CN109963620A - 细胞靶向缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物，并且其中至少90％的缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为4或更低。本发明还涉及包括所述细胞靶向缀合物的药物组合物，以及所述缀合物和组合物作为药物的用途，特别是用于治疗癌症的用途。
Description
技术领域
本发明涉及细胞靶向缀合物，其包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中接头包括过渡金属络合物。本发明还涉及包括所述细胞靶向缀合物的药物组合物，以及所述药物组合物和所述细胞靶向缀合物的医学用途。
背景技术
绝大多数可用的生物缀合技术依赖于有机接头与蛋白质的共价偶联。主要实例是包含分别用于与赖氨酸或半胱氨酸残基偶联的反应性酯或马来酰亚胺的接头。在细胞靶向缀合物(也称为抗体药物缀合物或ADC)的领域中，两种接头已经成功应用于临床批准的ADCKadcylaTM(阿多曲妥珠单抗依酯，ado-trastuzumab emtansine，T-DM1)和AdcetrisTM(贝伦妥单抗-维多汀)。
尽管使用Adcetris和Kadcyla取得了一些成功，但是细胞靶向缀合物的设计和开发领域的专家认识到，应用于这些细胞靶向缀合物中的两种类型的接头在细胞靶向缀合物的功效和耐受性方面具有次优品质。因此，通常针对接头和缀合策略的许多开发程序旨在改善细胞靶向缀合物的功效和耐受性。
在抗体和有效负载物(payload，下文称为官能部分)诸如治疗性化合物或诊断化合物旁边，使用的接头系统是细胞靶向缀合物的三个主要组分之一，其决定靶向哪些细胞，如何释放官能部分(例如细胞毒性药物)，并且在官能部分是药物的情况下，细胞将通过何种作用机制被杀死。使用的接头系统可以在几个水平上影响细胞靶向缀合物的稳定性以及官能部分的释放，因此其对于细胞靶向缀合物的功效和毒性是至关重要的。
首先，在体内给药后，官能部分(例如细胞毒性药物)可能在循环中从抗体释放，导致官能部分(例如药物)被汇集在正常组织中。其次，抗体本身可能通过与一个或多个官能部分(例如细胞毒性药物)的缀合而不稳定，导致更快的完整的缀合物的血液清除，并且被汇集在分解代谢器官如肝脏和脾中。这种现象例如在药物与赖氨酸和半胱氨酸残基的随机缀合时观察到，这导致根据泊松分布的不均匀的药物-抗体比率(DAR)，更高DAR的缀合物更快速地被清除(7-9)。
第三，在细胞通过靶点依赖性或靶点独立性机制摄取ADC以及随后的分解代谢之后，官能部分可以分离并最终从细胞中释放。如果官能部分是细胞毒性药物，则该官能部分随后能够杀死相邻细胞但也能够引起毒性，这可能导致难以预测的功效和耐受性。
目前，为了开发具有改善的治疗窗口的细胞靶向缀合物，细胞靶向缀合物的开发者致力于通过化学手段或蛋白质工程修饰抗体的位点特异性缀合。然而，临床阶段中绝大多数细胞靶向缀合物仍然依赖于传统的诸如上述那些的缀合技术。用于位点特异性缀合的几种已知方法是1)通过mAb工程应用工程化的半胱氨酸或非天然氨基酸，2)应用酶促缀合，或3)在抗体的铰链区中重新桥接还原的半胱氨酸。
所有这三种方法都需要在有效负载物与抗体缀合之前修饰抗体。抗体修饰可能影响抗体的免疫学特性，导致不希望的毒性。此外，对于修饰的抗体，可以预见到关于上市许可的监管障碍。因此，鉴于此，获得能够与已经(或将要)获得监管批准的抗体组合使用的细胞靶向缀合物将是有益的。毕竟，可以避免关于抗体本身的不期望的毒性问题。此外，获得为了使用包括这种经批准的抗体的细胞靶向缀合物的上市许可所需的成本和时间将大量减少。
因此，迫切需要提供具有改善的功效和改善的药代动力学性质的细胞靶向缀合物的抗体缀合技术。也就是说，应尽量减少肝脏和网状内皮系统的摄取。由改进的抗体缀合技术提供的细胞靶向缀合物的免疫反应性应该低，并且药物-接头的连接和抗体-接头的连接应该足够稳定。此外，缀合后对其靶点的结合功效和缀合抗体的内化应该受到最小程度的影响，优选完全不受影响。
发明内容
因此，本发明的第一方面涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物，并且其中至少90％的缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为4或更低。
利用本发明，现已发现可以制备细胞靶向缀合物，其具有相对窄的官能部分对靶向部分的分布曲线，即在至少90％的缀合物中官能部分和靶向部分之间的比率(例如抗体)为4或更低。这是一个重要方面，因为其示出了靶向部分的仅有限数量的氨基酸参与了缀合，这意味着缀合针对特定的氨基酸。
对于其他类型的接头，观察到官能部分和靶向部分之间的比率范围非常宽，即抗体药物缀合物的DAR分布范围为从0至大于8。显然这些其他类型的接头与靶向部分(诸如抗体)的大量存在的氨基酸随机地偶联。因此，这些其他类型的接头和大量存在的氨基酸之间的结合强度可能有很大差异。这引起了人们的关注，因为一些官能部分(即细胞毒性药物)可能在过早阶段脱离靶向部分(例如抗体)。因为只有相对低剂量的这种细胞靶向缀合物可以使用，这引起了治疗窗口减小。此外，如果太多官能部分与靶向部分(例如抗体)结合，则所述部分可能因为网状内皮系统将其从循环中除去而不会到达靶位点。使用根据本发明的细胞靶向缀合物已经解决了该问题。
本发明的第二方面涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物且靶向部分抗体，并且其中至少70％的官能部分与抗体的Fc部分结合。
令人惊讶地发现，官能部分(通过接头)特定地与抗体的Fc部分连接。这是非常有利的，因为它可以防止相当大量的官能部分与抗体的抗原结合位点结合，这意味着结合靶点的位点(抗原结合位点)不会被官能部分“遮蔽”而妨碍与靶点位点的结合。
本发明的第三方面涉及包括药学上可接受的载体和如上所述的细胞缀合物的药物组合物。
本发明的第四方面涉及根据本发明的细胞靶向缀合物或根据本发明的药物组合物，用于作为药物的用途。
本发明的第五方面涉及根据本发明的细胞靶向缀合物或根据本发明的药物组合物，用于治疗癌症的用途，优选用于治疗乳腺癌或胃癌的用途。
本发明的第六方面涉及用于治疗癌症的方法，其中，癌症优选为乳腺癌或胃癌，该方法包括向有此需要的患者给药药学上有效量的根据本发明的细胞靶向缀合物或根据本发明的药物组合物。
本发明的最后一个方面涉及细胞靶向缀合物，用于作为药物的用途，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物。
定义
如本文所用的术语“接头”通常具有其常规含义，并且因此是指在靶向部分和官能部分之间形成桥状结构的化学部分，使得后两者彼此结合。
如本文所用的术语“官能部分”是指在离体或体内具有某种生物、化学、治疗和/或诊断功能的化学基团或分子。典型的官能部分是治疗性化合物(即药物)或诊断化合物(即示踪剂或染料)。
如本文所用的术语“靶向部分”是指特异性结合对的成员，即一对分子中的一个，其中，一对分子中的一个在其表面上具有与另一分子的特定空间和极性结构特异性结合的区域或腔，并且因此，定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补，使得该对具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物、IgG-蛋白A。
如本文所用的术语“特异性结合对”是指来自一对分子的成员，其中，该对分子中的一个在其表面上具有与另一分子的特定空间和极性结构特异性结合的区域或腔，并且因此定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补，使得该对的成员具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物、IgG-蛋白。
如本文所用的术语“靶向药物”是指与靶向部分诸如抗体偶联的药物。
如本文所用的术语“免疫反应性”具有其正常的科学含义，并且是指对特异性结合对的成员(诸如肽、抗体、抗体片段或纳米抗体(nanobody))的结合亲和力。
如本文所用的术语“官能部分与靶向部分的比率”涉及与靶向部分(例如抗体)结合(例如共价或通过配位键)的官能部分(诸如细胞毒性药物分子)的数量。在本领域中，术语“药物抗体比率”或“DAR”通常用于表示官能部分和抗体之间的这种比率。然而，从以上可以清楚地看出，除了抗体之外，根据本发明的靶向部分还可以是例如肽、抗体片段或纳米抗体。然而，也出于与这些类型的靶向部分(即非抗体)相关的易读性的原因，术语“DAR”将用于本发明。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物，并且其中至少90％的缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为4或更低(即1最多至4且包括4)。
由于窄且恒定的分布曲线，可以得出结论，只有少量靶向部分的氨基酸参与与接头的偶联。此外，这些特定氨基酸与接头之间的连接很强。这意味着在体内给药后，官能部分(通过所述接头与靶向部分连接)当其在循环中时不会从靶向部分释放。因此，避免了官能部分(例如细胞毒性药物)汇集于正常组织中。此外，位点限制性缀合是重要的，因为如果官能部分能够与太多不同的氨基酸连接，则靶向部分(例如抗体)的免疫反应性将受到官能部分的存在的影响。毕竟，在这种情况下，太多官能部分可能与一个靶向部分结合(即DAR将变得太高)，这可能显著降低靶向部分的免疫反应性。
鉴于本发明缀合物的有利性质，人们能够获得宽的治疗窗口。
此外，由于接头包括过渡金属络合物(诸如铂)的事实，所以靶向部分(诸如抗体)不需要修饰来促进接头和靶向部分之间的偶联。因此，靶向部分可以保留成已经提供了或申请了单独的上市许可的形式。因此，因为不需要检查对靶向部分(例如抗体)所做的改变，细胞靶向缀合物作为整体的监管批准时间可以显著降低。
