CN109988867B - 用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，属于生物医学检测技术领域，试剂盒包括反应液、引物溶液、酶液、阴性质控品、阳性质控品、杂交显色液、杂交膜条和干燥剂，杂交膜条上附着有探针，杂交显色液包含连接有第二显色标记物的微球，微球富集后显色。本发明检测试剂盒覆盖了24种CAP常见的呼吸道病原体，其具有特异性高、灵敏度高、检测靶点多、操作简便快速等优点。

Description

用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒。

背景技术

目前感染性疾病的发病率和病死率一直居高不下，其中呼吸道感染居各类感染性疾病之首。社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)是指在医院外罹患的感染性肺实质(含肺泡壁，即广义上的肺间质)炎症，包括具有明确潜伏期的病原体感染在入院后于潜伏期内发病的肺炎。在全球范围内，CAP是严重威胁人类健康最常见的呼吸道感染性疾病之一，传播范围广、发病率高和病死率高，据国外CAP监测网数据显示，成人CAP患者的30d病死率为8.6％，门诊及住院患者的病死率分别为0.8％和12.2％，ICU中重症CAP患者的30d病死率达23％～47％，其病死率与患者病情严重程度极其相关。

根据中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)的CAP临床诊断标准，其相关的临床表现包括有：(1)社区发病；(2)新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴脓痰、胸痛、呼吸困难及咯血；(3)发热；(4)肺实变体征和(或)闻及湿性啰音；(5)外周血白细胞＞10×10⁹/L或＜4×10⁹/L，伴或不伴细胞核左移；(6)胸部影像学检查显示新出现的斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。符合上述(1)、(6)及(2)(3)(4)(5)中任何一项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症及肺血管炎等后，可建立临床诊断。重症CAP的临床诊断标准：符合下列1项主要标准或≥3项次要标准者可诊断为重症肺炎。主要标准：(1)需要气管插管行机械通气治疗；(2)脓毒症休克经积极液体复苏后仍需要血管活性药物治疗；次要标准：(1)呼吸频率≥30次/min；(2)氧合指数≤250mmHg(1mmHg＝0.133kPa)；(3)多肺叶浸润；(4)意识障碍和(或)定向障碍；(5)血尿素氮≥7.14mmol/L；(6)收缩压＜90mmHg需要积极的液体复苏。国内缺少对CAP发病率和致死率的数据监测，早期重视度不够及抗生素滥用，导致细菌耐药率提升。关于CAP疾病的病原谱及其耐药特性等研究甚少，与其相关的病原体检测手段和产品落后，临床诊疗效果差，这导致国内CAP的发病率和致死率一直居高不下。故发明一种针对社区获得性肺炎常见的呼吸道病原体的基因检测用试剂盒及方法，这对临床合理用药具有重要的指导意义。

由于地域差异、人群特征、病原体检测技术和监测时间不同，导致不同国家、不同地区CAP的流行病学特征、常见致病原的组成结构及耐药特性存在明显差异。根据文献报道，CAP常见的呼吸道病原体主要分为3大类：细菌、病毒及非典型病原体，此外还有部分真菌、弓形虫和原虫等。CAP常见的细菌病原体包括：肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，HI)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae，HPI)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii，AB)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，TB)等。随着抗生素的广泛使用和预防疾病手段升级，细菌性肺炎占CAP的比例逐渐下降，CAP的病原谱发生了明显的变迁，根据近年来流行病学调查发现由病毒和非典型病原体所引发的病毒性肺炎和非典型肺炎在婴幼儿、儿童、青壮年和老年人中的发病率逐渐上升，病毒和非典型病原体已经成为了CAP主要病原体之一。CAP常见的病毒病原体包括：流感病毒(Influenza virus，IFV)、副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)、人类偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)、冠状病毒(Coronavirus，COV)、腺病毒(Adenovirus，ADV)、鼻病毒(Humanrhinovirus，HRV)等。CAP常见的非典型病原体包括：肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，LP)、Q热立克次体(Q fever Rickettsia)等。

随着多种病原体混合感染病例的增多，其临床特征呈现不同的变化趋势，市场上CAP的联检产品缺乏，医师对患者所感染的病原体组成结构认识不够，导致临床用药不准确，患者病程延长或疫情加重，难治和重症病例增多，患者痛苦和社会经济负担增加。因此早期快速、准确、多指标联合的病原体检测可以有效地指导临床用药，还可根据不同的疫情采取针对性预防措施，控制CAP的暴发、流行。

CAP呼吸道病原体的种类繁多，种属间差异大，相应的治疗药物差异大，疫情流行情况和社会危害程度不同，但其感染后的临床表现相似度却极高，现将CAP常见的部分呼吸道病原体的菌种特性、临床表现和流行病学进行简单的概述，如下：

1、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)，革兰氏阳性菌，链球菌属，球形或矛头状，成双排列，少成链状；细胞壁外有荚膜多糖抗原，根据荚膜多糖抗原不同，可分为至少90个不同的血清型，目前发现有20多种血清型与侵袭性肺炎链球菌感染相关，细菌主要靠荚膜侵袭力致病；肺炎链球菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)起病急，高热、伴寒战，可呈稽留热，全身肌肉酸痛；(2)咳嗽咳痰，可带有血丝或呈铁锈色痰；(3)胸部X线检查特征为肺叶或肺段实变，无空洞，可伴胸腔积液等；SP是CAP的主要致病菌，据WHO统计，每年约有160万人死于SP感染，其中5岁以下儿童占43.8％～62.5％，儿童、老人和长期病患者是高危人群；

2、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)，革兰氏阳性菌，葡萄球菌属，球形，呈葡萄状排列；90％菌株有多糖荚膜，根据荚膜多糖抗原不同，可分为11个不同的血清型，细菌主要通过分泌多种毒力因子和侵袭性酶致病；金黄色葡萄球菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)起病急，有寒战、高热、胸痛、脓血痰、气急；(2)有毒血症症状和休克；(3)胸部X线检查特征为肺叶或小叶浸润、早期空洞、脓胸；(4)可见单个或多发液气囊腔、X线阴影为易变性等；SA是CAP常见的致病菌之一，在婴儿、老年人、体质虚弱、气管插管、免疫抑制等人群中高发；

3、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，HI)，革兰氏阴性菌，嗜血杆菌属，呈杆状、丝状；菌株有多糖荚膜，根据荚膜多糖抗原不同，可分为6个不同的血清型，细菌主要通过释放内毒素、毒力因子和荚膜侵袭性致病；流感嗜血杆菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)成年人病例常有慢性呼吸道感染；(2)起病较慢；(3)多数患者发病前有感冒，常有痉挛性咳嗽；(4)伴有高热、胸痛、呼吸困难及衰竭，可伴胸腔积液等；HI是CAP常见的致病菌之一，据统计10％～20％的CAP由HI感染引起，33％～65％的院内肺炎首先是鼻咽部HI内源性吸入作为始动菌，继发其他革兰阴性菌感染而致；

4、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae，HPI)，革兰氏阴性菌，嗜血杆菌属，呈杆状、丝状；根据生化反应结果，可将其分为8个生物型，HPI是CAP常见的致病菌之一，其致病机理和临床表现与HI相似；

