CN109970720B - 一种Aurora A蛋白抑制剂及其制备方法和药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Aurora A蛋白抑制剂及其制备方法和药物用途，具体公开了一种式I所示的化合物及其药学上可接受的盐，

还公开了式I化合物或其可药用的盐，或者含有所述式I化合物或其可药用的盐的组合物作为Aurora A蛋白激酶抑制剂的用途，以及制备治疗或预防细胞过度增殖性疾病的药物中的用途。

Description

一种Aurora A蛋白抑制剂及其制备方法和药物用途

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种Aurora A蛋白抑制剂及其制备方法和药物用途。

背景技术

Aurora A是Aurora蛋白激酶家族成员，是一类在细胞增殖起重要作用的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞有丝分裂的很多过程，包括细胞G2/M转换、有丝分裂纺锤体的装配、染色单体分离和胞质分裂等过程，对细胞有丝分裂过程起重要的调控作用。研究发现，人的Aurora A基因坐落于20号染色体q13区域，这个区域在乳腺癌扩增很频繁，在许多类型肿瘤中也是高表达。Aurora A从中性体复制开始到有丝分裂结束一直都在中心体上。Aurora A的异常表达会导致细胞中心体扩增、基因组的非整倍性和染色体不稳定性。由于Aurora A在很多类型肿瘤中异常表达，所以Aurora A是治疗有关肿瘤的潜在靶点。

Aurora蛋白激酶家族在很多类型的肿瘤发生发展过程起到重要作用，因而Aurora蛋白激酶抑制剂能起到杀伤癌细胞的作用。其中，抑制Aurora A激酶活性会导致细胞周期停滞在G2/M期，并导致不正常的有丝分裂纺锤体，并最终引起细胞凋亡。Aurora A和相关肿瘤发生发展的机制仍然不明确，只有很少抑制剂在研究中。如ZM447439、VX-680/MK-0457、PHA-680632、Compound 677、AT9283、MLN8054、MLN8237、JNJ-7706621等，以上这些Aurora A蛋白激酶抑制剂有些已经进入了临床试验阶段，有些还有待进一步改进。相信在Aurora A蛋白激酶在正常细胞和肿瘤细胞中的有关机制被研究得更加明确后，新的抑制剂会陆续开发出来，并能应用于肿瘤的临床治疗。

Aurora A蛋白激酶抑制剂最初设想是用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌等实体瘤，而且有许多不同化学结构的Aurora A蛋白激酶抑制剂被用于临床试验阶段，但对于这些实体瘤只有有限的治疗效果，这很大可能和实体瘤增殖相对缓慢有关，所以对于相对增殖快且同质性的实体瘤才有显著疗效。Aurora A蛋白激酶抑制剂发挥疗效需要几个细胞周期和有丝分裂的时间，在快速增殖的骨髓细胞抑制效果明显，但是在患者停止药物治疗后，肿瘤可能会重新增殖。几乎所有Aurora A蛋白激酶抑制剂都能对其他类型的激酶产生抑制作用，如上述的MK-0457还对FLT3和ABL激酶有抑制作用。特异性问题是制约AuroraA蛋白激酶抑制剂应用的一大因素，而恶性肿瘤对小分子药物的耐药性也是一大问题。因此，开发新型的Aurora A蛋白激酶抑制剂是本领域亟需解决的技术问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能靶向Aurora A基因启动子区域从而抑制Aurora A蛋白表达及功能的抑制剂及其制备方法并将其用于治疗细胞过度增殖性疾病。

本发明一个方面提供了一种式I所示的化合物及其药学上可接受的盐，

本发明的再一方面提供含有所述式I化合物的组合物，其包含作为活性成分的式I化合物。

本发明的再一方面提供式I化合物或含有所述式I化合物的组合物作为Aurora A蛋白激酶抑制剂的用途。

本发明的再一方面提供式I化合物或含有所述式I化合物的组合物在制备AuroraA蛋白激酶抑制剂中的用途。

本发明的再一方面提供式I化合物或含有所述式I化合物的组合物在制备治疗或预防细胞过度增殖性疾病的药物中的用途。

在本发明的技术方案中，所述的细胞过度增殖性疾病包括结肠癌、直肠癌、脑瘤、肺癌、表皮鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、胃癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种；优选地，所述的细胞过度增殖性疾病包括乳腺癌、肺癌或宫颈癌。

本发明的再一方面提供式I化合物或含有所述式I化合物的组合物作为制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。