优选地，至少50％的缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(也称为DAR)为2或3。本发明人已经发现，如果缀合物每个靶向部分(诸如抗体)包括2至3个官能部分，所述靶向部分的免疫反应性保持优良并且向目标组织提供足够的官能部分(诸如细胞毒性药物)。
在本发明的优选实施方式中，官能部分是治疗性化合物、诊断化合物或螯合剂。
特别优选的是，当官能部分是治疗性化合物时，其抑制细胞系统中的信号转导级联，干扰细胞骨架或嵌入DNA双螺旋中。进一步优选的是，官能部分具有抗炎、抗高血压、抗纤维化、抗血管生成、抗肿瘤、免疫刺激或诱导细胞凋亡的活性，优选治疗性化合物具有抗肿瘤活性。
根据本发明，官能部分可以是选自激酶抑制剂组或其前药的治疗性化合物。在本发明的另一实施方式中，激酶抑制剂是厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefinitib)、伊马替尼(imatinib)、己酮可可碱(pentoxifylline)、PDTC、PTKI、SB202190、瓦他拉尼(vatanalib)、LY364947、Y27632、AG1295、SP600125。
替代地，选择的官能部分是血管紧张素受体阻断剂，诸如氯沙坦。
替代地，官能部分是重组蛋白，诸如TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。替代地，官能部分是治疗性放射性核素，诸如β发射体90Y或177Lu，或α发射体211At。
替代地，官能部分是(超)毒性药物，选自紫杉烷类(taxanes)、蒽环类(anthracyclines)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)、卡奇霉素类(calicheamicins)、美登素类(maytansinoids)、澳瑞他汀类(auristatins)、微管溶素类(tubulysins)、倍癌霉素类(duocarmycins)、鹅膏毒肽类(amanitines)或吡咯并苯二氮卓类似物(pyrrolobenzodiazapine analogs)的组。
除了使用治疗性化合物作为官能部分之外，还可以使用诊断化合物。在替代实施方式中，官能部分是荧光染料，诸如IRDye800CW、DY-800、DY-831、Alexa fluor 750、Alexafluor 790和吲哚菁绿。
可以在本发明中用作官能部分的其他诊断化合物是放射性核素、PET可成像剂、SPECT可成像剂或MRI可成像剂。
还可以通过接头将作为官能部分的螯合剂偶联到靶向部分。这些螯合剂可以在与靶向部分偶联之前或之后负载治疗性或诊断性放射性核素或非放射性金属。可能的螯合剂是EDTA、DPTA和去铁胺(DFO)。然而，还可以将大环螯合剂，诸如DOTA或p-SCN-Bn-DOTA，用于偶联过渡金属PET放射性同位素，非放射性金属或过渡金属SPECT放射性同位素，诸如99mTc或195mPt。
替代地，使用多于一种的官能部分。这样就可以使不同的官能部分，例如，治疗性化合物的不同有用组合或有用的诊断化合物的不同组合与一个靶向部分结合。这样，可以将治疗性化合物的优选组合递送到目标组织。
为了获得具有足够稳定性的键用于体内应用，优选的是，靶向部分和/或官能部分包括一个或多个含硫反应性位点和/或一个或多个含氮位点。特别优选的是，官能部分，诸如治疗性化合物，包括一个或多个硫基团和/或一个或多个氮基团，优选杂环或脂族胺或芳族氮基团。
靶向部分优选为肽、抗体、抗体片段或纳米抗体。
靶向部分优选包括特异性结合对的成员，并且因此能够结合某些细胞或组织的独特部分。这样，靶向部分能够将通过接头与其附连的官能部分带到目标位置。
靶向部分可以包括抗体，诸如单克隆抗体，其衍生物或片段，或可以包括肽。
本文将抗体衍生物定义为已经改变的抗体，使得所得化合物的至少一种性质(优选抗原结合性质)在种类上基本相同，而不一定在量上相同。衍生物以多种方式提供，例如通过保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有通常相似性质(尺寸、疏水性等)的另一残基取代，使得整体功能可能不会受到严重影响。
抗体片段定义为具有至少一种与所述抗体在种类上相同而在量上不一定相同的性质的部分。所述官能部分能够如所述抗体一样结合相同的抗原，尽管不一定达到相同的程度。抗体片段优选包括单结构域抗体(也称为纳米抗体)、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab)'2片段。适当地，靶向部分是单克隆抗体，最优选地为选自已经显示出选择性肿瘤靶向能力的抗体组的单克隆抗体，诸如阿达木单抗(adalimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)和曲妥珠单抗(trastuzumab)或其组合。
替代地，靶向部分是抗体片段，诸如治疗性FAB，诸如雷珠单抗(ranibizumab)、双抗体、微抗体、结构域抗体、亲和抗体(affibody)、纳米抗体，诸如ALX-0651，或模拟抗体(anticalcin)。
接头优选包括铂络合物。铂络合物可以是反式铂络合物，或者它可以是顺式铂络合物。顺式铂络合物是优选的，并且优选包括惰性二齿部分作为稳定桥。在另一实施方式中，(铂)络合物包括三齿部分作为稳定桥。
根据本发明，包括这种接头的本发明的细胞靶向缀合物的4或更低的相对低的官能部分与靶向部分的比率(DAR)有助于细胞靶向缀合物的优异免疫反应性。例如，双官能铂(II)络合物乙二胺二氯化铂(II)(下文中也称为“Lx”接头)，一种包括铂络合物并且还包括惰性二齿部分的接头成功应用于本发明的改进的细胞靶向缀合物中。
例如，本发明的稳定且有效靶向的细胞靶向缀合物是包括通过双官能铂(II)络合物乙二胺二氯化铂(II)接头与4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)荧光团缀合的mAb曲妥珠单抗的缀合物。
如前所述，根据本发明，本发明的抗体药物缀合物的许多优点之一是在官能部分通过接头偶联之前，不需要修饰靶向部分(例如，肽、抗体或其片段或纳米抗体)。由于修饰肽或抗体的氨基酸侧链具有肽、纳米抗体或抗体的构象变化的风险，其修饰可能导致肽、抗体或纳米抗体的靶向能力丧失。此外，如果修饰位于靶向部分的结合位点区域，则修饰肽、抗体或纳米抗体可能导致对靶细胞的亲和力降低或甚至丧失靶向能力。
因此，在一种实施方式中，本发明涉及根据本发明的细胞靶向缀合物，其中，肽、抗体、其抗体片段或纳米抗体没有为了在肽、抗体、其抗体片段或纳米抗体中引入接头的偶联位点而被修饰。
令人惊讶的是，本发明人发现本发明的细胞靶向缀合物的高且有益的稳定性以及本发明的细胞靶向缀合物的靶向部分的有益的高度维持的细胞靶向能力是由于官能部分主要通过缀合的接头(优选所谓的“Lx接头”)与抗体的重链结合，其中，靶向部分是抗体。也就是说，由于，特别地抗体和官能部分的缀合侧的位置主要位于抗体的重链上，本发明的细胞靶向缀合物在细胞靶向和在靶细胞(例如癌细胞)的预期位点递送官能部分特别有效，其中，靶向部分是抗体。发现至少89％的官能部分与本发明的细胞靶向缀合物中的抗体重链结合。此外，发现至少87％的官能部分与本发明的细胞靶向缀合物中的抗体重链的Fc部分结合。
因此，具有作为靶向部分的抗体的本发明的细胞靶向缀合物，具有4或更低的低DAR是本发明的一部分，其中，官能部分主要与抗体的重链结合，优选地主要与重链的Fc部分结合。因此，在本发明的一种实施方式中，至少70％，优选至少80％的官能部分与用作靶向部分的抗体的Fc部分结合。
鉴于以上所述，本发明的第二方面涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，接头包括过渡金属络合物，并且靶向部分抗体，并且其中至少70％的官能部分与抗体的Fc部分结合。
在本发明的优选实施方式中，至少80％，优选至少85％官能部分与抗体的Fc部分结合。
关于这些细胞靶向缀合物，明确注意到细胞靶向缀合物的靶向部分、官能部分和接头以及其他特征可以如上文关于本发明的第一方面所述。
本发明的第三方面和第四方面涉及药物组合物，包括已经如上文关于本发明的第一方面和第二方面所述的细胞靶向缀合物(或其混合物)。药物组合物另外包括药学上可接受的载体。
根据本发明，术语“药物组合物”涉及包括如上所述的稳定的细胞靶向缀合物的组合物。此类药物组合物包括治疗有效量的这些稳定的细胞靶向缀合物和药学上可接受的载体。
可以使用生理学上可接受的载体向患者给药这些药物组合物。如本文所用的术语“载体”是指与治疗剂一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。这种药物载体可以是无菌液体，诸如水。当静脉内给药药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可包括少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。
这些药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂的形式。该组合物可以使用传统的粘合剂和载体诸如甘油三酯配制成栓剂。
合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中。这种组合物包括治疗有效量的细胞靶向缀合物以及适量的载体，以便为患者提供适当的给药形式。制剂应符合给药模式。
在另一种优选的实施方式中，药物组合物按照常规程序配制成适合静脉给药于人类的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是以无菌等渗水性缓冲液形式的溶液。一般，成分单独提供或以单位剂量形式混合在一起提供，例如，作为在标明活性剂数量的气密密封容器诸如安瓿或药囊中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将要通过输注给药时，可以用盛有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行配药。当通过注射给药组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，使得成分可以在给药之前混合。