5、大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，革兰氏阴性菌，埃希氏菌属，呈短杆状；根据菌体抗原不同，可将其分为150多个血清型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，细菌主要通过分泌多种毒力因子致病，如：内毒素、外毒素、黏附素、肠毒素等；大肠埃希氏菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)寒战、发热、咳嗽、胸痛、发绀、呼吸困难；(2)咳痰，痰常为黏稠或脓性，可有腥臭味；(3)部分病例伴胃肠道症状，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻；(4)严重病例可有嗜睡等意识障碍和末梢循环障碍；(5)肺部体征可有双侧肺下区呼吸音减低并有湿啰音、肺部实变体征少见，少数患者可伴发脓胸并可见相应体征(多发生在病变严重的一侧)；E.coli是CAP常见的致病菌之一，主要发生于老年衰弱患者，原有各种慢性基础疾病、危重病患者、气管插管、长期使用皮质激素及其他免疫抑制剂治疗者，长期使用抗生素致使菌群失调者，以及各种免疫球蛋白缺陷患者等；

6、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)，革兰氏阴性菌，克雷伯氏菌属，短粗杆菌，单独、成双或短链状排列；根据菌体荚膜多糖抗原不同，可将其分为82个K血清型，其中有K1、K2和K5血清型与人和动物体的感染性疾病密切相关，细菌致病相关毒力因子主要包括有：表面抗原、黏附因子、铁载体蛋白等；肺炎克雷伯杆菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)起病急、寒战、高热、全身衰竭明显；(2)咳痰，痰量多，痰液粘稠，呈砖红色胶冻状痰；(3)胸部X线检查肺叶或肺段实变，可出现多个小空洞，呈蜂窝状脓肿，并迅速融合为一个大空洞，见叶间隙下坠；KPN是CAP常见的致病菌之一，多见于中老年、机体免疫功能受损的人群易感，如：激素、免疫抑制药，某些侵入性的检查、创伤性治疗和手术、污染的呼吸器和雾化器均可导致细菌感染，酒精中毒患者、糖尿病患者和慢性阻塞性肺疾病患者容易并发KPN细菌性肺炎；

7、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii，AB)，革兰氏阴性菌，不动杆菌属，球状或球杆状，常成双排列；根据菌体抗原不同，可将其分为34个血清型，细菌主要通过对宿主细胞的粘附、侵袭和释放毒力因子相关；鲍曼不动杆菌感染细菌性肺炎的临床表现有：(1)发热、咳嗽、胸痛、气急、血性痰；(2)肺部可有细湿啰音；(3)肺部影像常呈支气管肺炎，亦可为大叶性或片状浸润阴影，偶有肺脓肿及渗出性胸膜炎等表现；AB是CAP和医院获得性肺炎(HAP)的重要致病菌之一，根据2010年中国CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我国10省市14家教学医院AB占临床分离革兰氏阴性菌的16.11％，仅次于E.coli和KPN，AB感染危险因素包括：长时间住院、入住监护室、接受机械通气、侵入性操作、抗菌药物暴露及严重基础疾病等，AB感染常见于危重患者，常伴有其他细菌和(或)真菌的感染，且AB感染患者的病死率高；

8、流感病毒(Influenza virus，IFV)，正粘病毒科，呈球形、丝状，RNA病毒；根据核蛋白和M蛋白抗原不同，IF可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，IF感染后诱导机体宿主细胞凋亡、细胞损伤、氧化应激等反应，可损害呼吸道上皮细胞、肺上皮细胞及肺外器官等；流感病毒感染病毒性肺炎的临床表现有：(1)急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状等；(2)患者高热持续不退，出现呼吸困难、发绀、阵咳、有少量泡沫痰或泡沫黏液痰、或痰中带血；(3)继发性细菌感染常发生于发病2周内，痰转为脓性，出现细菌性肺炎的症状、体征；(4)胸片见肺部双侧呈散在性絮状阴影，由肺门向四周扩散；IF是CAP病毒性肺炎的主要致病原之一，其中甲型流感病毒(IFV-A)抗原变异性极强、发病急、发病率高、传染性强、传播迅速，在全球范围内出现过几次大流行，如：H1N1、H3N2、H5N7、H7N9，对人类致病性最强、危害性最大；乙型流感病毒(IFV-B)抗原变异性次之，常引起中等流行或局部地区和群体的小流行，其对人类致病性较强，而丙型流感病毒(IFV-C)抗原性最稳定，一般只引起人类轻微的上呼吸道感染，较少流行，主要为散发性。

9、副流感病毒(Parainfluenza virus，PIV)，副粘病毒科，呈球形，RNA病毒；根据遗传学和抗原性，PIV可分为1～4型，PIV感染后引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂，可造成严重的间质性肺炎、支气管炎和细支气管炎等，副流感病毒感染病毒性肺炎的临床表现与IF相似；PIV是CAP病毒性肺炎的主要致病原之一，其中1～3型PIV是引起儿童，尤其是婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，1型PIV(PIV-1)和2型PIV(PIV-2)常造成儿童喉气管支气管炎，3型PIV(PIV-3)常造成肺炎和细支气管炎，而4型PIV(PIV-4)检出率低、致病性弱；PIV暴发疫情流行主要以PIV-3为主，可造成局部地方性流行、传染性强、四季均可暴发，而PIV-1和PIV-2更趋于散发；

10、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，副粘病毒科，呈球形或丝状颗粒，RNA病毒；根据G蛋白，RSV可分为A型和B型，RSV感染后常引起宿主细胞损伤、炎症和局部免疫反应等，可造成急性毛细支气管炎、梗阻性肺气肿、支气管肺炎和肺外器官的并发症(中枢神经系统、心脏、皮肤)等；呼吸道合胞病毒感染病毒性肺炎的临床表现有：(1)多见于婴幼儿，初期可见咳嗽、鼻堵塞、高热，可伴有鼻炎、咽炎及喉炎，继发为细支气管炎及肺炎；(2)呼吸困难、喘憋、口唇青紫、鼻扇及三凹征，少数重症病例也可并发心力衰竭；(3)胸部听诊多有细小或粗、中罗音，叩诊一般无浊音，少数有过清音；(4)胸部X线检查：多数有小点片状阴影，大片状者罕见；RSV是CAP病毒性肺炎的主要致病原之一，可以引起从新生儿至成年人任何年龄段的呼吸道感染，尤其是造成婴幼儿呼吸道感染，RSV的A型和B型可以同时流行或交替流行，不同亚型的致病能力不同，多数地区以A型流行为主，可局部地区暴发、全年均可发病；

11、人类偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)，副粘病毒科，呈多极丝状形态，RNA病毒；根据遗传系统发生学分析和血清学抗体中和试验将hMPV分为2个血清型和4个亚型；hMPV是CAP病毒性肺炎常见的致病原之一，hMPV与RSV感染的流行病学特征和临床表现相似，具有典型的季节性分布，其阳性检出率仅次于RSV，在儿童中hMPV和RSV混合感染比单独感染发病年龄更小、病情更重；

12、冠状病毒(Coronavirus，COV)，冠状病毒科，呈球形或椭圆形，RNA病毒；目前已知的COV血清型有6种与人类呼吸道疾病相关，分别为COV-229E、COV-OC43、SARS-COV、COV-NL63、COV-HKU1和COV-MERS；COV是CAP病毒性肺炎常见的致病原之一，COV-229E和COV-OC43是最早发现的人冠状病毒，主要引起普通感冒，春冬季频发，广泛分布于全球各地，主要的临床表现为：喷嚏、鼻塞、流鼻涕、咳嗽、咽干、咽痒或灼热感，常伴有咽痛、味觉减退、呼吸不畅、低热、轻度畏寒、头痛等症状；SARS-COV主要引起人类严重急性呼吸综合征，春冬季频发，人群普遍易感，呈家庭、医院聚集性发病，儿童患者的症状、体征较成年患者轻，预后良好，目前尚无有价值的抗病毒药物，主要的临床表现为：起病急、发热、畏寒、干咳、呼吸困难、头痛、肌肉酸痛、腹泻等症状，严重患者有弥漫性肺炎和呼吸衰竭等的临床表现，损伤多组织器官，破坏人类免疫系统，危害性极大；COV-NL63、COV-HKU1和COV-MERS通常引起人类的上呼吸道感染和下呼吸道感染，如小儿急性下呼吸道感染、支气管炎、毛细支气管炎、肺炎等，婴幼儿、新生儿、老年人和免疫抑制人群都是易感人群。