本发明再一方面提供所述Aurora A蛋白激酶抑制剂及其制备方法与应用，旨在提供一种制备工艺简单、作用方式独特、抗肿瘤效果明显的Aurora A蛋白激酶抑制剂。本发明所公开的Aurora A抑制剂Py-Im-Ht为带有Hoechst 33258基团的吡咯-咪唑类聚酰胺化合物，能特异结合Aurora A基因转录启动子区域中的DNA序列，抑制Aurora A的基因转录和蛋白表达，造成肿瘤细胞生长抑制或凋亡。其制备方法是以Boc保护的氨基酸为原料，通过固相多肽合成方法，经多步反应得到Py-Im-Ht。其可作为预防或治疗细胞过度增殖性疾病的候选药物。

本发明再一方面提供所述式I化合物的制备方法，其包含如下步骤：

1)脱除肼树脂上的Fmoc保护基，并与Boc-Py-OH通过酰胺键偶联；

2)依次偶联主链基团，偶联主链基团通过脱Boc保护、偶联循环进行获得式1化合物；

3)脱除Fmoc保护基，并偶联Hoechst33258；

4)以3-二甲氨基丙胺裂解肼树脂获得聚酰胺，同时3-二甲氨基丙胺与聚酰胺偶联，得到终产物。

在本发明的技术方案中，脱除Fmoc保护基时所用的试剂为20％哌啶/DMF溶液、……。

在本发明的技术方案中，脱除Boc保护基时所用的试剂为TFA/TIS/H₂O溶液、……。

在本发明的技术方案中，其中步骤1)为通过20％哌啶/DMF溶液脱除肼树脂上的Fmoc保护基；将Boc-Py-OH在缩合剂和碱剂的作用下与脱除Fmoc保护基的肼树脂通过酰胺键偶联。

在本发明的技术方案中，其中步骤2)为通过脱Boc保护、偶联循环进行，直至得到前体1化合物；

在本发明的技术方案中，其中步骤2)中偶联的顺序依次为Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Boc-Im-OH、Fmoc-D-Dab(Boc)-OH、Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Im-OH。

在本发明的技术技术方案中，脱Boc保护的方法为通过TFA/TIS/H₂O溶液处理进行脱除。

在本发明的技术技术方案中，偶联Boc-Py-OH的方法为Boc-Py-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应。

在本发明的技术技术方案中，偶联Boc-Im-OH的方法为将Boc-Im-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应。

在本发明的技术技术方案中，偶联Fmoc-D-Dab(Boc)-OH的方法为将Fmoc-D-Dab(Boc)-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应。

在本发明的技术技术方案中，偶联Im-OH的方法为将Im-OH缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应。

在本发明的技术方案中，每一步的偶联反应后进行茚三酮检测，确定是否反应完全。偶联反应时，取出少量树脂，DMF洗两遍，加入两滴茚三酮检测液(茚三酮15g,乙酸3ml,正丁醇100ml),90℃加热3min，树脂不发生颜色变化表明反应完全。树脂由红变蓝表明存在初级氨。

在本发明的技术方案中，其中步骤3)为脱除Fmoc-D-Dab-上的Fmoc保护基，并在缩合剂以及碱剂的作用下与Hoechst33258进行偶联反应。

在本发明的技术技术方案中，所述的缩合剂为三光气、DC·HCl、EDIC、DCC、DIC、DMTMM+BF4^-、DMTMM+Cl^-、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、BOP-Cl、PyBOP、PyAOP、OxymaPure、DPPA、FDP和FDPP中的一种或多种的组合物。

在本发明的技术技术方案中，所述的碱剂为三甲基吡啶、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、二甲基吡啶(DMAP)、三乙胺(NMM)和2-甲基喹啉中的一种或多种的组合。

在本发明的技术技术方案中，其中步骤4)为以3-二甲氨基丙胺和醋酸铜裂解肼树脂获得聚酰胺，同时3-二甲氨基丙胺与聚酰胺偶联，得到终产物式I所示化合物。

本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其包含式I所示化合物或其可药用的盐。

本发明中的缩写具有如下意义：

Boc:t-butyloxycarbonyl，叔丁氧羰基；Fmoc:fluorenylmethyloxycarbonyl，芴甲氧羰基；HOAt:1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；DMF:N,N-二甲基甲酰胺；THF:四氢呋喃；DIEA:N,N-二异丙基乙胺；TFA:三氟乙酸；TIS：三异丙基硅烷；PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。