适用于口服和局部使用的药物级有机或无机载体和/或稀释剂可用于制备包括治疗活性化合物的组合物。该组合物还可包括下列中的一种或多种：载体蛋白，诸如血清白蛋白；缓冲液；填料诸如微晶纤维素、乳糖、玉米淀粉和其他淀粉；粘合剂；甜味剂和其他调味剂；着色剂和聚乙二醇。添加剂在本领域中是众所周知的并且用于各种制剂。
本发明的第五方面涉及用作药物的上述细胞靶向缀合物或药物组合物。所述缀合物和其药物组合物特别适用于治疗癌症，特别是乳腺癌和/或胃癌。
本发明的第六方面涉及治疗癌症的方法，该方法包括向由需要的患者给药药学有效量的细胞靶向缀合物或其药物组合物。所述方法特别适用于或用于治疗乳腺癌和/或胃癌。
本发明的最后一个方面涉及细胞靶向缀合物，该缀合物包括靶向部分和通过接头与靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中接头包括过渡金属络合物，并且其中所述细胞靶向缀合物用作药物。所述细胞靶向缀合物特别适用于治疗癌症，特别是乳腺癌或胃癌。接头优选包括铂络合物。靶向部分优选为抗体。在这方面，应当明确注意，根据本发明这方面的细胞靶向缀合物可以以与上文关于本发明的其他方面描述的相同的优选和替代实施方式的形式提供，或者如在下面的实例中描述的那样。
现在将通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
材料和方法
一般材料
使用的细胞系是乳腺癌细胞系MDA-MB231、JIMT、BT-474和SKBR3，卵巢癌细胞系SKOV和胃癌细胞系NCI-N87。JIMT-1于2012年3月19日从DSMZ德国获得，经过细胞遗传学检测之后并在复苏后的6个月内使用。NCI-N87于2012年2月29日在ATCC英国获得，经过细胞遗传学检测之后并在复苏后的6个月内使用。SKBR3获得自Dr.T.Oude Munnink(Departmentof Medical Oncology,University Medical Center Groningen,Groningen,TheNetherlands)，MDA-MB-231来自Roche，并且SK-OV-3来自Department of MedicalOncology,VU University Medical Center Amsterdam。检查所有细胞系的初级生长特点(形态和生长速率)和HER2表达。MDA-MB231是具有低HER2表达的细胞系；SKBR3、BT-474、SKOV-3和NCI-N87过表达HER2；并且JIMT-1是从患有曲妥珠单抗耐药的患者的肿瘤细胞发展来的并且是HER2阳性的(27)[“2004，Tanner”]。除非另有说明，否则所有起始试剂和溶剂均购自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific，并且未做进一步纯化而使用。澳瑞他汀F(AF)获自Concortis(San Diego，USA)。去铁胺(DFO)、曲妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗(obinituzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、西妥昔单抗和Kadcyla(T-DM1)获自医院药房。89Zr(在1mol/L草酸中≥0.15GBq/nmol)获得自Cyclotron BV阿姆斯特丹。通过milli-Q水过滤系统(Millipore，USA)蒸馏水并使水去离子(18MΩ/cm)。
基于Lx的ADC与基准物的缀合并用89Zr标记
Lx络合物DFO-Lx和AF-Lx与不同的mAb缀合，基本上如国际专利申请PCT/NL2016/050163(其通过引用并入本文)中所述。
DFO-Lx和AF-Lx与mAb的缀合
用Tricine缓冲液(12.3μL，200mM，pH 8.5)稀释曲妥珠单抗(71.0μL，21mg mL-1)并加入铂络合物(40.0μL，5mM储备溶液)。将样品在37℃下在热混合器中以550rpm温育24小时，之后加入硫脲(123.3μL，20mM)的H2O溶液，并将混合物在37℃下再温育30分钟。使用Ultra-15离心过滤装置(30kD MWCO，Merck Millipore)以PBS作为溶剂纯化缀合物。在使用Ultra-15离心过滤装置进行缀合之前,在Tricine缓冲液(20mM，pH8.5)中对奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗和IgG-B12进行缓冲液交换，并浓缩至21mgmL-1。
AF-Mal与mAb的缀合
将AF-Mal与不同的mAb缀合。用H2O(100μL)和硼酸盐缓冲液(38.8μL，250mM硼酸钠，250mM NaCl和10mM二乙二醇五乙酸，pH 8.0)稀释曲妥珠单抗(71.0μL，21mg mL-1)，并且加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)(3.3当量，13.8μL，10mM，在H2O中)。将样品在37℃下在热混合器中以550rpm温育2小时，之后加入AF-Mal溶液(6当量，20.6μL，10mM，在DMSO中)并将混合物在0℃再温育60分钟。最后，在0℃用N-乙酰半胱氨酸(5μL，100mM)淬灭缀合5分钟，并使用Ultra-15离心过滤装置(30kD MWCO，Merck Millipore)以PBS作为溶剂进行纯化。
AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr和AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr的产生
根据Verel等人(26)[“2003，Verel”]描述的方法，进行了琥珀酰化DFO的活化酯与mAb中赖氨酸残基的缀合。获得所需的DFO与mAb的比率，缀合效率为50％。AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr和AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr是通过首先用DFO预先修饰曲妥珠单抗(DFO:曲妥珠单抗比率为1)，随后根据上述方法将AF-Lx或AF-Mal与预先修饰的曲妥珠单抗缀合而获得的。最后根据Verel等人(26)[“2003，Verel”]描述的方法用89Zr标记缀合物。
使用的分析程序
UV
使用曲妥珠单抗或IgG-B12的校准曲线，通过UV光谱(UV-6300PC，VWR)测定蛋白质浓度。
HPLC
使用配备有Alltima C185μ柱(4.6×250mm)和线性梯度的MeCN/水，0.1％TFA，流速为1mL/min的Jasco HPLC系统对DFO-Lx、AF-Lx和AF-Mal的分析型高效液相色谱(HPLC)进行分析。
使用配备有Sepax Zenix-C SEC-300柱(7.8×300m)和Sepax Zenix-CSEC-300保护柱(Sepax Technologies Inc.，Newark，DE，USA)的Jasco HPLC系统进行ADC的HPLC分析，使用0.05mol/L磷酸钠、0.15mol/L氯化钠(pH6.8)和0.01mol/L NaN3的混合物作为洗脱液，流速为1mL/min。使用在线NaI(T1)放射检测器(Raytest Sockett)监测洗脱液的放射性。
iTLC
对ADC进行了瞬时薄层色谱(iTLC)分析以评估ADC的放射化学纯度。使用二氧化硅浸渍的玻璃纤维板(PI Medical Diagnostic Equipment BV)和20mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)/MeOH(3/7)作为流动相。在读数时，使用了89Zr的γ-孔计数器(Wallac LKB-CompuGamma 1282；Pharmacia)进行γ-孔同位素计数。
SDS-PAGE
用SDS-PAGE测定ADC的结构完整性。将样品与上样缓冲液以1:1混合，并在非还原和还原条件下使用预先形成的7.5％SDS-PAGE凝胶在Phastgel系统(GE Healthcare LifeSciences)上跑胶。使用磷光成像仪通过同位素计数分析凝胶，并用ImageQuant软件定量。
结合测定
基本上如Lindmo等人(28)[“1984，Lindmo”]所述，使用0.2％戊二醛固定的SKOV细胞的连续稀释液和固定量的89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗或89Zr-DFO-曲妥珠单抗，在免疫反应性测定中测定ADC的结合特点。在4℃温育过夜后，将细胞悬浮液离心，并将特异性结合计算为测定中细胞结合的放射性与放射性总量的比率。如使用500倍过量的非放射性曲妥珠单抗的测定，校正了非特异性结合。所有结合测定一式三份进行。
LC-MS
使用偶联至配备有电喷雾电离(ESI)源的Bruker Q-TOF质谱仪(Bremen，Germany)的Zenix LC系统(Thermo Finnigan，San Jose，CA，USA)进行了LC-MS分析。使用Zenix-C柱(4.6×300mm；5μm；Sepax Technologies Inc.，Newark，DE，USA)进行质量测定。流动相由水、乙腈、三氟乙酸和甲酸(分别为79.9/19.9/0.1/0.1，v/v/v/v)的混合物组成。以350μL/min的流量进行17分钟的无梯度运行。注入10μL样品。从2至10分钟使用质谱仪上存在的转换阀将LC流作为MS源。将剩余的溶剂流作为废物以防止源污染。使用以下设置在正电离模式下进行MS分析：ESI电压，4.5kV；干燥气体温度，190℃；干气流速，8L/min；雾化器压力，1.6巴；源内碰撞诱导解离能，120eV；离子能量，5eV；碰撞室能量，15eV。使用BrukerDaltonics Data Analysis软件分析数据。使用数据分析软件的“电荷解卷积”实用过程进行蛋白质离子电荷分配和分子质量测定。