13、腺病毒(Adenovirus，ADV)，腺病毒科，衣壳呈规则的20面体结构，DNA病毒；能感染人的腺病毒有A～G共7组，目前已知有55个不同的血清型，3型和7型为主要的致病原；ADV是CAP病毒性肺炎常见的致病原之一，各年龄段人群均可感染ADV，尤其是婴幼儿、老年人及免疫抑制人群，发病主要集中在春冬季，环境改变、对疫情地自然条件不适应等因素可促进群体性疫情的发生和发展；ADV主要引起隐性感染、急性上呼吸道感染、间质性肺炎和重症肺炎等，急性上呼吸道感染主要的临床表现为：急性发热起病、咳嗽、咳痰、乏力、恶心、食欲减退、咽痛、扁桃体肿大、咽部充血和咽后壁淋巴滤泡增生等，若发展为肺炎，则临床表现为：持续高热、咳嗽加重、咽部症状明显，同时可伴呼吸急促、胸闷，胸部X检查发现肺部病变，肺部听诊基本无干湿啰音，重症肺炎还会出现休克、呼吸衰竭、弥散性血管内凝血等；

14、鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)，小RNA病毒科，呈20面体对称结构，RNA病毒；目前已分离得到120多种血清型，可被分为A、B、C基因型三大类；HRV是CAP病毒性肺炎常见的致病原之一，常与多种呼吸道病毒合并感染，可引起急、慢性呼吸道感染，支气管肺炎和慢性阻塞性肺炎等疾病；儿童和老年人是易感人群，尤其是3岁以下婴幼儿多见，感染率随年龄增长而下降，而后在高龄人群中又上升；四季均可发生，多发生于春秋季，全球范围内广泛流行，无明显地域性。

15、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)，衣原体科，有原体和始体两种形态，原体形态多样，可呈典型的梨形，存在宿主细胞外时，具有很强的感染性，原体通过吞噬作用进入细胞内，发育成始体，呈球形，以分裂方式繁殖形成子代原体并释放，遗传物质为DNA，目前血清型仅一种；肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)，支原体科，呈球状、杆状、丝状等多种形态，遗传物质为DNA；嗜肺性军团菌(Legionella pneumophila，LP)，革兰氏阴性菌，军团菌属，呈短杆状，遗传物质为DNA，目前已知14种血清型；CAP病例中3％～40％由非典型病原体所引起，MP占CAP的2％～30％，CP占CAP的6％～22％，LP占CAP的2％～15％，主要可引起急、慢性呼吸道感染，鼻窦炎、咽炎、支气管炎、间质性肺炎、肺炎和慢性阻塞性肺疾病等，也可通过多种途径侵犯其他器官，导致各种不同的肺外疾病；MP和CP感染肺炎的临床表现有：发热、咽痛、干咳、头痛、乏力、肺部影像常为斑片状浸润等，儿童、青年人均为易感人群，全年均有发病，多见春冬季，在学校、部队和社区可发生小规模流行；LP感染肺炎的临床表现有：多以高热起病，乏力、头痛、肌肉酸痛等全身中毒症状较重，重症病例可伴有呼吸困难、相对缓脉、神经精神症状、水样腹泻等，少数病例出现肾功能损害，胸部影像检查早期表现为斑片状浸润，后期可累及双肺。

由于CAP疾病的病原谱复杂、发病率高，多联检的核酸检测产品极少，针对CAP呼吸道疾病的早期诊断，仍有许多问题急需解决：(1)CAP常见的呼吸道病原体种类多样，截止目前研究报道已多达20多种常见病原体，且多数病例为混合感染，故要求检测试剂盒可实现多达20多种病原体的平行检测，物种间无交叉干扰，具有较高的灵敏度和特异性，目前尚无类似产品或发明专利；(2)CAP常见的呼吸道病原体除了细菌外，多数为RNA病毒、DNA病毒、支原体和衣原体等，故要求检测试剂盒具备同时检测RNA和DNA核酸的能力，多指标的联检对引物和探针的特异性及性能优化要求高；(3)多数CAP为急性发病、集中暴发流行，故要求检测试剂盒具备操作简便、快速检测和高通量检测的能力；(4)病毒抗原的变异性极强，病毒亚型的种类日益增多，故要求检测试剂盒的检测基因区域、引物和探针具有很好的覆盖性及特异性。目前在国内市场上针对呼吸道病原体的检测试剂盒和方法有多种，各有优缺点(可参见表1)，检测试剂盒有：肺炎支原体核酸检测试剂盒(国械注准20173400078)、甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂(国械注准20153400613)、九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒(国械注进20173406446)等。因此，有效地鉴定呼吸道病原体种类，对疾病预防和临床诊疗有重要意义。

表1呼吸道病原体的检测方法

发明内容

本发明目的在于克服现有技术不足，而提供用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，本发明检测试剂盒覆盖了24种CAP常见的呼吸道病原体，其具有特异性高、灵敏度高、检测靶点多、操作简便快速等优点。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的扩增引物对，所述扩增引物对包括IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对、KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对、SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对和TB扩增引物对中的至少一种；

所述IFA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1～2所示，IFA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，IFA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色；所述hMPV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3～4所示，hMPV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，hMPV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述PIV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5～6所示，PIV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，PIV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述RSV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7～8所示，RSV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，RSV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述HRV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.9～10所示，HRV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，HRV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述COV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.11～12所示，COV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，COV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述IFB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.13～14所示，IFB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ IDNO.91所示的标签序列，IFB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述HBoV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.15～16所示，HBoV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，HBoV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

所述KPN扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.17～18所示，KPN扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，KPN扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述SP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.19～20所示，SP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，SP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述HI扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.21～22所示，HI扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，HI扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述E.coli扩增引物对的碱基序列如SEQ IDNO.23～24所示，E.coli扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，E.coli扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述PM扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.25～26所示，PM扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ IDNO.89所示的标签序列，PM扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述MP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.27～28所示，MP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，MP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述CP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.29～30所示，CP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，CP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述ADV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.31～32所示，ADV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，ADV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

所述SA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.33～34所示，SA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，SA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述PDR-PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.35～36所示，PDR-PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，PDR-PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述MRSA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.37～38所示，MRSA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，MRSA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述MDR-AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.39～40所示，MDR-AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ IDNO.88所示的标签序列，MDR-AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.41～42所示，AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.43～44所示，PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述LP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.45～46所示，LP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，LP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述TB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.47～48所示，TB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，TB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；优选地，扩增引物对的正向引物和反向引物是相对的，若其中一个为正向引物，另一个则是反向引物；

正向引物的5’端与标签序列的连接处加入间臂。

作为上述技术方案的改进，第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集显示蓝色的乳胶微球；所述间臂是C3spacer间臂。

作为上述技术方案的改进，所述扩增引物对由IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对组成。

作为上述技术方案的改进，所述扩增引物对由KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对组成。

作为上述技术方案的改进，所述扩增引物对由SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对和TB扩增引物对组成。

作为上述技术方案的改进，所述扩增引物对由IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对、KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对、SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对和TB扩增引物对组成。

