方法，在获得NAB及其代谢物的入体循环相对量的基础上，分别根据血液中α-羟基化代谢途径产物总量与进入体循环的NAB相对量的比值(α-羟基化系数)来评估NAB暴露后的代谢活化风险程度，其可对NAB的暴露风险作出有效评价。
附图说明
图1为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中NNN和NAB的化学结构对比图；
图2为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中NNN(x＝2)和NAB(x＝3)的吡啶氮氧化和α-羟基化途径示意图；
图3为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中NAB及其氘代物的色谱图；
图4为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中NAB及其氘代物的质谱图；
图5为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中吡啶基戊醇酸(HPBAA)及其氘代物的色谱图；
图6为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中吡啶基戊醇酸(HPBAA)及其氘代物的质谱图；
图7为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中吡啶基戊酮酸(OPBAA)及其氘代物的色谱图；
图8为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中吡啶基戊酮酸(OPBAA)及其氘代物的质谱图；
图9为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中NAB-N-oxide及其氘代物的色谱图；
图10为本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1中小鼠暴露15min后血液中NAB-N-oxide及其氘代物的质谱图；
图11为本发明的评价NAB在动物体内暴露风险的方法实施例1的小鼠血液中NAB的浓度-时间变化曲线图；
图12为本发明的评价NAB在动物体内暴露风险的方法实施例1的小鼠血液中OPBAA的浓度-时间变化曲线图；
图13为本发明的评价NAB在动物体内暴露风险的方法实施例1的小鼠血液中HPBAA的浓度-时间变化曲线图。
具体实施方式
本发明主要是利用N-亚硝基假木贼碱(NAB)及其吡啶环氘代的稳定同位素标记物同步暴露实验动物，利用超高效液相色谱-高分辨率质谱对动物血液样品中的NAB代谢物进行示踪分析，根据NAB代谢物及其氘代标记物色谱保留时间一致的特点和质谱提供的精确分子量信息，从而鉴定NAB的代谢产物进而揭示其在动物体内的代谢转化特征。同时，该方法还能准确地进行定量分析获得NAB及其α-羟基化代谢产物含量的变化趋势，进而利用α-羟基化系数来评估NAB暴露后的代谢活化程度，具有灵敏度高、分析结果准确可靠等特点。
在制备NAB暴露动物血液样品时，可以采用外周注射方式暴露动物，暴露一定时间后，收集动物静脉血即为NAB暴露动物血液样品。
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。以下实施例中，“％”如无特殊说明，均为体积百分数。
本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法的实施例1，以SPF级雌性6-8周龄C57BL/6小鼠(体重18-22g)为研究动物，采用独立隔离饲养笼具饲养，自由进水，标准颗粒进食，具体采用以下步骤：
1)小鼠空腹12小时后，腹腔注射NAB和NAB-pyridine-d4混合溶液(NAB-pyridine-d4的剂量为3.0mg/kg，NAB的剂量为6.0mg/kg，生理盐水配制)，于不同时间点，对小鼠进行摘眼球取血，取血0.5mL，置于1.5mL抗凝血管中，立即在4℃下以2000g离心15min；取100μL上清血清至1.5mL离心管内，加入200μL乙腈，涡旋混匀后于冰浴中静置30min，在4℃下以15000g离心15min，取上清液，用0.22μm针式过滤器过滤后上样UHPLC-Q Exactive检测。
UHPLC-Q Exactive检测的色谱条件为：
色谱柱：Waters Atlantis HILIC silica column(3.0mm i.d.×100mm,3.0μm)；柱温：25℃；进样量5μL，流速0.5mL/min；流动相A：10mmol/mL甲酸铵溶液，B:乙腈；洗脱梯度：0-2min内B由95％线性下降至85％，2-6min内由85％线性下降至75％，于0.1min内线性上升至95％，维持2min。
质谱条件为：