游离药物测定
通过用100μL乙腈沉淀50μL ADC，然后离心(10.000rpm，5分钟)以及上清液的C18反相HPLC分析来测定ADC溶液中游离药物的百分比。为了定量，使用AF-Lx-硫脲络合物制备了校准曲线。
基于Lx的ADC的分子表征
通过ADC的DTT还原、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，然后进行HPLC、SDS-PAGE或SEC-MS分析，确定mAb中的有效负载物(即官能部分)的位置。使用抗体PNGase F(SigmaAldrich)以每100μg 2单位/μg酶将ADC(1mg/mL，在PBS中)去糖基化。将样品在37℃下温育24小时。通过将ADC(100μL，2mg/mL，在PBS中)与DTT(100μL，100mM，在H2O中)在65℃温育20分钟来进行ADC的半胱氨酸桥的还原。通过在NaOAc缓冲液(20mM，pH4.0)将ADC重新缓冲并浓缩至1mg/mL，随后加入胃蛋白酶(Sigma Aldrich)(2.5μL，1mg/mL，在10mM HCl中)进行胃蛋白酶消化。将混合物在37℃温育24小时，之后通过添加Tris缓冲液(10μL，2M，pH 8.0)使胃蛋白酶失活。通过在Tris-HCL缓冲液(100mM，含有2mM EDTA和5mM半胱氨酸，pH 7.6)中将ADC重新缓冲并浓缩至1mg/mL随后加入木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich)(4μL，0.5mg/mL，在H2O中)进行木瓜蛋白酶消化。将混合物在37℃下温育4小时。
基于Lx的ADC的质量测试和稳定性
将ADC 89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗与1体积当量0.9％NaCl或50％人血清在37℃下温育。在不同时间点，通过iTLC和放射-HPLC测量缀合物的放射化学纯度，而通过SDS-PAGE分析缀合物的完整性，然后进行磷光成像仪分析。用Lindmo结合测定确定了ADC的体外结合特点。
体外细胞活力测定
使用Assay(Promega)测量了AF-Lx、AF-Mal、AF-Lx-曲妥珠单抗、AF-Lx-IgG-B12、AF-Mal-曲妥珠单抗、AF-Mal-IgG-B12、T-DM1和曲妥珠单抗对细胞系MDA-MB231、JIMT、BT-474、SKBR3、SKOV-3和NCI-N87细胞活力的影响。在开始测定之前，通过将化合物分别与1摩尔当量硫脲(2小时，37℃)和N-乙酰基半胱氨酸(30分钟，0℃)温育对AF-Lx和AF-Mal进行了淬灭。将细胞用胰蛋白酶消化并在第0天接种于96孔平底组织培养板中。在第1天，从10或1000nM(取决于细胞类型和化合物类型)开始制备了来自上述化合物系列的稀释系列(9×4倍稀释)，并添加到细胞中(在ADC的情况下，使用了mAb的浓度)。在第5天，加入了CellTiter-Blue试剂并在37℃下温育2小时，用TeCan读板仪(Tecan Group Ltd.)在560EX/590EMnm下测量活细胞。以细胞培养基为背景校正样品的荧光值，通过将处理的细胞的荧光值除以未处理的对照细胞的值来计算以存活百分比表示的结果。用Graphpad Prism5软件分析数据。
基于Lx的ADC的生物分布
在雌性裸鼠(Hsd athymic nu/nu，25-32g；Harlan CPB)，非荷瘤小鼠或两个侧腹荷载了NCI-N87肿瘤的小鼠中比较了89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗、89Zr-DFO-曲妥珠单抗、AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr和AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr缀合物的生物分布。所有动物实验均根据荷兰国立卫生研究院实验室动物护理原则和荷兰国家法律进行(“Wet op deproefdieren”，Stb1985,336)。用总体积为100μL的2.0MBq(100μgmAb)注射(i.v.)小鼠。在注射后第1小时、第4小时、第24小时、第48小时、第72小时和第96小时通过尾部撕裂收集血液。在注射后72或96小时，将小鼠麻醉，放血，安乐死并解剖。称重血液和器官，并进一步处理。在γ计数器中测量每个样品中的放射性量。放射性摄取计算为每克组织注射剂量的百分比(％ID/g)。
基于Lx的ADC的体内MTD和治疗研究
在开始治疗研究之前，确定了AF-Lx-曲妥珠单抗和AF-Mal-曲妥珠单抗的MTD。为此目的，通过腹膜内注射向5个组的5只裸鼠推注给予15、30或60mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗、AF-Mal-曲妥珠单抗或作为对照的生理盐水。每周测量体重三次，当与对照小鼠相比体重减轻>10％时达到MTD。在与用于生物分布研究所述相同的裸鼠模型中研究了AF-Lx-曲妥珠单抗、AF-Mal-曲妥珠单抗和T-DM1的治疗效果。为此目的，使用了在两个侧腹中具有已建立的NCI-N87或JIMT-1异种移植的7个组的8或9只小鼠。对于NCI-N87肿瘤或JIMT-1肿瘤的研究，研究开始时的平均肿瘤尺寸分别为140±30mm3和140±30mm3，并且对于不同的治疗组平均肿瘤尺寸是相似的。所有小鼠均接受腹腔注射推注。在对NCI-N87肿瘤的研究中，第1组是对照组并且接受100μL盐水溶液。第2组接受了15mg/kg曲妥珠单抗，第3组接受了15mg/kg阿多曲妥珠单抗依酯(T-DM1)，第4组接受了15mg/kg AF-Lx-IgG-B12，第5组接受了15mg/kg AF-Mal-曲妥珠单抗，并且第6组和第7组分别接受了15mg/kg和5mg/kg的AF-Lx-曲妥珠单抗。阿多曲妥珠单抗依酯作为具有临床疗效的参考ADC包括在本研究中。包括作为非结合对照的AF-Lx-IgG-B12，并加入了AF-Mal-曲妥珠单抗作为基准缀合物。在对JIMT-1肿瘤的研究中，第1组是对照组并且接受了100μL盐水溶液。第2组接受了15mg/kg曲妥珠单抗，第3组接受了15mg/kg阿多曲妥珠单抗依酯，第4组和第6组分别接受了15和30mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗，第5组和第7组分别接受了15mg/kg和30mg/kg AF-Mal-曲妥珠单抗，在治疗结束后直至4个月，每周测量体重和肿瘤体积三次。
统计分析
所有动物实验均使用Welch's t检验对独立样品进行统计学分析。计算了双侧显著性水平，并且P<0.05被认为是统计学显著的。
结果
去铁胺-Lx络合物(DFO-Lx)的合成，它们与mAb的缀合，以及用89Zr标记
本发明中用于将官能部分偶联至靶向部分的方法(也称为Lx技术)是用于将(毒性)有效负载物(官能部分)与蛋白质载体(靶向部分)诸如单克隆抗体缀合的两步法(图1)。在第一步中，官能部分与接头配位，即顺铂衍生物[Pt(en)Cl2](即“Lx接头”或“Lx”)，然后将有效负载物-Lx络合物缀合至靶向部分，例如，天然mAb，
虽然，脱铁胺(DFO)可通过伯胺与Lx接头直接配位，但决定首先用琥珀酸基团修饰DFO，然后加入哌啶配位基团(图1)。通过用AgNO3活化[Pt(en)Cl2]，然后与哌啶修饰的具有螯合铁(Fe(III))的DFO反应，以实现与Lx接头的配位。通过制备型HPLC纯化了粗产物，得到了纯度>95％(λ430nm)的DFO-Lx络合物。将络合物储存为含有20mM NaCl的5mM水溶液，在4℃下储存至少1年后通过HPLC未观察到分解。
以直接的方式进行了Lx络合物(即官能部分-接头络合物)与mAb的缀合，将DFO-Lx络合物与曲妥珠单抗在37℃温育了24小时(图1)。纯化后，用尺寸排阻色谱(SEC)清楚地观察到缀合，并且未观察到聚集(图2a)。很容易通过质谱法测定的DFO-Lx:mAb比率从现在开始称为官能部分与靶向部分的比率或药物-抗体比率(DAR)，并且为2.6(图2b)。
通过在相同的缀合条件下将曲妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗和奥法木单抗与DFO-Lx络合物缀合来测试缀合方法的通用性。在缀合之前在20mM tricine缓冲液(pH8.5)中对mAb溶液进行缓冲液交换，至21mg/mL，以提供如用LC-MS测定的具有的平均DAR为2.9和3.2之间的缀合物(99％单体)(图S1)。观察到一致的分布曲线。未缀合抗体的百分比非常低(1-5％)，而DAR在2-4和1-5范围内的缀合物分别占分子的76-78％和94-96％。
在生物分布研究中，DFO-Lx-曲妥珠单抗又以赖氨酸缀合的类似物(DFO-曲妥珠单抗)为基准。将琥珀酰化的DFO的活化酯与mAb中的赖氨酸残基缀合，得到具有的平均DAR为2.9的缀合物[Verel等人，REF]。有趣的是，与DFO-曲妥珠单抗相比，发现DFO-Lx-曲妥珠单抗的分布曲线更窄，这表明更少数量的氨基酸位点参与与DFO-Lx的偶联中(图2c)。
根据Verel等人(26)[“2003,Verel”]描述的方法用89Zr对基于DFO的缀合物进行放射性标记，暗示通过与乙二胺四乙酸(EDTA)转螯合去除Fe(III)并用89Zr标记。对于89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗，两种缀合物的放射化学纯度均>99％且免疫反应性部分相似。此外，SDS-PAGE和HPLC分析示出了单体产物，这表明在缀合和放射性标记时mAb的结构完整性保持不变。
AF-Lx络合物的合成及他们与mAb的缀合
选择高效澳瑞他汀F(AF)作为细胞毒性有效负载物，用于评估治疗性ADC方法中Lx接头的性能。已经表明可以用不可切割的间隔基修饰羧基而不妨碍其活性(29,30)[“2006，Doronina”和“2012，Axup”]。为了与Lx接头保持稳定的偶联，使用了哌啶配位基团修饰AF(图3a)。加入药物和接头之间的乙二醇间隔物以改善药物的水溶性，这由铂的正电荷进一步改善。