另外，本发明还提供用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的杂交膜条，其包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下一种探针：P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，P1的碱基序列如SEQ ID NO.51所示，P2的碱基序列如SEQ IDNO.52所示，P3的碱基序列如SEQ ID NO.53所示，P4的碱基序列如SEQ ID NO.54所示，P5的碱基序列如SEQ ID NO.55所示，P6的碱基序列如SEQ ID NO.56所示，P7的碱基序列如SEQID NO.57所示，P8的碱基序列如SEQ ID NO.58所示。

作为上述技术方案的改进，硝酸纤维膜上还附着有内标探针:P0，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO.59所示。

作为上述技术方案的进一步改进，硝酸纤维膜上从上至下依次附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，P1～P8相邻探针之间的固定距离为0.5～1.0mm，P0与P1之间的固定距离为0.6～0.8mm。

另外，本发明还提供一种用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，其包括所述的扩增引物对，以及杂交膜条和杂交显色液，所述杂交显色液包括连接有第二显色标记物的微球，微球富集后显色；优选地，杂交显色溶液具体包括有：100mM HEPES-HCl溶液(pH 8.0)、1M NaCl、0.4mM EDTA溶液(pH 8.0)、1％Latex微球；

所述杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上至少附着有以下至少一种探针：P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，P1的碱基序列如SEQ IDNO.51所示，P2的碱基序列如SEQ ID NO.52所示，P3的碱基序列如SEQ ID NO.53所示，P4的碱基序列如SEQ ID NO.54所示，P5的碱基序列如SEQ ID NO.55所示，P6的碱基序列如SEQID NO.56所示，P7的碱基序列如SEQ ID NO.57所示，P8的碱基序列如SEQ ID NO.58所示；所述杂交膜条上的探针与扩增引物对相匹配。

作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包括内标模板，所述内标模板的碱基序列如SEQ ID NO.84所示；所述扩增引物对还包括内标扩增引物对，所述内标扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.49～50所示，内标扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ IDNO.93所示的标签序列，内标扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述硝酸纤维膜上还附着有内标探针，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO.59所示；

所述第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。

作为上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒包括反应液、引物溶液、酶液、阴性质控品、阳性质控品、杂交显色液、杂交膜条和干燥剂；所述反应液包括PCR缓冲溶液、金属阳离子和纯化水，所述酶液包括逆转录酶、热启动Taq酶和UNG酶，所述阴性质控品为无菌生理盐水，所述阳性质控品为含检测病原体目的扩增序列的克隆菌液或假病毒颗粒，所述病原体目的扩增序列的碱基序列如SEQ ID NO.60～83所示；

所述引物溶液分成引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш的组分均包括扩增引物对、内标模板和dUTP plus dNTP Mixture；引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有IFA扩增引物对、KPN扩增引物对、SA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有hMPV扩增引物对、SP扩增引物对、PDR-PA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有PIV扩增引物对、HI扩增引物对、MRSA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有RSV扩增引物对、E.coli扩增引物对、MDR-AB扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有HRV扩增引物对、PM扩增引物对、AB扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有COV扩增引物对、MP扩增引物对、PA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有CP扩增引物对、IFB扩增引物对、LP扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有HBoV扩增引物对、ADV扩增引物对、TB扩增引物对中的一个；引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш中除内标扩增引物对外不存在相同引物；

所述杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述金属阳离子的浓度为1～3mM，Taq酶的浓度为0.5～5U，UNG酶的浓度为0.05～0.5U，所述克隆菌液的浓度为1×10⁴cfu/ml，假病毒的浓度为1×10⁴copies/ml，所述内标模板的浓度为1×10⁵copies/ml，扩增引物对中每种引物的浓度为0.1～1.0μM，dUTP plus dNTP Mixture的浓度为0.2～2mM；

P1～P8相邻探针之间的固定距离为0.5～1.0mm，P0与P1之间的固定距离为0.6～0.8mm。

作为上述技术方案的更进一步改进，引物溶液Ⅰ中的扩增引物对由IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对和内标扩增引物对组成，

引物溶液Ⅱ中的扩增引物对由KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对和内标扩增引物对组成，

引物溶液Ш中的扩增引物对由SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对、TB扩增引物对和内标扩增引物对组成；

优选地，根据病原体种类及检测效果，将CAP常见的24种呼吸道病原体分为3组；引物溶液Ⅰ用于提供检测第一组中病原体的组分，第一组病原体包括：甲型流感病毒(IFA)、人类偏肺病毒(hMPV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒型(RSV)、鼻病毒(HRV)、冠状病毒(COV)、乙型流感病毒(IFB)、博卡病毒(HBoV)；引物溶液Ⅱ用于提供检测第二组中病原体的组分，第二组病原体包括：肺炎克雷伯菌(KPN)、肺炎链球菌(SP)、流感嗜血杆菌(HI)、大肠杆菌(E.coli)、奇异变形杆菌(PM)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)；引物溶液Ш用于提供检测第三组中病原体的组分，第三组病原体包括：金黄色葡萄球菌(SA)、多重耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、泛耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)、鲍曼不动杆菌(AB)、铜绿假单胞菌(PA)、嗜肺性军团菌(LP)、结核分枝杆菌(TB)；

所述第一组病原体与反应液、酶液和引物溶液Ⅰ相对应，所述第二组病原体与反应液、酶液和引物溶液Ⅱ相对应，所述第三组病原体与反应液、酶液和引物溶液Ш相对应，分别进行PCR扩增，获取PCR产物。

优选地，杂交膜条的制备：将硝酸纤维素膜(4cm×20cm)贴附于PVC板上(6cm×20cm)，再将吸水纸(2.1cm×20cm)粘贴于PVC板上，与硝酸纤维素膜有0.1cm重叠；将9种探针以20ng/μl的浓度喷划在硝酸纤维素膜上(Probe：200ng/cm，P0-P8)，相邻基因探针(P1-P8)之间的固定距离为0.5～1.0mm，内标探针P0与邻近的P1的固定距离为0.6～0.8mm，并以喷划红色打印油墨为位置线区分(可参见图1)；将制好的半成品PVC板置于37℃烘箱干燥过夜，最后切成(2mm×6cm)的成品PAS膜条即可。

本发明的有益效果在于：本发明提供用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，本发明试剂具有以下优点：

1)特异性强：本发明选择病原体的基因检测区域为特异性的保守区域，基因扩增引物是针对此保守序列设计，经NCBI数据库的blast软件评估保守序列和引物的特异性，有效避免了非特异性扩增及多重引物间的非特异性交叉反应(如细菌的16S rRNA、gyrB等基因，虽然拷贝数含量高，但极易产生细菌之间的交叉反应；又如超过9对多重引物间3’端随机的G-C互补配对，极易形成稳定的二聚体而造成假阳性结果)，特异性强、覆盖面广；

2)灵敏度高：本发明通过优化引物量、探针量及反应体系扩增效率，可检测到500copies/ml的病原体浓度；

3)多指标联检：本发明可同时检测多达24种CAP常见的呼吸道病原体，兼顾细菌、耐药细菌、病毒和非典型病原体等多种类型，覆盖面广、病原体种类多，其可为疾控中心、医院等医疗机构提供一个准确、多靶点的平行检测试剂盒，亦可结合全自动化的核酸检测设备，实现全自动化检测。

4)采用内标系统：对反应过程进行有效的监控，避免假阴性；

5)检测通道多：本发明杂交膜条固定的9种探针序列，经NCBI数据库软件评估及实验验证，相互间均无任何交叉反应，特异性强，可应用于多种复杂病原体结构的疾病检测或病原体亚型分型；