Py：吡咯，Im：咪唑，Boc-Py-OH：4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酸，Boc-Im-OH：4-[(叔丁氧基甲酰基)氨基]-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸，Fmoc-D-Dab(Boc)-OH：N-ALPHA-芴甲氧羰基-N-GAMMA-叔丁氧羰基-D-二氨基丁酸，Dab：1,4-二氨基丁酸；Im-OH：1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸；Hoechst 33258：2’-(4-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5’-二-1H-苯并咪唑。

有益效果

1、Py-Im-Ht为吡咯-咪唑类聚酰胺化合物，能够特异性识别且高强度的结合于图3A所示的Aurora A基因转录启动子区域中的DNA序列，抑制Aurora A基因的转录，抑制Aurora A蛋白的表达，造成肿瘤细胞生长抑制或凋亡。

2、Py-Im-Ht带有Hoechst 33258基团，能通过荧光显微镜实时监测分子的分布情况，同时还具有较好的细胞膜及核膜穿透性，且增强与靶向核酸序列的选择性及结合力。

3、Py-Im-Ht能够抵抗核酸酶水解，克服了寡核苷酸以及小分子RNA有效作用时间短的问题。

4、Py-Im-Ht直接作用于Aurora A基因转录启动子区域中的序列，不同于小分子抑制剂作用于激酶蛋白分子，因此克服了小分子激酶抑制剂的耐药性难题。

附图说明

图1为式I化合物(Py-Im-Ht)合成路线示意图。

图2为式I化合物(Py-Im-Ht)的HRMS图。

图3为式I化合物(Py-Im-Ht)抑制人宫颈癌细胞(HeLa)及人肺癌细胞(A549)中Aurora A蛋白表达。

图4为式I化合物(Py-Im-Ht)抑制肿瘤细胞的增殖及细胞周期。

图5为式I化合物(Py-Im-Ht)抑制体内皮下移植瘤的生长。

图6为式I化合物(Py-Im-Ht)能渗透进入肿瘤组织内，抑制Aurora A蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。

具体实施方式

实施例1：合成Py-Im-Ht(合成路线见图1)

1.前体1的合成

于一个50mL的固相反应器中加入肼树脂(0.61mmol/g，400mg，0.244mmol)及二氯甲烷(3ml)，溶胀树脂20min。抽除二氯甲烷，将20％哌啶/DMF溶液(3ml)加入树脂中，鼓气5min,抽去溶剂，再加入20％哌啶/DMF溶液(3ml)，鼓气5min,抽去溶剂，用DMF(4x 3mL)洗涤树脂。将Boc-Py-OH(234mg，0.976mmol,4eq.)和三光气(BTC，95mg，0.322mmol,0.33eq)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(collidine，284μL，2.928mmol,12eq.)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mL DIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到脱除保护基的苯肼树脂中，N2鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，茚三酮试剂检测至反应完全，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂。再用无水DMF(3mL)洗涤树脂。向树脂中加入特戊酸酐(186μL,0.976mmol,4eq.)和DIEA(500μL,2.88mmol，12eq.)的DMF(2mL)溶液，反应15min，抽除反应液，用DMF(4x 3mL)洗涤树脂，最后用DCM(2x 3mL)洗涤树脂。

第一个氨基酸连接至树脂后，随后肽链上每一个氨基酸的加入都通过脱保护、偶联循环进行，直至得到前体1。脱保护，氨基酸的偶联，茚三酮的检测方法如下：

方法A：Boc脱保护

TFA/TIS/H₂O溶液(95:2.5:2.5,3ml)加入树脂中，鼓气2min,抽去溶剂，再加入TFA/TIS/H₂O溶液(95:2.5:2.5,3ml)，鼓气20min,抽去溶剂，先用DCM(2x 3mL)洗涤树脂，再用DMF(4x 3mL)洗涤树脂，最后用无水(2x 3mL)洗涤树脂。

方法B：Boc-Py-OH的偶联

将Boc-Py-OH(234mg，0.976mmol,4eq.)和三光气(95mg，0.322mmol,0.33eq)溶于2mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(284μL，2.928mmol,12eq.)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，再加入2mL DIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到脱除保护基的苯肼树脂中，N2鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h，茚三酮试剂检测至反应完全，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂。再用DCM(2×3mL)洗涤树脂。