哌啶修饰的AF与Lx接头的配位以及随后将形成的AF-Lx络合物与mAb的缀合类似于对DFO系统所描述的。AF-Lx与曲妥珠单抗的缀合提供了具有>99％单体的ADC，DAR在2.5和2.7之间的范围内。
为了评估Lx接头是否改变基于AF的ADC的治疗功效(图3a)，设计了药物-接头(具有马来酰亚胺缀合基团，而不是Lx接头)的基准物(图3b)。
马来酰亚胺化学是将基于奥利斯他汀的有效负载物缀合至mAb的常规缀合方法，如在将MMAE缀合至本妥昔单抗(brentuximab)以提供FDA批准ADC Adcetris时进行的。马来酰亚胺部分与通过还原mAb铰链区中的半胱氨酸桥获得的游离半胱氨酸硫醇反应。为了制备具有与基于Lx的ADC相当的DAR的缀合物，如材料和方法部分中所述，对mAb进行了部分还原。缀合方法提供了AF-Mal-曲妥珠单抗ADC，其单体>99％且具有的平均DAR为2.0-2.3。
基于Lx的ADC的分子表征
为了评估Lx缀合的有效负载物在抗体中的位置，用DTT还原了89Zr放射性标记的缀合物以将重链(HC)与轻链(LC)分离。SDS-PAGE之后对89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗的磷光成像仪分析显示优先结合HC(89％的放射性结合HC，11％结合LC)，而对于89Zr-DFO-曲妥珠单抗发现了61:39的HC/LC比率(图4a)。对Fe标记的抗体缀合物的SEC-MS分析提供了与89Zr标记的对应物相同的HC/LC分布(图S2a-b)。接下来，对还原的AF-Lx-曲妥珠单抗的SEC-MS分析也证实了Lx接头与HC的优先缀合。
为了进一步洞察在mAb中Lx-有效负载物(即官能部分)的偶联位置,用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化AF-Lx-曲妥珠单抗，以分别从F(ab)2或Fab中分离Fc区(图4b或图S3)。胃蛋白酶消化的AF-Lx-曲妥珠单抗的SEC-MS分析显示F(ab)2部分的平均DAR为0.38，其是总有效负载物的15％(DAR2.7)。换言之，约85％的有效负载物位于mAb的Fc部分。通过对木瓜蛋白酶消化的AF-Lx-曲妥珠单抗的SEC-MS分析证实该位点限制性缀合。此外，针对各种有效负载物-Lx和mAb组合，发现了类似的有效负载物位置分布。
基于Lx的ADC的质量测试和稳定性
在89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗的情况下，在37℃下在50％人血清中，测定了基于Lx的ADC的体外血清稳定性，因为使用这种放射免疫缀合物作为测试Lx体外和体内性能的模型允许准确和容易的定量(图S4)。放射-TLC、放射-HPLC和SDS-PAGE之后进行了磷光成像仪分析，显示在温育最长达200h时无89Zr释放。在这些条件下，通过Lindmo结合测定法确定的免疫反应性部分在～300h后降低3-4％。89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗的这些质量测试的结果非常相似，后者代表通过共价偶联获得并且在许多临床前和临床89Zr-免疫-PET研究中进行了评估的缀合物(图S4a-b)。
为了评估基于Lx的ADC的体内稳定性和肿瘤靶向潜力，在两个侧腹部上荷载皮下表达HER2的NCI-N87异种移植的裸鼠中进行了生物分布研究(图5b)。制备了分别具有相对低的DFO:mAb比率0.8和0.6的89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗，以避免由缀合过负载引入的药代动力学效应。总体而言，除了肝脏(3.8±1.7和7.1±2.4)和血液(89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗分别为5.4±0.8和4.0±0.3)外，两种缀合物在器官中的89Zr水平相似。
对于两种缀合物肿瘤中89Zr水平相似，而89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗获得了更高的肿瘤对血液比率，这证明铂(II)-接头的参与实现了稳定的缀合和有效的肿瘤靶向。
体外细胞活力测定
测定包括奥利斯他汀作为官能部分、曲妥珠单抗作为靶向部分和铂络合物接头Lx的细胞靶向缀合物(下文称为AF-Lx-曲妥珠单抗)的细胞杀伤潜力。
用Cell Titer-Blue测定法测量了AF-Lx-曲妥珠单抗，并与其马来酰亚胺缀合的类似物AF-Mal-曲妥珠单抗和阿多曲妥珠单抗依酯进行了比较。此外，包括非肿瘤结合mAbIgG-B12、AF-Lx-IgG-B12的基于Lx的ADC包括在实验中以用作阴性对照。
AF-Lx-曲妥珠单抗、AF-Mal-曲妥珠单抗和阿多曲妥珠单抗依酯对HER2阳性细胞系NCI-N87、SKOV-3、SK-BR3和BT-474显示出相似的亚纳摩尔效力，IC50在10和200pM之间的(图6a，表S1)。另一方面，非结合ADC、AF-Lx-IgG-B12在测量范围内未显示IC50，这表明细胞以抗原依赖性方式被杀死。这得到了HER2阴性细胞系MDA-MB-231中ADC的低效力的支持(图6b)。T-DM1的IC50较低表明DM1在实验期间释放。有趣的是，两种基于AF的ADC在T-DM1抗性JIMT-1细胞系中显示出亚纳摩尔效力，如预期的那样T-DM-1的IC50是更高的数量级，而游离DM1的贡献不能排除。
为了预测当药物-接头AF-Lx和AF-Mal为游离状态时可能发生的情况，还测定了这些化合物对所有测试的细胞系的毒性(图6d)。在实验之前，分别通过将化合物与硫脲和N-乙酰基半胱氨酸一起温育以淬灭了AF-Lx和AF-Mal。在所有测试的细胞系中，药物-Lx组合的效力总是比其相应ADC低，为其103分之一至104分之一，而对于马来酰亚胺基接头和相应的ADC，该差异仅为10至100倍。此外，通过比较两种药物-接头组合，似乎AF-Lx的IC50总是为AF-Mal的102至103倍高。
基于Lx的ADC的生物分布
通过向荷载NCI-N87肿瘤的小鼠注射AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr、AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr或曲妥珠单抗-89Zr来检查Lx-缀合的AF对mAb药代动力学、肿瘤靶向和生物分布的影响(图7)。
血液动力学未显示出显著差异：对于曲妥珠单抗-89Zr、AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr和AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr，在注射后1h血液水平分别为28.2±2.2、29.1±1.6和29.0±6.8，并在注射后96h分别缓慢下降至3.2±1.2、5.1±2.5和5.6±2.1(图7a)。Lx-缀合的ADC的肿瘤摄取(26.1±4.9)类似与马来酰亚胺缀合的ADC的摄取(31.0±6.0)和未缀合的曲妥珠单抗的摄取(29.2±6.8)。AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr的优异的肿瘤选择性通过PET-CT在图7c中可视化。除肝脏外，在正常组织中未观察到89Zr摄取的显著差异，对于AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr的摄取(11.6±2.4)高于对AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr和曲妥珠单抗-89Zr的摄取(分别为7.0±1.4和5.7±0.8)。
基于Lx的ADC体内MTD和治疗研究
用AF-Lx-曲妥珠单抗(DAR 2.3)和AF-Mal-曲妥珠单抗(DAR 2.6)进行了体内安全性研究。向非荷瘤小鼠注射了15、30或60mg/kg，单次推注。用30mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗治疗的小鼠示出了96％的重量损失，而用60mg/kg AF-Lx-曲妥单治疗的小鼠重量损失趋于增加10％以上。用60mg/kg AF-Mal-曲妥珠单抗处理的小鼠的重量损失为96％。
在荷载NCI-N87肿瘤的小鼠中评估了AF-Lx-曲妥珠单抗(DAR 2.6)的体内功效(图8a)。注射PBS、曲妥珠单抗和AF-Lx-IgG-B12(DAR 2.4)用作对照，而阿多曲妥珠单抗依酯和AF-Mal-曲妥珠单抗(DAR 2.0)作为基准物包括在内。所有ADC以15mg/kg的剂量单次推注给药。
最初，在注射曲妥珠单抗ADC后NCI-N87肿瘤消退，而非结合对照ADC曲妥珠单抗仅引起生长延迟。从第20天开始，用阿多曲妥珠单抗依酯治疗的肿瘤开始再生，而两个基于AF的ADC组的肿瘤继续消退。用AF-Lx-曲妥珠单抗和AF-Mal-曲妥珠单抗治疗的组之间的肿瘤生长差异在第60天后变得明显。在AF-Mal-曲妥珠单抗治疗的小鼠肿瘤在此时间点开始再生的情况下，用AF-Lx-曲妥珠单抗治疗的小鼠的肿瘤直至第125天实验结束时保持平均体积不变。最后，用AF-Lx-曲妥珠单抗治疗的9只小鼠中的8只在研究中存活，而用AF-Mal-曲妥珠单抗治疗的9只小鼠中有2只存活(图S5a)。所有由于肿瘤尺寸(>1000mm3)的小鼠退出了研究。在第125天，在AF-Lx-曲妥珠单抗治疗组的16例肿瘤中的12例(9只小鼠中的6只)中观察到了定义为在随访期间退化的个体肿瘤的无生长的治愈。AF-Mal-曲妥珠单抗治疗组的治愈数为4例肿瘤中的2例。