6)快速检测：本发明在室温下进行杂交反应，反应时间为5～15min，可直接判读或连接软件分析，扩增和杂交的整个检测过程时长控制在1小时内，结果分析速度快。

7)操作简便、成本低：依赖普通基因扩增仪，无需昂贵的荧光PCR仪器、杂交仪等，检测成本低，对技术人员专业要求低，操作简便，便于在常规检测中推广。

附图说明

图1为试剂盒及方法的检测原理和流程示意图；图中标准比色卡中，第一组T1～T8检测线分别对应IFA、hMPV、PIV、RSV、HRV、COV、IFB、HBoV，第二组T1～T8检测线分别对应KPN、SP、HI、E.coli、PM、MP、CP、ADV，第三组T1～T8检测线分别对应SA、PDR-PA、MRSA、MDR-AB、AB、PA、LP、TB；

图2显示临床样本的检测结果；

图3显示最低检测限的检测结果；

图4显示PCR产物污染的预防检测结果；

图5显示特异性实验的检测结果；

图6显示对潜在内源物质的抗干扰检测结果；

图7显示对潜在外源药物的抗干扰实验结果；

图8显示本发明试剂盒与市面上荧光PCR试剂盒的对比结果。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实验和附图对本发明作进一步说明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

扩增引物对、探针的设计

针对呼吸道病原体的核酸信息，进行同源性比对分析，选择病原体特异性的保守序列，设计特异性的引物；所述保守序列为：SEQ ID NO.60～84(可参见表6)。

引物和探针：利用primer 3、primer 5和Oligo 6.0等软件设计而成，在正向引物的5’端连接有与杂交探针互补的标签(Tag)序列，在连接处加入C3 spacer间臂，在反向引物的5’端连接Biotin标记(可参见图1)；扩增引物对的碱基序列为SEQ ID NO.1～50(可参见表3～5)；探针的碱基序列为SEQ ID NO.51～59，标签序列为SEQ ID NO.85～93。

表2检测病原体、探针序列和Tag序列组合

表3第一组检测病原体、引物序列和探针组合

表4第二组检测病原体、引物序列和探针组合

表5第三组检测病原体、引物序列和探针组合

表6检测病原体的保守序列及内标序列

实施例1

本实施例提供一种用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，其包括反应液、引物溶液、酶液、阴性质控品、阳性质控品、杂交显色液、杂交膜条和干燥剂；反应液包括PCR缓冲溶液、金属阳离子和纯化水，酶液包括逆转录酶、热启动Taq酶和UNG酶，阴性质控品为无菌生理盐水，阳性质控品为含检测病原体目的扩增序列的克隆菌液或假病毒颗粒，病原体目的扩增序列的碱基序列如SEQ ID NO.60～83所示；金属阳离子的浓度为1～3mM，Taq酶的浓度为0.5～5U，UNG酶的浓度为0.05～0.5U，克隆菌液的浓度为1×10⁴cfu/ml，假病毒的浓度为1×10⁴copies/ml，内标模板的浓度为1×10⁵copies/ml，扩增引物对中每种引物的浓度为0.1～1.0μM，dUTP plus dNTP Mixture的浓度为0.2～2mM；

引物溶液分成引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш的组分均包括扩增引物对、内标模板和dUTP plus dNTP Mixture；引物溶液Ⅰ中的扩增引物对由IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对和内标扩增引物对组成，引物溶液Ⅱ中的扩增引物对由KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对和内标扩增引物对组成，引物溶液Ш中的扩增引物对由SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对、TB扩增引物对和内标扩增引物对组成；内标模板的碱基序列如SEQ ID NO.84所示；

IFA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1～2所示，IFA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，IFA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素，微球富集后显色；hMPV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3～4所示，hMPV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，hMPV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；PIV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5～6所示，PIV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，PIV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；RSV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7～8所示，RSV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，RSV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；HRV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.9～10所示，HRV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，HRV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；COV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.11～12所示，COV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，COV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；IFB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.13～14所示，IFB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，IFB扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；HBoV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.15～16所示，HBoV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，HBoV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；内标扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.49～50所示，内标扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.93所示的标签序列，内标扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；

KPN扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.17～18所示，KPN扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，KPN扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；SP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.19～20所示，SP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，SP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；HI扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.21～22所示，HI扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，HI扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；E.coli扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.23～24所示，E.coli扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，E.coli扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；PM扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.25～26所示，PM扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，PM扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；MP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.27～28所示，MP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，MP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；CP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.29～30所示，CP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，CP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；ADV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.31～32所示，ADV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，ADV扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；

SA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.33～34所示，SA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，SA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；PDR-PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.35～36所示，PDR-PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，PDR-PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；MRSA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.37～38所示，MRSA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，MRSA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；MDR-AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.39～40所示，MDR-AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，MDR-AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.41～42所示，AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.43～44所示，PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；LP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.45～46所示，LP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，LP扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；TB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.47～48所示，TB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，TB扩增引物对的反向引物5’端还连接有生物素；正向引物的5’端与标签序列的连接处加入C3spacer间臂；

杂交显色液包括连接有链霉亲和素的微球，微球富集后显色；优选地，杂交显色溶液具体包括有：100mM HEPES-HCl溶液(pH 8.0)、1M NaCl、0.4mM EDTA溶液(pH 8.0)、1％Latex微球；杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上从上至下依次附着有以下探针：P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，P1～P8相邻探针之间的固定距离为0.5～1.0mm，P0与P1之间的固定距离为0.6～0.8mm，P0～P8的碱基序列如SEQ IDNO.51～59所示。

实施例2

具体而言，采用上述实施例1中所述检测试剂盒，本实施例出示了三组临床样本的检测数据。临床样本为已知感染病原体的CAP患者的鼻咽拭子、肺泡灌洗液或痰液样本(可参见表7：表7中“/”表示无临床确认的感染病原体类型，这些样本检测为阴性)。临床样本的预处理为：(1)鼻咽拭子样本:将拭子样本放入1.0ml的生理盐水中充分洗涤、贴壁挤干，丢弃拭子，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用；(2)肺泡灌洗液样本：取1.0ml样本，12000rpm离心5min，弃上清，再加入1.0ml的生理盐水洗涤1次，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用；(3)痰液样本：a、向痰液样本保存管中加入2～3倍体积的4％NaOH溶液，充分振荡，室温处理20～30min，使其充分液化；b、取1.0ml液化后的痰液样本，12000rpm离心5min，弃上清；c、加入1.0ml的生理盐水，充分振荡，12000rpm离心5min，弃上清，留沉淀备用。临床样本的核酸提取，经验证推荐使用商品化的核酸提取试剂盒，RNA/DNA共提取，如：广州市宝创生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒(备案号：粤穗械备20150224号)，严格按照产品说明书要求操作，取临床样本预处理后的沉淀，提取样本核酸。也可使用全自动核酸提取仪，RNA/DNA共提取，如：广州市宝创生物技术有限公司生产的全自动核酸提取仪(备案号：粤穗械备20170615号)，严格按照产品说明书要求操作，取临床样本预处理后的沉淀，提取样本的核酸。

表7临床样本

检测试剂盒用于检测临床样本的操作步骤为：

(a)试剂准备：参照下表中单个测试反应体系的组分和用量，根据待测样本及质控品的数量(N)分别配制3组反应体系；

(b)加样：根据上述推荐配合使用的提取试剂盒提取待测样本和各质控品的核酸，按上述表格分别向3组反应体系中加5μl核酸模板；

(c)PCR扩增：分别将3组反应体系的PCR反应管放入基因扩增仪中，设置反应程序进行PCR扩增平行检测；

(d)层析杂交：反应结束后，将PCR反应管(N)瞬时离心，在生物安全柜内等体积加入20μl显色溶液，充分混匀后，在PCR反应管(N)中插入杂交膜条，5～15min快速杂交反应后即可判读结果；