方法C：Boc-Im-OH(或Fmoc-D-Dab(Boc)-OH)的偶联

将Boc-Im-OH(235mg,0.976mmol,4eq.)(或Fmoc-D-Dab(Boc)-OH(429mg，0.976mmol，4eq.)和三光气(95mg，0.322mmol,0.33eq)溶于1mL无水THF，向该溶液中缓慢滴加三甲基吡啶(284μL，2.928mmol,12eq.)，反应立即产生大量白色沉淀，加完反应3min，加入HOAt(133mg，0.976mmol，4eq.)，再加入2mL DIEA/DMF溶液(5％,v/v)，白色沉淀完全消失，将该反应液转移到树脂中，N2鼓泡混匀，缩合反应0.5～1h(茚三酮试剂检测至反应完全)，抽除反应液，用DMF(4×3mL)洗涤树脂，再用DCM(2×3mL)洗涤树脂。

方法D：Im-OH的偶联

将Im-OH(120mg,0.976mmol，4eq.)和PyBOP(506mg,0.976mmol，4eq.)溶于无水DMF(2ml)，向该溶液中加入DIEA(400μL,2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清。将该反应液转移到脱除Boc的肼树脂中，反应0.5～1h(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用DMF(4x3mL)洗涤树脂。

方法E：茚三酮检测

偶联反应时，取出少量树脂，DMF洗两遍，加入两滴茚三酮检测液(茚三酮15g,乙酸3ml,正丁醇100ml),90℃加热3min，树脂不发生颜色变化表明反应完全。树脂由红变蓝表明存在初级氨。

2.前体2的制备

前体1用20％哌啶/DMF溶液((2x 3mL，5min)脱除Fmoc保护基，然后用DMF(4x 3mL)洗涤树脂，再用无水DMF(3mL)洗涤树脂，备用。同时将Hoechst 33258酸(373mg,0.732mmol,3eq.)和PyBOP(380mg,0.732mmol，3eq.)溶于无水DMF(2ml)，向该溶液中加入DIEA(400μL,2.2mmol，9eq.)，搅拌至溶液澄清。将该反应液转移到脱除Fmoc的肼树脂中，N₂鼓泡混匀，反应2h(茚三酮试剂检测至反应完全)。抽除反应液，用DMF(4x 3mL)洗涤树脂，得到前体2

3.终产物Py-Im-Ht

前体2中加入少量DMF，醋酸铜，3-二甲氨基丙胺，过夜震荡，然后用半制备型HPLC纯化，收集产物，旋转蒸发除去乙腈，得到的溶液冷冻干燥，最终获得Py-Im-Ht。HRMS(ESI)m/z:calcd for C84H96N27O11[M+H]+1658.7783,found 1658.7794；[M+2H]2+829.8930,found829.9167；[M+3H]3+553.5979,found 553.5995，具体质谱图见图2。

实施例2：Py-Im-Ht抑制肿瘤细胞(HeLa和A549)中Aurora A蛋白表达实验

分别取处于对数生长期的Hela细胞及A549细胞，按每孔1mL(含5万个细胞)接种于12孔板中，置于37度，5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时；吸除原培养基，分别加入含有不同浓度化合物2的DMEM高糖培养基中，使每孔的药物浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM；将细胞重新放入培养箱中孵育72小时；吸除培养基，用0.25％胰蛋白酶室温消化1min，用新鲜DMEM培养基重悬细胞，3000rpm离心3分钟，收集细胞，用冰冷的PBS清洗两次。去除PBS，5000rpm离心3分钟，加RIPA裂解液，冰上孵育2小时，4度13000rpm离心15min，收集上清液，利用BCA法测量蛋白浓度，加相应裂解液，使各组蛋白浓度一致。配置10％的SDS-PAGE蛋白分离胶和5％的SDS-PAGE蛋白浓缩胶；取50μg总蛋白80v电压跑胶分离样品，200mA恒流转膜2h。将膜浸泡于5％脱脂牛奶封闭液，室温封闭1小时。加一抗Aurora A(稀释比1：3000)和GAPDH(1：20000)，4度慢摇过夜。用PBST清洗3次，加HRP标记的二抗(稀释比1：3000)，室温1小时孵育；然后在暗室进行显色曝光；所得结果如图9所示，从图3A中可以看出Py-Im-Ht能够有效地抑制HeLa和A549细胞中Aurora A的表达，且抑制效率与药物浓度呈正相关，并且以看家基因GAPDH作为Western印迹实验中的内参，以证明不同样品中的蛋白检测时上样量相同。此外，Py-Im-Ht能明显抑制诺考达唑(Noc.)对Aurora A的诱导作用(图3B)，进一步说明了其对Aurora A表达的抑制作用强。