在JIMT-1异种移植小鼠中进一步评估了AF-Lx-曲妥珠单抗的体内治疗功效。尽管JIMT-1细胞系为HER2表达阳性，但已显示了JIMT-1肿瘤是抗曲妥珠单抗以及抗阿多曲妥珠单抗依酯的(27,31-33)["2004,Tanner","2010,Koninki,","2015,Lagonzo"and"Barok,2015]。该研究的设置与用NCI-N87异种移植进行的功效研究相似，AF-Lx-曲妥珠单抗和AF-Mal-曲妥珠单抗的DAR分别为2.6和2.3。此外，在该研究中，包括了以30mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗和30mg/kg AF-Mal-曲妥珠单抗的剂量单次推注治疗的两个组。曲妥珠单抗和阿多曲妥珠单抗依酯治疗均引起最小的生长延迟(图8b)。另一方面，用两种基于AF的缀合物处理的小鼠的肿瘤在注射后消退。然而，在注射后第20天，AF-Mal-曲妥珠单抗治疗组中的一些肿瘤开始再生，AF-Lx-曲妥珠单抗组中的所有肿瘤完全消退，并且直至第125天实验结束均未观察到再生长。最后，用15mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗治疗的9只小鼠中有7只在研究中存活，而用30mg/kg AF-Lx-曲妥珠单抗治疗的9只小鼠中有9只存活(图S5b)。对于15mg/kg和30mg/kg AF-Mal-曲妥珠单抗治疗的组，马来酰亚胺基准组的存活率分别为9只中的5只和8只中的4只。
支持信息
表S1.用ADC AF-Lx-曲妥珠单抗、AF-Mal-曲妥珠单抗、阿多曲妥珠单抗依酯和AF-Lx-IgG-B12和药物-接头AF-Lx和AF-Mal处理不同细胞系的体外细胞活力。
支持信息化学
DFO-和AF-Lx复合物的合成及相应的基准物
除非另有说明，所有试剂均以购买的形式使用。在Bruker Avance250MHz、BrukerMSL 400MHz、Bruker 500MHz光谱仪上记录了1H和13C核磁共振(NMR)光谱，其中光谱在25℃的温度下记录。化学位移(δ)以ppm给出，并且内部参考残余溶剂共振(1H：δ＝7.29ppm，13C：δ＝77.0ppm)。用Aldrich硅胶(230-400目)进行快速柱色谱。使用ESI-TOF(电喷雾电离飞行时间)在am Agilent质谱仪上记录高分辨率质谱(HRMS，ESI)。在Merck二氧化硅板(60F-254)上进行薄层色谱(TLC)，并通过短波紫外光和KMnO4染色观察了化合物。使用AlltimaC185μ柱(22×250mm)和线性梯度水+0.1％TFA(洗脱液A)和MeCN+0.1％TFA(洗脱液B)以10mL/min的流量进行了制备型HPLC，除非另有说明。使用配备有AlltimaC185μ柱(4.6×250mm)和线性梯度的MeCN/水，0.1％TFA，流量为1mL/min的Jasco HPLC系统进行了分析型高效液相色谱(HPLC)分析。
铂络合物DFO-Lx的合成
根据Verel等人→Verel,I.,Visser,G.W.M.,Boellaard,R.,Stigter-van Walsum,M.,Snow,G.B.,and van Dongen,G.A.M.S.(2003)89Zr immuno-PET:Comprehensive procedures for the production of 89Zr-labeled monoclonal antibodies, J.Nucl.Med.44,1271–1281.)描述的方法制备了N-琥珀酰基去铁胺(N-suc-DFO)。
Fe-N-琥珀酰基去铁胺(3)
将FeCl3(167μL，400mg/mL的0.5M HCl溶液)的储备溶液逐滴加到(2)(250mg，0.378mmol)的0.1M Na2CO3(5.5mL)和0.9％NaCl(4.8mL)的搅拌中的溶液中。将混合物在室温下搅拌1h，然后加入2.85％TFA水溶液(6mL，相比于DFO 4当量的三氟乙酸(TFA))，并用水将体积调节至约30mL。将溶液负载至六个C18Plus柱体(Sep-Pak C18Plus短柱体，每个柱体360mg吸附剂，55-105μm，Waters)，2个串联的柱体，用甲醇(10mL/柱体)然后用水(60mL/柱体)活化。然后用水(100mL/柱体)洗涤整个装置，之后用空气吹扫柱子，然后用乙腈(5mL/柱体)洗脱产物。将产物用等体积的水稀释并冻干，得到棕色固体(263mg，97％)。
HPLC分析和质谱分析表明产物是纯的。
Fe-N-琥珀酰-(氨甲基)哌啶去铁胺(4)
将(3)(150mg，0.210mmol)溶于DMF(2.5mL)中，并且依次加入HOBt(42.6mg，0.315mmol)、EDC(60.4mg，0.315mmol)、DIPEA(0.036mL，0.315mmol)和4-(氨甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(45mg，0.210mmol)中。将反应物搅拌20h，然后浓缩。将粗产物溶于水/MeOH混合物(9/1，10mL)中并上样至10支Sep-Pak C18plus柱(并联)上，用甲醇(10mL/柱体)然后用水(60mL/柱体)活化。然后用水(100mL/柱体)洗涤整个装置，之后用空气吹扫柱子，然后用乙腈(5mL/柱体)洗脱产物。用等体积的水稀释产物级分并冻干，得到193mg产物。HPLC分析显示存在HOBt。
HRMS(ESI+)C40H69FeN8O12[M+H]+计算值910.4457，实测值910.4464。
将冻干的产物溶于4mL DCM/TFA(1:1)中并在室温下搅拌75分钟。随后，浓缩反应混合物，之后将固体溶于10mL水中并冻干。将产物溶解在甲醇中并装载至已用甲醇活化的一个ISOLUTE SCX-2 2G柱(Biotage)上。用在甲醇中的0.25M氨的洗涤柱3次，用15mL在甲醇中的1M氨的和40mL甲醇中的7M氨的洗脱，然后浓缩溶液，得到棕色固体(142mg，84％)。
HPLC分析和质谱分析表明产物是纯的。
HRMS(ESI+)C35H61FeN8O10[M+H]+计算值810.3933，实测值810.4602。
合成铂络合物[Pt(en)(Fe-N-琥珀酰基-(氨甲基))哌啶去铁胺)Cl](TFA)(5)
将AgNO3(27.0mg，0.153mmol)加入到[Pt(en)Cl2](50mg，0.153mmol)的DMF(1mL)悬浮液中，并在室温下在黑暗中搅拌16小时。将混合物经硅藻土过滤，并将过滤器用1mL DMF冲洗。随后，将0.78mL溶液(0.062mmol)加入到(4)(50mg，0.062mmol)中，并将混合物在室温下在黑暗中搅拌16小时，然后在减压下除去溶剂。通过制备型HPLC(10-25％MeCN，40分钟)纯化，然后冻干产物级分，得到呈棕色固体的产物(25mg，37％)。HPLC分析和质谱分析表明产物是纯的。HRMS(ESI+)C37H69ClFeN10O10Pt[M+H]+计算值1100.3951，实测值1100.3694。
合成铂络合物澳瑞他汀F-Lx(AF-Lx)
4-((((4-(硝基苯氧基)羰基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(6)
在室温下在氩气下将氯甲酸4-硝基苯酯(2.573g，12.722mmol)加入到4-(氨甲基)-哌啶-1-羧酸叔丁酯(2.737g，12.772mmol)和吡啶(1.1mL，12.772mmol)的DCM溶液(66mL)。将加热反应至回流并搅拌6h。随后，浓缩反应并用NaHCO3(2x)饱和水溶液、水和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱法(10-50％EtOAc，在cHex中)纯化，得到呈膏状固体的产物(6)(2.12g，47％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(d,J＝9.1Hz,2H),7.30(d,J＝9.1Hz,2H),5.37(t,J＝5.9Hz,1H),4.14(d,J＝13.5Hz,2H),3.18(t,J＝6.1Hz,2H),2.70(t,J＝12.2Hz,2H),1.78-1.66(m,3H),1.45(s,9H),1.17(qd,J＝12.5,3.7Hz,2H)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ155.8,154.7,153.3,144.6,125.1,121.9,79.5,46.7,43.4,36.5,29.5,28.4。
HRMS(ESI+)C18H25N3O6[M+Na]+计算值402.1636，实测值402.1625。
4-(12-氨基-3-氧代-7,10-二氧杂-2,4-二氮杂十二烷基)吡啶-1-羧酸叔丁酯(7)
在室温下将(5)(300mg，0,790mmol)的DCM(5mL)溶液加入至搅拌中的三乙胺(0.11mL，0,790mmol)和2,2'-(乙烷-1,2-二甲基双(氧))双(乙胺)(0.58mL，3.95mmol)的DCM(10mL)溶液中。将反应在室温下搅拌2h。随后，将反应稀释至20mL DCM并用1M NaOH(3×2mL)和水(2×2mL)洗涤。将合并的水层用DCM(10mL)萃取，然后将合并的有机层用Na2SO4干燥，硅胶过滤并浓缩。通过快速色谱法(DCM中的0-10％MeOH/NH4OH(9:1)(快速)，然后DCM中的10％MeOH/NH4OH(9:1)+5％MeOH)纯化，得到呈淡黄色油状的产物(7)(256mg，83％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ5.80(t,J＝5.9Hz,1H),5.47(t,J＝5.5Hz,1H),4.06(brs,2H),3.62-3.57(m,4H),3.55-3.52(m,4H),3.35(td,J＝5.4,4.7Hz,2H),3.02(br s,2H),2.89(t,J＝5.0Hz,2H),2.64(br t,J＝11.7Hz,2H),2.33(s,2H),1.66-1.53(m,3H),1.42(s,9H),1.06(qd,J＝12.0,4.4Hz,2H)。