离子源：电加热喷雾离子源(HESI)，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS2，一级全扫描分辨率为70000，范围为100-250m/z，自动增益控制(AGC)为1e6，离子最大注入时间(Maximum inject time)为50ms；二级扫描为数据依赖扫描(Data dependent)，分辨率为17500，AGC为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量(NCE)为35％。
2)由于NAB和NNN结构的相似性(如图1所示)，依据NNN的代谢途径推测的NAB可能代谢物(如图2所示)，分别为吡啶氮氧化途径产物NAB-N-oxide，2’-羟基化途径产物5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸(吡啶基戊酮酸，OPBAA)和6’-羟基化途径产物5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸(吡啶基戊醇酸，HPBAA)。
由于市场上缺少三种化合物标准品，无法采用标准品对此三种代谢产物进行对比确证。实施例中，轨道阱高分辨质谱可以获得NAB和NAB-d4及其三种代谢物的精确质量数以及主要碎片离子的质荷比(如表1所示)，其测量值与三种化合物的理论分子量理论值相比误差小于1.0ppm，具有极高的可信度，且NAB和NAB-d4的碎片离子与文献报道一致(Hu AF,Jiang J,Zhou G J,Yang J,Xiao W Q,Xu J.Characteristic fragmentation behaviorof tobacco-specific N-nitrosamines using electrospray ionization multistagetandem mass spectrometry incorporating deuterium labeling[J].Rapidcommunications in mass spectrometry:RCM,2014,28(15):1658-1664)。
表1目标物的质谱定性参数
Figure BDA0002026515020000071
进一步的，在NAB和NAB-d4及其代谢物对应的色谱图和质谱图中，目标物与对应的吡啶环氘代目标物保留时间一一对应，而且二级碎片也一一对应(如图3-图10所示)，可以确认NAB-N-oxide、吡啶基戊酮酸和吡啶基戊醇酸为NAB的三种代谢产物；基于该三种代谢产物可以对图2所示的N-亚硝基假木贼碱的代谢途径进行确认。
本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法的实施例2，与鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1基本相同，区别仅在于，步骤1)中，静置的时间为20min，离心的温度为2℃。
本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法的实施例3，与鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1基本相同，区别仅在于，步骤1)中，静置的时间为40min，离心的温度为6℃。
在本发明的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法的其他实施例中，可以采用被动吸烟方式暴露动物并获得相应的血液样品，或者直接对未知血液样品进行检测，来鉴定动物体内是否存在NAB代谢产物，并将该鉴定结果应用于药代动力学分析、暴露风险等评价过程。
本发明的评价NAB在动物体内暴露风险的方法实施例1，采用以下步骤：
步骤1)-步骤2)与鉴定动物体内NAB代谢产物的方法实施例1相同；
步骤3)：由于市场上缺乏OPBAA和HPBAA标准品，利用结构类似物OPBA和HPBA代替进行外标法定量。配制NAB、OPBA、HPBA的混合标准溶液(0.1、0.25、0.5、1.0、5、10、50、100、500ng/mL)进行定量分析，获得线性方程及线性范围后，对NAB暴露后5、15、30、60、120、240和360min不同时间点小鼠血液中的NAB、OPBAA、HPBAA含量进行分析并绘制浓度-时间变化曲线(图11-图13)并计算AUC(表2)，根据公式(1)计算NAB在小鼠体内的α-羟基化系数(HR)。公式(1)：HRNAB＝(AUCHPBAA+AUCOPBAA)/AUCNAB。
表2小鼠血液中NAB及各目标物的AUC平均值
Figure BDA0002026515020000081
表3 NAB在小鼠体内的α-羟基化代谢指标(n＝5；*,p<0.05)
Figure BDA0002026515020000082
由表3的结果可知，B组小鼠血液中的HR值显著大于A组小鼠，说明NAB在B组小鼠体内更倾向于向α-羟基化代谢途径转化。B组小鼠体内的α-羟基化反应程度更高，预示着NAB暴露后的潜在致癌风险更大，为NAB早期暴露风险评估提供了可量化比较的参考指标。

Claims (6)

1.一种鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将动物血液样品进行离心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均匀后静置，得到混合样品；