实施例3：Py-Im-Ht抑制肿瘤细胞增殖及细胞周期的实验

取处于对数生长期的肿瘤细胞(HeLa、A549或MDA-MB-231)，按每孔1mL(含10万个细胞)接种于6孔板中或每孔0.1mL(含5000个细胞)接种于96孔板中，置于37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时；吸除原培养基，分别加入含有不同浓度Py-Im-Ht的DMEM高糖培养基中；将细胞重新放入培养箱中孵育48小时至72小时，采用显微镜统计最终的细胞数量及各分裂时期细胞数量或采用CCK-8试剂盒测定细胞活力，所得结果如图4所示。可以看出，随着药物作用时间的延长，Hela细胞和A549细胞的数量明显减少(图4A&B)，说明药物能有效抑制肿瘤细胞的增殖作用。并且，Py-Im-Ht对三种肿瘤细胞(HeLa、A549及MDA-MB-231)的半数有效抑制浓度为4～16μM(图4C)。此外，Py-Im-Ht使A549细胞处于前期的细胞明显增多(图4D)，而处于中期及后期/末期的细胞显著减少(图4D)，说明其阻滞了细胞周期，这与Aurora A在细胞周期调控中的关键作用一致。

实施例4：Py-Im-Ht抑制非小细胞肺癌和乳腺癌肿瘤细胞在荷瘤小鼠中的增殖实验

将人A549细胞及MDA-MB-231细胞接种在10cm塑料培养皿中，完全培养基使用DMEM高糖，其含10％FBS和10％双抗(氯霉素/链霉素)；待A549细胞生长密度达到90％左右，吸除培养基，用0.25％胰蛋白酶(trypsin)于37℃消化2分钟；每个10cm培养皿加入完全培养基4mL，终止胰蛋白酶活性；轻轻吹打，将贴壁细胞全部吹散为悬浮细胞；在离心机中，用1000rpm的速度离心3分钟，去除上清液，用PBS重悬细胞；用血球计数板计算细胞浓度，加适量PBS，将细胞浓度调整至2.0×10⁷个/ml。取1mL注射管，吸取1mL细胞悬浮液，在每只裸鼠的右侧腋下接种400万细胞，即200μl细胞悬浮液；接种完细胞后，将裸鼠放回饲养笼。待肿瘤大小长到约200mm³，边长5～8mm时，开始进行给药。将Py-Im-Ht溶解在生理盐水中(0.9％NaCl)，每三天瘤周注射给一次药，药物的剂量为1mg/Kg，以空白溶剂作为对照组。第7次后，隔天处死小鼠并收集肿瘤样本。与对照组相比，Py-Im-Ht组裸鼠体内接种的人A549肺癌细胞和人MDA-MB-231乳腺细胞移植瘤的体积显著变小(图5，其中A549肿瘤组为两次实验的结果)，说明Py-Im-Ht能明显抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的增殖。

实施例5：Py-Im-Ht影响肿瘤组织中Aurora A表达及细胞凋亡实验

将实施例4所取肿瘤样本用多聚甲醛固定后切片：①405nm荧光显微镜下观测Py-Im-Ht是否渗透进入肿瘤组织细胞内；②采用Aurora A抗体进行免疫组化染色，检测Py-Im-Ht是否抑制肿瘤中Aurora A蛋白的表达；③采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测Py-Im-Ht是否诱导肿瘤凋亡。如图6所示，两种肿瘤移植瘤模型的Py-Im-Ht组中均能够观测到Hoechst33258的信号，免疫组化结果显示Aurora A蛋白表达下降，TUNEL法能检测到明显的荧光信号。以上结果表明Py-Im-Ht能有效渗透进入肿瘤组织细胞内，结合至Aurora A启动子并抑制其转录和蛋白表达，并诱导肿瘤凋亡。

实施例6

采用SPR(surface plasmon resonance analysis using a Proteon XPR36(Bio-Rad,California,USA))对Py-Im-Ht与Aurora A基因转录启动子区域DNA序列结合位置以及强度进行测定，其中，所述Aurora A基因转录启动子区域具有如下DNA序列：