13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ158.9,154.8,79.2,72.1,70.6,69.9,69.8,45.5,41.3,40.0,36.9,29.7,28.4。
HRMS(ESI+)C18H37N4O5[M+H]+计算值389.2759，实测值389.2766。
AF-(4-(12-氨基-3-氧代-7,10-二氧杂-2,4-二氮杂十二烷基)哌啶)(8)
将溶解在DMF(1mL)中的澳瑞他汀F(AF，29.8mg，0.040mmol)(AF)加入到(7)(46.6mg，0.120mmol)的DMF(1mL)溶液中。连续加入HATU(30.4mg，0.080mmol)和DIPEA(0.021mL，0.120mmol)，并且将混合物在室温下搅拌6h，然后浓缩反应。将产物溶于水中的30％MeCN(4mL)中，并通过制备型HPLC(H2O中的30-50％MeCN，40分钟)纯化，得到呈无色固体的产物。
HPLC分析和质谱分析表明产物是纯的。
HRMS(ESI+)C58H102N9O12[M+H]+计算值1116.7642，实测值1116.7774。
将产物溶于DCM(2mL)中并加入TFA(2mL)，将混合物在室温下搅拌80分钟，然后在减压下浓缩。将产物溶于DCM中的10％MeOH(2mL)中，并上样到用DCM(10mL)预洗涤的SCX-2柱上。将柱用10％MeOH的DCM溶液(20mL)洗涤，并将产物用1M甲醇氨的DCM溶液(1:1)洗脱。将合并的产物级分浓缩并与DCM共蒸发数次以除去痕量的氨，得到呈无色油状的产物(30.5mg，75％)。
HPLC分析和质谱分析表明产物是纯的。
HRMS(ESI+)C52H91N9O10[M+2H]2+计算值508.8596，实测值508.8642。
合成铂络合物[Pt(en)(AF-(4-(12-氨基-3-氧代-7,10-二杂氧-2,4-二氮杂十二
烷基)哌啶))Cl](Cl)(9)
将AgNO3(14.3mg，0.085mmol)溶解在DMF(2mL)中并加入到[Pt(en)Cl2](50mg，0.153mmol)的DMF(7.5mL)悬浮液中并在室温下搅拌24h，之后通过硅藻土过滤该溶液。随后，将3.52mL该溶液(0.060mmol)加入到(8)(30.5mg，0.030mmol)的DMF(1mL)溶液中，并将混合物在室温下在黑暗中搅拌16h，之后加入20mM NaCl溶液(2mL)，然后在减压下除去溶剂。通过制备型HPLC(10-25％B，40分钟，洗脱剂A：20mM NaCl的MiliQ+0.1％TFA溶液，洗脱剂B：MiliQ中的9:1MeCN:20mM NaCl+0.1％TFA)纯化产物。将产物级分(约20mL)浓缩至约4mL。随后，将溶液用20mM NaCl稀释至约20mL，并且上样到已经通过用甲醇(20mL)，然后用水(120mL)预先活化的两个串联的C18Plus柱上。上样产物后，用水(50mL)洗涤柱子，用空气吹扫，并且用甲醇(10mL)洗脱产物。通过旋转蒸发直接浓缩滤液，并通过高真空(2h)除去痕量溶剂，得到白色半固体(21.2mg，54％)。在-18℃下将固体作为5mM溶液储存在20mM NaCl+10％DMA中。
HPLC分析和质谱分析显示产物纯度为95％。
HRMS(ESI+)C55H101ClN11O10Pt[M+H]+计算值1304.7043，实测值1304.6968。
合成奥利斯他汀-马来酰亚胺(AF-Mal)
(2-(2-(2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯基)己酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙
基)氨基甲酸叔丁酯(BocNH-PEG1-酰胺-Hex-Mal)(10)
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(62.1mg，0.201mmol)溶于DMF(1mL)并且将在氩气下逐滴加入(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(50mg，0.201mmol)的DMF(1mL)溶液，然后加入DIPEA(0.053mL，0.302mmol)。将反应在室温下搅拌40h，并且然后用二氧化硅浓缩。通过快速色谱法(1-4％MeOH，在DCM中)纯化，得到呈无色油状的产物(10)(56mg，63％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ6.66(s,2H),6.05(br s,1H),5.02(br s,1H),3.70-3.36(m,12H),3.36-3.20(m,2H),2.15(t,J＝7.4Hz,2H),1.66-1.54(m,4H),1.42(s,9H),1.31-1.25(m,2H)。
13C-NMR(500MHz,CDCl3)δ172.7,170.8,155.9,134.0,79.3,70.2,70.1,70.1,69.9,40.2,39.1,37.6,36.3,28.3,28.2,26.3,25.0。
HRMS(ESI+)C21H35N3O7[M+Na]+计算值464.2367，实测值464.2363。
AF-PEG1-酰胺-Hex-Mal(11)
将(10)(11.25mg，0.025mmol)溶解在DCM(0.15mL)中并向溶液中加入TFA(0.15mL)。将混合物搅拌105分钟，然后在氮气流和随后高真空(1h)下蒸发。然后将AF(19.0mg，0.025mmol)的DMF(1mL)溶液加入到盛有粗反应混合物的小瓶中，之后连续加入HATU(19.37mg，0.051mmol)和DIPEA(0.013mL，0.076mmol)。将混合物在室温在氩气下搅拌2h，之后浓缩混合物。通过制备型HPLC(30-45％MeCN，在H2O中，40分钟)纯化，得到呈无色固体的产物。将产物在-18℃下作为10mM DMSO溶液储存。
HPLC分析和质谱分析显示产物纯度为95％。
HRMS(ESI+)C56H93N8O12[M+H]+计算值1069,6908，实测值1069.6877；[M+H+Na]2+计算值546.3400，实测值546.3368。
已经探索了在抗体-药物-缀合物(ADC)的制备中，顺铂类似物乙二胺二氯化铂(II)、作为双官能接头的Lx的潜力。这种新型接头技术的构思如下：在第一步中，具有合适配位基团的有效负载物(示踪剂或药物；也称为官能部分)与称为“Lx”的基于铂的接头配位，得到有效负载物-Lx络合物。已经表明，N-配位络合物提供了稳定的键。有趣的是，由于形成的铂络合物带电荷，因此有效负载物-Lx络合物的水溶性显著增加。缀合过程如下；将有效负载物-Lx络合物在微碱性条件下于37℃与抗体溶液混合24h，然后用硫脲进行后处理步骤以除去弱结合的络合物。已经证明，形成的缀合物在PBS中是稳定的，并且表面等离子体共振分析示出了缀合后抗体的结合亲和力没有损失。
在本申请中，研究了Lx作为ADC的接头的潜力。设计了两个Lx有效负载物(即官能部分)，即去铁胺-Lx(DFO-Lx)和澳瑞他汀F-Lx(AF-Lx)，分别用于研究体内行为和抗肿瘤作用。最终，ADC的肿瘤杀伤能力决定了它的商业成功，并且因此在大多数研究中，重点是抗肿瘤作用。然而，ADC的功效在很大程度上取决于ADC的体内稳定性和肿瘤靶向能力，并且因此ADC的体内行为信息非常重要。此外，通过研究体内行为，确定不在肿瘤中累积的ADC的命运，从而提供关于任何潜在毒性风险的信息。最简单且最可靠的体内表征方法是通过放射性标记ADC，例如在DFO螯合剂中引入PET同位素89Zr。
将DFO-Lx和AF-Lx络合物与曲妥珠单抗在37℃下缀合24h，得到具有的药物-抗体比率(DAR)在2.5和2.7之间的99％单体的ADC。通过将曲妥珠单抗替换为奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗或IgG-B12产生具有相同特点的ADC证明了缀合方法的通用性。在目前的缀合程序中，采用了超额20倍的有效负载物-Lx络合物，将DAR计入考虑时，缀合效率为约13％。对于具有的平均DAR为约2.5的缀合物，未缀合抗体的百分比始终小于5％。此外，对于平均DAR为2.5的情况，在2-4和1-5范围内的DAR群体分别占76-78％和94-96％的分子。
有趣的是，与赖氨酸缀合类似物DFO-曲妥珠单抗相比，DFO-Lx-曲妥珠单抗的DAR分布曲线是窄的，具有相当的平均DAR，这意味着较少数量的氨基酸位点参与Lx缀合技术。
通过使用DTT还原链间半胱氨酸桥分离抗体的重链和轻链，确定了mAb中Lx-有效负载物的偶联的位置。SEC-MS和SDS-PAGE示出了约90％的有效负载物与重链缀合。用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行了进一步研究以分别将Fc区域与F(ab)2或Fab分开，发现大约85％与Fc区域缀合。Lx主要结合mAb的Fc部分的这种有趣的性质是有利的，因为它减少了因此影响mAb的免疫反应性并因此影响肿瘤靶向能力的mAb结合区中缀合的变化。
在HER2表达细胞系板上测试了AF-Lx-曲妥珠单抗的体外细胞杀伤。包括了两个基准物，即FDA批准的(T-DM1)和马来酰亚胺类似物AF-Mal-曲妥珠单抗。后者模仿Seattle-Genetics使用的缀合策略。对于HER2过表达细胞系SKOV-3、BT-474、NCI-N87和SK-BR-3，所有三种缀合物示出了20至200pM范围内的IC50。有趣的是，两种基于AF的缀合物在曲妥珠单抗和T-DM1抗性细胞系中示出了皮摩尔范围内的IC50。与AF-Lx-曲妥珠单抗相比，AF-Lx的毒性为其103-104分之一低，而AF-Mal的毒性仅为AF-Mal-曲妥珠单抗的10分之一低。此外，AF-Lx的毒性为AF-Mal的102至103分之一低。