2)将混合样品进行离心，取上清液，固液分离，将所得液体进行超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测；
所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的色谱条件为：色谱柱：WatersAtlantis HILIC silica column；柱温：25℃；进样量5μL，流速0.5mL/min；流动相A：10mmol/mL甲酸铵溶液，B：乙腈；洗脱梯度：0-2min内B由95％下降至85％，2-6min内由85％降至75％，于0.1min内升至95％，维持2min；
所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的质谱条件为：电加热喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS2，一级全扫描分辨率为70000，范围为100-250m/z，自动增益控制为1e6，离子最大注入时间为50ms；二级扫描为数据依赖扫描，分辨率为17500，自动增益控制为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量为35％；
3)将步骤2)检测得到的分子量测量值与NAB的代谢产物的理论分子量相比对，依据比对结果，鉴定动物体内NAB的代谢产物；所述NAB的代谢产物为NAB-N-氧化物，5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸。
2.如权利要求1所述的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，其特征在于，步骤1)中，所述动物血液样品为使用NAB及其吡啶环氘代的同位素标记物NAB-pyridine-d4同步暴露动物后收集得到的暴露动物血液样品。
3.如权利要求1或2所述的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，其特征在于，步骤3)中，提取NAB、NAB-pyridine-d4及其代谢物的母离子色谱峰，并进行质谱二级子离子质量信息比对，利用目标物与对应的氘代目标物的色谱保留时间一致和相应的二级子离子质量信息的一一对应，确证NAB的代谢产物。
4.如权利要求1所述的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，其特征在于，步骤1)中，所述静置在冰浴中进行，静置的时间为20-40min。
5.如权利要求1所述的鉴定动物体内NAB代谢产物的方法，其特征在于，步骤2)中，所述离心的温度为1-6℃。
6.一种评价NAB在动物体内暴露风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将NAB暴露动物血液样品进行离心，取上清液，向上清液中加入乙腈混合均匀后静置，得到混合样品；
2)将混合样品进行离心，取上清液，固液分离，将所得液体进行超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测；
所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的色谱条件为：色谱柱：WatersAtlantis HILIC silica column；柱温：25℃；进样量5μL，流速0.5mL/min；流动相A：10mmol/mL甲酸铵溶液，B：乙腈；洗脱梯度：0-2min内B由95％下降至85％，2-6min内由85％降至75％，于0.1min内升至95％，维持2min；
所述超高效液相色谱串联轨道阱高分辨质谱检测的质谱条件为：电加热喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压3.5kV；鞘气流速为9.9L/min，辅助气流速为3.3L/min，毛细管加热温度为320℃，加热器温度为300℃；扫描模式采用Full MS/ddMS2，一级全扫描分辨率为70000，范围为100-250m/z，自动增益控制为1e6，离子最大注入时间为50ms；二级扫描为数据依赖扫描，分辨率为17500，自动增益控制为1e5，最大注入时间为50ms，归一化的碰撞能量为35％；
3)将步骤2)检测得到的分子量测量值与NAB的α-羟基化代谢产物的理论分子量相比对，依据比对结果，鉴定动物体内NAB的α-羟基化代谢产物；所述NAB的α-羟基化代谢产物为5-羰基-5-(3-吡啶基)-戊酸和5-羟基-5-(3-吡啶基)-戊酸；
4)根据不同暴露时间下NAB及其α-羟基化代谢产物的浓度，绘制NAB及其α-羟基化代谢产物的浓度-时间曲线，计算曲线下面积AUC值，以α-羟基化代谢产物的AUC之和除以NAB的AUC计算α-羟基化系数；根据α-羟基化系数评价NAB的暴露风险。
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