(e)结果分析：可参见图1中标准比色卡所示区域的条带相对位置进行定性判读，亦可参照下表，对显色结果进行拍照保存。

结果	质控区	检测区	判读
				1	有/无蓝色条带	有蓝色条带	阳性
2	有蓝色条带	无蓝色条带	阴性

质量控制的标准如下：1)阴性质控品应出现1条蓝色条带，位于质控线(内标)，且检测线(T线)没有条带或强度＜L4；2)阳性质控品应出现≥5条蓝色条带，分别位于质控线(内标)和检测线(T线)，且强度≥L4；3)若样本检测为阴性，则质控线(内标)条带强度应≥L2，样本有效；4)若样本检测为阳性，则质控线(内标)条带强度可强可弱，甚至无条带，样本有效；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验视为无效，需重新进行检测。

根据检测结果分析可知，阳性样本50例，阴性样本20例，阳性样本的膜条检测结果显示病原体的种类与已知感染病原体的种类一致，与临床结果符合率100％。将上述部分阳性样本的PCR扩增产物，送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序得到产物序列，将其输入NCBI数据库中，利用blast软件进行比对分析，确认病原体的种类是否与膜条检测结果一致。根据检测结果可知，测序反馈结果与膜条检测结果一致，说明本发明试剂盒的检测特异性高；膜条检测结果可参见图2。

实施例3

为证明本发明的合理性和可行性，对检测试剂盒进行了以下性能评估研究：

(1)最低检测限实验

参考品配制：向广东省微生物菌种保藏中心购买标准参考品(可参见下表)，提取参考品的核酸，测定核酸浓度，按相关公式进行拷贝数换算，再用0.2×TE将核酸样本进行梯度稀释和检测。

参考品	检测浓度梯度(copies/ml)
		SA	10<sup>4</sup>、10<sup>3</sup>、500、100
PA	10<sup>4</sup>、10<sup>3</sup>、500、100
		IFB	10<sup>4</sup>、10<sup>3</sup>、500、100

按上述实施例中检测试剂盒的检测方法对各浓度梯度的标准参考品进行检测，膜条检测结果如图3。根据检测结果可知，本发明试剂盒的最低检测限为500copies/ml，具有很高的灵敏度。

(2)PCR产物污染的预防实验

在对PCR产物的后续处理时，容易产生气溶胶现象(含有阳性样本的PCR扩增产物，浓度一般低于1×10³copies/ml)，导致实验室环境污染，给后续实验带来一定的假阳性风险，因此在PCR体系中设置预防PCR产物污染的措施很重要。本发明试剂盒中设置有UNG-dUTP防污染系统，利用UNG酶水解反应体系中的U-DNA扩增产物，同时通过高温灭活UNG酶，不影响新一轮PCR产物的生产，从而达到预防污染的作用。

按上述检测试剂盒的检测方法对以下待测样本进行检测，以两组不同的反应体系(第1组：含UNG酶、第2组：不含UNG酶)进行对比试验，测定UNG酶对U-DNA扩增产物的防污染效果较好，待测样本的配制及检测结果如下表和图4所示。

(3)特异性实验

按上述实施例中检测试剂盒对本发明中所述24种病原体以外的其它病原体进行检测(可参见下表)，根据检测结果可知，本发明试剂盒具有很高的特异性，无交叉反应(可参见图5)。

种类	种属	编号	检测结果
				巨细胞病毒	巨细胞病毒属	1	阴性
肠道病毒	肠道病毒属	2	阴性
				麻疹病毒	麻疹病毒属	3	阴性
流行性腮腺炎病毒	副黏病毒属	4	阴性
				鸟分枝杆菌	分枝杆菌属	5	阴性
胞内分枝杆菌	分枝杆菌属	6	阴性
				卡他莫拉菌	莫拉菌属	7	阴性
脑膜炎奈瑟菌	奈瑟菌属	8	阴性
				淋球菌	奈瑟菌属	9	阴性
表皮葡萄球菌	葡萄球菌属	10	阴性
				化脓链球菌	链球菌属	11	阴性
唾液链球菌	链球菌属	12	阴性
				沙眼衣原体	衣原体属	13	阴性
解脲脲原体	脲原体属	14	阴性
				人乳头瘤病毒	乳头瘤病毒属	15	阴性
乙型肝炎病毒	正嗜肝DNA病毒属	16	阴性

(6)对潜在内源物质的抗干扰性

根据感染病原体的种类不同，对病毒类感染、非典型病原体感染和细菌感染的临床样本进行分组，每组以其中一种感染病原体类型的阳性样本作为待测样本，进行潜在内源物质的抗干扰性研究。

按上述实施例中检测试剂盒对含有10％用量潜在内源物质的阳性样本进行检测(可参见下表8)，根据检测结果可知，适量的所述内源物质不会影响检测结果，但考虑到样本的复杂性，其中可能含有较多的内源性RNA酶，故建议采样时，需尽量避免所述干扰物质的残留，本发明检测试剂盒对潜在内源物质的抗干扰性强(可参见图6)。

表8临床样本

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

(7)对潜在外源药物的抗干扰性

根据感染病原体的种类不同，对病毒类感染、非典型病原体感染和细菌感染的临床样本进行分组，每组以其中一种感染病原体类型的阳性样本作为待测样本，进行潜在外源药物的抗干扰性研究。

按上述实施例中检测试剂盒对含有医学相关水平的潜在外源药物浓度的阳性样本进行检测(可参见下表9)，根据检测结果可知，适量的所述外源药物不会影响检测结果，但应尽量避免此类样本的检测，本发明检测试剂盒对潜在外源药物的抗干扰性强(可参见图7)。

表9临床样本

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

实施例4

本实施例采用上述实施例试剂盒对来自临床上已确认感染病原体的样本进行检测，同时采用市面上较好的呼吸道病原体联检荧光PCR试剂盒，严格按照厂家说明书进行检测，检测结果如表10和图8所示。

表10

如表10所示，某厂家呼吸道病原体联检荧光PCR试剂盒的总体阳性率和阴性率分别为35.7％(15/42)和64.3％(27/42)；采用临床诊断结果为金标准，经统计，该方法诊断符合率为47.6％(20/42)。

然而，本发明试剂盒盒的检测结果是：总体阳性率和阴性率分别为73.8％(31/42)和26.2％(11/42)；采用临床诊断结果为金标准，经统计，该方法诊断符合率为100％(42/42)，本发明检测试剂盒的特异性和敏感性大大优于目前市面上的荧光PCR检测试剂盒。

由上述实施例可知，本发明提供了一种针对社区获得性肺炎常见的呼吸道病原体的检测试剂盒，具有特异性高、灵敏度高、检测靶点多、操作简便快速等优点。本发明可同时检测多达24种CAP常见的呼吸道病原体，覆盖面广、病原体种类多，可为疾控中心、医院等医疗机构提供一个准确、多靶点的平行检测试剂盒，亦可结合全自动化的核酸检测设备，实现全自动化检测。设置内标系统，可对检测过程中潜在的PCR抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进行质量控制。设置阴性质控品和阳性质控品可对样本核酸提取过程进行质量控制。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州宝创生物科技有限公司

<120> 用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒

<130> 2019.3.5

<160> 93

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctggat cgagtgaaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcactggagc taggatgagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatcagacc agcaaccctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctctgtcggg gtctgtttct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggccacat caatgcagaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgatgtcat cccagccaga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgggtggaga agcaggattt 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agagaagtga gcaaattgag tca 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtactgcct ttggtgatgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaccgtggc accctaaaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcaacactg tggtcttgac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cttcatcacg cactggttca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

accaccagtg tttcaaggga 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

catgagcatt ttccccagtg t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aacgtcgtct aactgctcca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtctgccagt gtctcttcct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gatgcggtcg ataagtccag 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagttttcca ccacgccttt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaagctggct gtcgtacatg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttttcctcga ccgtgacaga 20