GTCTGGCTGGCCGTTGGCTCCACCACTTCCGG

GGGAGCAAGTGCGCCTGCGCGCGGTGTGCGCCCTTAAACGCGACTCAAGGCGTCGGGT

测试结果表明Py-Im-Ht能与上述DNA序列中下划线部分

发生特异性结合，并且Py-Im-Ht与靶标DNA的结合非常强，亲和力达到纳摩尔水平，KD值达到8.3×10^-8。

Claims (14)

1.一种式I所示的化合物及其药学上可接受的盐，

2.含有所述式I化合物或其可药用的盐的组合物，其包含作为活性成分的式I化合物或其可药用的盐，

3.式I化合物或其可药用的盐、 或者含有所述式I化合物或其可药用的盐的组合物在制备Aurora A蛋白激酶抑制剂中的用途，

4.式I化合物或其可药用盐、 或者含有所述式I化合物或其可要用盐的组合物在制备治疗或预防细胞过度增殖性疾病的药物中的用途，

5.根据权利要求4所述的用途 ，所述的细胞过度增殖性疾病为结肠癌、直肠癌、脑瘤、肺癌、表皮鳞癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、胃癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、甲状腺癌、头颈癌、前列腺癌、神经胶质瘤及鼻咽癌中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的用途 ，所述的细胞过度增殖性疾病为乳腺癌、肺癌或宫颈癌。

7.式I化合物或其可药用盐、 或者含有所述式I化合物或其可要用盐的组合物在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的用途；

8.式I化合物的制备方法，其包含如下步骤：

1)脱除肼树脂上的Fmoc保护基，并与Boc-Py-OH通过酰胺键偶联；

2)依次偶联主链基团，偶联主链基团通过脱Boc保护、偶联循环进行获得式1化合物

3)脱除Fmoc保护基，并偶联Hoechst33258；

4)以3-二甲氨基丙胺裂解肼树脂获得聚酰胺，同时3-二甲氨基丙胺与聚酰胺偶联，得到终产物；

Hoechst 33258为2’-(4-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5’-二-1H-苯并咪唑；

Boc-Py-OH为4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸。

9.根据权利要求8所述的制备方法，步骤2)为通过脱Boc保护、偶联循环进行，直至得到前体1化合物；

Boc为叔丁氧羰基。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其中步骤2)中偶联的顺序依次为Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Boc-Im-OH、Fmoc-D-Dab(Boc)-OH、Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Boc-Py-OH、Im-OH；

Boc-Py-OH为4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸；

Boc-Im-OH为4-[(叔丁氧基甲酰基)氨基]-1-甲基-1H-咪唑--2-甲酸；

Fmoc-D-Dab(Boc)-OH为N-ALPHA-芴甲氧羰基-N-GAMMA-叔丁氧羰基-D-二氨基丁酸；

Im-OH为1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，脱Boc保护的方法为通过TFA/TIS/H₂O溶液处理进行脱除；

偶联Boc-Py-OH的方法为Boc-Py-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应；

偶联Boc-Im-OH的方法为将Boc-Im-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应；

偶联Fmoc-D-Dab(Boc)-OH的方法为将Fmoc-D-Dab(Boc)-OH在缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应；

偶联Im-OH的方法为将Im-OH缩合剂和碱剂的作用下与待偶联的肼树脂-肽链进行偶联反应；

Boc-Py-OH为4-叔丁氧羰基氨基-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸；

Boc-Im-OH为4-[(叔丁氧基甲酰基)氨基]-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酸；

Fmoc-D-Dab(Boc)-OH为N-ALPHA-芴甲氧羰基-N-GAMMA-叔丁氧羰基-D-二氨基丁酸；

Im-OH为1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸。

12.根据权利要求11所述的制备方法，所述的缩合剂为三光气、DC·HCl、EDIC、DCC、DIC、DMTMM⁺BF₄ ^-、DMTMM⁺Cl^-、HATU、HBTU、HCTU、HOAt、HOBt、BOP、BOP-Cl、PyBOP、PyAOP、OxymaPure、DPPA、FDP和FDPP中的一种或多种的组合物。

13.根据权利要求11所述的制备方法，所述的碱剂为三甲基吡啶、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、二甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、三乙胺和2-甲基喹啉中的一种或多种的组合。

14.根据权利要求8-13任一项所述的制备方法，其中，其中步骤4)为以3-二甲氨基丙胺和醋酸铜裂解肼树脂获得聚酰胺，同时3-二甲氨基丙胺与聚酰胺偶联，得到终产物式I所示化合物。

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