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgtttcgcac aaattacc 18

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtgcgtacca cgatagg 17

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgtacaggt ttcctccgaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ggcgcatcat caagctgtaa 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agagatccgc attccaacct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctttaccgcg accatgacag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gccattactg acgcttaggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgaatgtact acccaggcga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tggaatgcgc ttgaagatgg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ctccacgacg ctcaaatacg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gtcctgcaaa gttcccttgg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tcattggtat cgttgcgcag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

aagagatcca aatgcaccgc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tcaccatgac atgtttcgca 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gacggcaagc atctgtactg 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

gggtgctttc cggaatcttc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

ccaggaatgc agaaagacca 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gctgttcctg tattggccaa 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

accccgagtc agattgttca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

attctgtatt tgcgcggctt 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gtgaccgcgt tcgtttaagt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ataagtcggc accatcacgt 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

acaaattcgg gttggaaggc 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cctccgttac caaagcctct 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

tggttttggc ggatttggag 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

aaatcagcgc ctctttgtcc 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

actacgacca catcaaccgg 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ccgtaaacac cgtagttggc 20

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gagtatgcct gccgtgtg 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

aatccaaatg cggcatct 18

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gtgccatttc agcttagc 18

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

agggcgatcg aacgattagg 20

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tattagctga ttaggcaa 18

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

cattctccag taacaaagct a 21

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

tgttctctga ccaatgaatc tgc 23

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgttggaatc tcgttccagt t 21

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gcagattcat tggtcagaga aca 23

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

cgaagttccg agatggcc 18

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

cgagatcggt ggttacttag att 23

<210> 60

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atggctggat cgagtgaaca ggcagcagag gccatggagg ttgctaatca aactaggcag 60

atggtacatg caatgagaac cattgggact catcctagct ccagtgc 107

<210> 61

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

accaccagtg tttcaaggga aattcaatta taagctagta gataagataa cttctgatca 60

acatatcttc agtccagaca aaatagatat gttaacactg gggaaaatgc tcatg 115

<210> 62

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caggccacat caatgcagaa tcatctcatg attgctgcca gagccccaga tgctgctctt 60

aggatcattg aagttgatgc aatagacccg caggattata cgttaaccat taatccaaga 120

tctggctggg atgacatcaa 140

<210> 63

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

tgggtggaga agcaggattt taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt 60

tgactcaatt tgctcacttc tct 83

<210> 64

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

ggtactgcct ttggtgatgg attcacaagt aatattaagg atcatttaac agggttgtgt 60

acatcaatta ctgacaagat cactaccaga gttatcaaat ggctaattcg ggttattagt 120

gccttgacca tcatgatcag gaattcaaca gacacagcaa cagtattggc cacattagca 180

cttttagggt gccacggttc 200

<210> 65

<211> 193

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ggcaacactg tggtcttgac tttcaccact agagtgactg tgcccaaaga ccatccacac 60

ttgggtaagt ttcttgagga attaaatgca ttcactagag aaatgcaaca acagcctctt 120

cttaacccta gtgcactaga attcaaccca tcccaaactt cacctgcaac tgttgaacca 180

gtgcgtgatg aag 193

<210> 66

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tcattagacc agcaaccctt gccccaccaa gcaacaaacg aacccgtaac ccatcaccgg 60

aaagagcaac cacaagcagt gaagatgatg tcggaaggaa aacccaaaag aaacagaccc 120

cgacagag 128

<210> 67

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

aacgtcgtct aactgctcca gcaagtcctc caaactcacc tgcgagctct gtaagtacta 60

ttactttctt taacacttgg cacgcacagc cacgtgacga agatgagctc agggaatatg 120

aaagacaagc atcgctccta caaaagaaaa gggagtccag aaagagggga gaggaagaga 180

cactggcaga c 191

<210> 68

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

cagttttcca ccacgccttt ttcatcgaag aaaatcatca gcgagttcga atctttttgg 60

ctggacttat cgaccgcatc 80

<210> 69

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

gaagctggct gtcgtacatg taatggctct ggtgctaagc cagggacaag tccagtcact 60

tgtggacgct gtcatggcgc tggtgtcatt aacgtcgata cgcagactcc tcttggtatg 120

atgcgtcgcc aagtaacctg tgatgtctgt cacggtcgag gaaaa 165

<210> 70

<211> 167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

gtgcgtacca cgataggaat aagcaataaa gctaatgcga atgctccagc ccaccctgaa 60

aaatgctcga tttttgatac atataagctg taaacaaaca aaccaataat aatagaaggg 120

gcagaaagaa gaatatcatt aagaaaacgg gtaatttgtg cgaaacg 167

<210> 71

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

ggcgcatcat caagctgtaa ggcggcactc acctcttcct gctgatggcc cgactgttgt 60

tgttgctgcg actgcccttc ggaggaaacc tgtacgt 97

<210> 72

<211> 173

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

agagatccgc attccaacct tagaaacctg tgataaatgc cacggaagtg gggcaaaaga 60

aggcacatca gcggaaactt gctcaacatg tcatggggca ggtcaggttc atttacgtca 120

aggtttcttc accgttcaac aaccatgccc tacctgtcat ggtcgcggta aag 173

<210> 73

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gccattactg acgcttaggc ttgaaagtgt ggggagcaaa taggattaga taccctagta 60

gtccacaccg taaacgatag atactagctg tcggggcgat cccctcggta gtgaagttaa 120

cacattaagt atctcgcctg ggtagtacat tcg 153

<210> 74

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

ctccacgacg ctcaaatacg ggatgagact ctacatcaat aaagacatag agatctccgg 60

agggagctcc attttggcct gcatctccat agccttccat cttcaagcgc attcca 116

<210> 75

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

gtcctgcaaa gttcccttgg aaatgacctc agaacagatg gtgctaccat aagtttcacc 60

agcattaacc tctatgccac cttcttcccc atggctcaca acaccgcttc aactcttgaa 120

gccatgctgc gcaacgatac caatga 146

<210> 76

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

tcaccatgac atgtttcgca tgttacatct ttacggattg aaatttcttt tgttgtacca 60

aataccgctt cttcaaatgt taatgtcatt gtatactgaa gatcatcacc tttttgcggt 120

gcatttggat ctctt 135

<210> 77

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

acaaattcgg gttggaaggc cagcttagaa tttccgcagt taatcaagtg gagtttctag 60

agtctctata tttaaataaa ttgtcagcat ctaaagaaaa ccagctaata gtaaaagagg 120

ctttggtaac ggagg 135

<210> 78

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

gctgttcctg tattggccaa ttccacattg tttcggtcta aaattttacc acgttctgat 60

tttaaatttt caatatgtat gctttggtct ttctgcattc ctgg 104

<210> 79

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

attctgtatt tgcgcggctt agagcattac catatagatt aattttttta tctgtttgaa 60

taaccagcac acctgaggtg tttttttcat caaagtattg atgaatcacc tgattatgtc 120

cttgaacaat ctgactcggg gt 142

<210> 80

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gtgaccgcgt tcgtttaagt ggtaaaggcg aggctattcg tgatggtcaa gctggtgact 60

tatacgttga agtggttgtt cgtgaacacg aaattttcca acgtgatggt gccgacttat 120

<210> 81

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

gggtgctttc cggaatcttc agcttgaccc ggccatccag ggtcggcact tccagctcgc 60

cacccaacgc agcgtcggcg aaactgatcg gcacttcgca gtacagatgc ttgccgtc 118

<210> 82

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

aaatcagcgc ctctttgtcc acgtgattga cgcccatgcc cacgcccccc tgaaaaaata 60

ttctcaaaaa tatcttcaaa aacgtcacca aatcctccaa atccgccaaa acca 114

<210> 83

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

actacgacca catcaaccgg gagcccagcc gccgcgagct gcgcgatggc gaactcaagg 60

agcacatcag ccgcgtccac gccgccaact acggtgttta cgg 103

<210> 84

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc ccaagatagt taagtgggat 60

cgagacatgt aagcagcatc atggaggttt gaagatgccg catttggatt 110

<210> 85

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

cacggtaaag tcgaatcg 18

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

tcccgctagc ttgctaatcc 20

<210> 87

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

ataatcgact aatccgtt 18

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

gtaagaggtc attgtttcga t 21

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acaagagact ggttacttag acg 23

<210> 90

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gcaaccttag agcaaggtca a 21

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

cgtctaagta accagtctct tgt 23

<210> 92

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

gcttcaaggc tctaccgg 18

<210> 93

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

gctctagcca ccaatgaatc taa 23

Claims (5)

1.一种用于检测社区获得性肺炎的呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括扩增引物对，以及杂交膜条和杂交显色液，所述杂交显色液包括连接有第二显色标记物的微球，微球富集后显色；

所述杂交膜条包括聚氯乙烯板，聚氯乙烯板上固定有硝酸纤维膜，硝酸纤维膜上附着有以下探针：P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8；P1的碱基序列如SEQ ID NO.51所示，P2的碱基序列如SEQ ID NO.52所示，P3的碱基序列如SEQ ID NO.53所示，P4的碱基序列如SEQ IDNO.54所示，P5的碱基序列如SEQ ID NO.55所示，P6的碱基序列如SEQ ID NO.56所示，P7的碱基序列如SEQ ID NO.57所示，P8的碱基序列如SEQ ID NO.58所示；

其中，如SEQ ID NO.51所示的探针与如SEQ ID NO.85所示的碱基序列互补，如SEQ IDNO.52所示的探针与如SEQ ID NO.86所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.53所示的探针与如SEQ ID NO.87所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.54所示的探针与如SEQ ID NO.88所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.55所示的探针与如SEQ ID NO.89所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.56所示的探针与如SEQ ID NO.90所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.57所示的探针与如SEQ ID NO.91所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.58所示的探针与如SEQ IDNO.92所示的碱基序列互补，如SEQ ID NO.59所示的探针与如SEQ ID NO.93所示的碱基序列互补；

所述硝酸纤维膜上还附着有内标探针：P0，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO.59所示；

IFA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1～2所示，IFA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，IFA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物，第一显色标记物能与结合有微球的第二显色标记物相连接，微球富集后显色；

hMPV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3～4所示，hMPV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，hMPV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

PIV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5～6所示，PIV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，PIV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

RSV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.7～8所示，RSV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，RSV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

HRV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.9～10所示，HRV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，HRV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

COV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.11～12所示，COV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，COV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

IFB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.13～14所示，IFB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，IFB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

HBoV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.15～16所示，HBoV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，HBoV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

KPN扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.17～18所示，KPN扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，KPN扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

SP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.19～20所示，SP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，SP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

HI扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.21～22所示，HI扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，HI扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

E.coli扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.23～24所示，E.coli扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，E.coli扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

PM扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.25～26所示，PM扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，PM扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

MP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.27～28所示，MP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，MP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

CP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.29～30所示，CP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，CP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

ADV扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.31～32所示，ADV扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，ADV扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

SA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.33～34所示，SA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.85所示的标签序列，SA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

PDR-PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.35～36所示，PDR-PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.86所示的标签序列，PDR-PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

MRSA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.37～38所示，MRSA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.87所示的标签序列，MRSA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

MDR-AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.39～40所示，MDR-AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.88所示的标签序列，MDR-AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

AB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.41～42所示，AB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.89所示的标签序列，AB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

PA扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.43～44所示，PA扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.90所示的标签序列，PA扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

LP扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.45～46所示，LP扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.91所示的标签序列，LP扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；

TB扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.47～48所示，TB扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.92所示的标签序列，TB扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标模板，所述内标模板的碱基序列如SEQ ID NO.84所示；所述扩增引物对还包括内标扩增引物对，所述内标扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO.49～50所示，内标扩增引物对的正向引物5’端还连接有如SEQ ID NO.93所示的标签序列，内标扩增引物对的反向引物5’端还连接有第一显色标记物；所述硝酸纤维膜上还附着有内标探针，所述内标探针的碱基序列如SEQ ID NO.59所示；所述第一显色标记物为生物素，第二显色标记物为链霉亲和素，微球为富集后显示蓝色的乳胶微球。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应液、引物溶液、酶液、阴性质控品、阳性质控品、杂交显色液、杂交膜条和干燥剂；所述反应液包括PCR缓冲溶液、金属阳离子和纯化水，所述酶液包括逆转录酶、热启动Taq酶和UNG酶，所述阴性质控品为无菌生理盐水，所述阳性质控品为含检测病原体目的扩增序列的克隆菌液或假病毒颗粒，所述病原体目的扩增序列的碱基序列如SEQ ID NO.60～83所示；

所述引物溶液分成引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш的组分均包括扩增引物对、内标模板和dUTP plus dNTP Mixture；引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有IFA扩增引物对、KPN扩增引物对、SA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有hMPV扩增引物对、SP扩增引物对、PDR-PA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有PIV扩增引物对、HI扩增引物对、MRSA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有RSV扩增引物对、E.coli扩增引物对、MDR-AB扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有HRV扩增引物对、PM扩增引物对、AB扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有COV扩增引物对、MP扩增引物对、PA扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有CP扩增引物对、IFB扩增引物对、LP扩增引物对中的一个，引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш均只能含有HBoV扩增引物对、ADV扩增引物对、TB扩增引物对中的一个；引物溶液Ⅰ、引物溶液Ⅱ和引物溶液Ш中除内标扩增引物对外不存在相同引物。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述金属阳离子的浓度为1～3mM，Taq酶的浓度为0.5～5U，UNG酶的浓度为0.05～0.5U，所述克隆菌液的浓度为1×10⁴cfu/ml，假病毒的浓度为1×10⁴copies/ml，所述内标模板的浓度为1×10⁵copies/ml，扩增引物对中每种引物的浓度为0.1～1.0μM，dUTP plus dNTP Mixture的浓度为0.2～2mM；

P1～P8相邻探针之间的固定距离为0.5～1.0mm，P0与P1之间的固定距离为0.6～0.8mm。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，引物溶液Ⅰ中的扩增引物对由IFA扩增引物对、hMPV扩增引物对、PIV扩增引物对、RSV扩增引物对、HRV扩增引物对、COV扩增引物对、IFB扩增引物对、HBoV扩增引物对和内标扩增引物对组成，

引物溶液Ⅱ中的扩增引物对由KPN扩增引物对、SP扩增引物对、HI扩增引物对、E.coli扩增引物对、PM扩增引物对、MP扩增引物对、CP扩增引物对、ADV扩增引物对和内标扩增引物对组成，

引物溶液Ш中的扩增引物对由SA扩增引物对、PDR-PA扩增引物对、MRSA扩增引物对、MDR-AB扩增引物对、AB扩增引物对、PA扩增引物对、LP扩增引物对、TB扩增引物对和内标扩增引物对组成。

Images