体内稳定性是ADC接头的重要要求。在血流中药物过早地从抗体上释放导致游离药物暴露于正常器官，引起不可接受的毒性。对89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和89Zr-DFO-曲妥珠单抗在荷载皮下表达HER2的NCI-N87异种移植的裸鼠中进行了比较生物分布研究，发现了对于两种缀合物除肝脏外在肿瘤和所有器官中的89Zr水平相似。该结果表明Lx接头技术允许稳定的缀合和有效的肿瘤靶向。有效负载物或间隔区的疏水性和电荷以及偶联的有效负载物的数量可能对mAb的物理化学性质产生不利影响，并因此影响药代动力学和肿瘤靶向。因此，在荷载皮下表达HER2的NCI-N87异种移植的裸鼠中对89Zr-AF-Lx-曲妥珠单抗及其马来酰亚胺缀合基准物89Zr-AF-Mal-曲妥珠单抗进行了第二次生物分布研究。除了肝脏外，Lx缀合物的89Zr在肿瘤和器官中的摄取类似于89Zr-AF-Lx-曲妥珠单抗和未缀合的89Zr-曲妥珠单抗。两项生物分布研究示出了与基准物相比，对于基于Lx的ADC的肝摄取更高。
最后，在两种不同的肿瘤模型，即NCI-N87和T-DM1抗性JIMT-1上评估了AF-Lx-曲妥珠单抗的功效。基于Lx的缀合物在两项功效研究中均优于其马来酰亚胺基准物和FDA批准的T-DM1。考虑到在体外细胞活力测定或生物分布研究中未观察到AF-Lx-曲妥珠单抗和AF-Mal-曲妥珠单抗之间的显著差异，这些结果是令人惊讶的，说明Lx增强了奥利斯他汀基缀合物的体内功效。
总之，显示了一种新的基于双官能顺铂(II)类似物Lx的过渡金属配位化学的ADC接头技术。缀合过程稳健且简单且无需抗体修饰。形成的ADC是稳定的并且保持了天然mAb的物理化学性质。此外，当与澳瑞他汀F组合时，Lx对抗肿瘤功效具有增强作用。
附图说明
图1Lx缀合技术和DFO-Lx与曲妥珠单抗的缀合的示意图。
图2DFO-Lx-曲妥珠单抗的分析表征：A.280nm处的HPLC色谱图，B.LC-MS色谱图，C.DFO-Lx-曲妥珠单抗(DAR 2.6)与DFO-曲妥珠单抗(DAR 2.9；直接与赖氨酸缀合)之间DAR分布的比较。注意，DFO-Lx的缀合提供了具有较窄DAR范围的ADC，这意味着较少的氨基酸涉及该缀合。
图3.A)AF-Lx-曲妥珠单抗的化学结构，b).AF-Mal-曲妥珠单抗的化学结构。
图4.评估整个mAb分子中DFO-Lx的结合：A.SDS-PAGE然后荧光成像仪分析非还原的和还原的DFO-Lx-曲妥珠单抗(分别为泳道1和泳道2)以及非还原和还原的DFO-曲妥珠单抗(分别为泳道3和泳道4)。请注意DFO-Lx与重链优先结合，B.在DTT还原或者胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化后有效负载物的分布。请注意DFO-Lx与Fc片段优先结合。
图5.在NCI-N87荷瘤小鼠中注射后72h89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗(灰色条)和89Zr-DFO-曲妥珠单抗(黑色条)的生物分布。
图6.体外细胞活力测定。AF-Lx-曲妥珠单抗(黑色方块)、AF-Mal-曲妥珠单抗(向上的三角形)、阿多曲妥珠单抗依酯(向下的三角形)和AF-Lx-IgG-B12(圆圈)对下述的活力的影响：A.NCI-N87，B.
MDA-MB-231，C.JIMT-1。D.比较药物-接头AF-Lx(空心的黑色方形)和AF-Mal(空心的三角形)与其相应的ADC AF-Lx-曲妥珠单抗(实心黑方形)和AF-Mal-曲妥珠单抗(实心三角形)分别对NCI-N87的细胞活力的影响。
图7.AF-Lx缀合对曲妥珠单抗在NCI-N87荷瘤小鼠中的生物分布特点的影响。A.AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr(黑色方形)、AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr(三角形)和曲妥珠单抗-89Zr(圆)的血液动力学，B.注射后96h AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr(黑色条)、AF-Mal-曲妥珠单抗-89Zr(浅灰色条)和89Zr-曲妥珠单抗(深灰色条)的生物分布，以及C.注射AF-Lx-曲妥珠单抗-89Zr后96hNCI-N87荷瘤小鼠的PET-CT图像。
图8.AF-Lx-曲妥珠单抗对A.NCI-N87荷瘤小鼠，B.JIMT-1荷瘤小鼠中的治疗功效。图例(legenda)：媒介物(灰色线，星形)，曲妥珠单抗(菱形)，阿多曲妥珠单抗依酯(向下的三角形)，AF-Lx-曲妥珠单抗，AF-Lx-曲妥珠单抗15mg/kg(黑色线条，实心方形)，AF-Lx-曲妥珠单抗30mg/kg(黑色线条，空心方形)，AF-Lx-IgG-B12(圆圈)，AF-Mal-曲妥珠单抗15mg/kg(向上的实心三角形)和AF-Mal-曲妥珠单抗15mg/kg(向上的空心三角形)。
图S1.DFO-Lx与不同mAb偶联的一致性。A.DFO-Lx-曲妥珠单抗(DAR 3.2)，B.DFO-Lx-奥滨尤妥珠单抗(DAR 2.9)和C.DFO-Lx-奥法木单抗(DAR 3.0)的LC-MS色谱图。
图S2.评估整个mAb分子中DFO-Lx的结合：通过SEC-MS对DFO-Lx-曲妥珠单抗和DFO-曲妥珠单抗的重链和轻链的DAR测定。
图S3.评估整个mAb分子中AF-Lx的结合：A.完整的，B.DTT还原的，C.胃蛋白酶还原的和D.木瓜蛋白酶还原的AF-Lx-曲妥珠单抗的SEC-MS。
图S4.A.89Zr-DFO-Lx-曲妥珠单抗和B.89Zr-DFO-曲妥珠单抗的体外血清稳定性，如通过放射-TLC，放射-HPLC，SDS-PAGE评价的，然后进行荧光成像仪分析和根据Lindmo等人的结合测定。
图S8.A.NCI-N87荷瘤小鼠，B.JIMT-1荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。图例：媒介物(灰色线条，星形)，曲妥珠单抗(菱形)，T-DM1(向下的三角形)，AF-Lx-曲妥珠单抗15mg/kg(黑色线条，实心方形)，AF-Lx-曲妥珠单抗30mg/kg(黑色线条，空心方形)，AF-Lx-IgG-B12(圆圈)，AF-Mal-曲妥珠单抗15mg/kg(实心向上三角形)和AF-Mal-曲妥珠单抗15mg/kg(空心向上三角形)。
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Claims (29)
1.细胞靶向缀合物，所述缀合物包括靶向部分和通过接头与所述靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，所述接头包括过渡金属络合物，并且其中至少90％的所述缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为4或更低。
2.根据权利要求1所述的细胞靶向缀合物，其中，至少50％的所述缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为2或3。
3.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，所述靶向部分是肽、抗体、抗体片段或纳米抗体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，在不修饰所述靶向部分的情况下进行所述官能部分与所述靶向部分的缀合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，至少70％，优选至少80％的所述官能部分与所述靶向部分的Fc部分结合，优选与抗体的所述Fc部分结合。
6.细胞靶向缀合物，所述缀合物包括靶向部分和通过接头与所述靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，所述接头包括过渡金属络合物，并且所述靶向部分抗体，并且其中至少70％的所述官能部分与所述抗体的Fc部分结合。
7.根据权利要求6所述的细胞靶向缀合物，其中，至少80％，优选至少85％的所述官能部分与所述抗体的所述Fc部分结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，所述接头包括铂络合物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，所述接头包括二齿部分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，所述官能部分是治疗性化合物、诊断化合物和/或螯合剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的细胞靶向缀合物，其中，所述靶向部分是曲妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗或奥法木单抗，并且其中所述官能部分选自超毒性药物，诸如去铁胺(DFO)、澳瑞他汀F(AF)或选自激酶抑制剂的组。
12.药物组合物，包括根据权利要求1-11中任一项所述的细胞靶向缀合物和药学上可接受的载体。
13.药物组合物，包括药学上可接受的载体和细胞靶向缀合物，所述缀合物包括靶向部分和通过接头与所述靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，所述接头包括过渡金属络合物，并且其中至少90％的所述缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为4或更低。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，至少50％的所述缀合物具有的官能部分与靶向部分的比率(DAR)为2或3。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其中，所述缀合物的所述接头包括铂络合物。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的药物组合物，其中，所述缀合物的所述接头包括二齿部分。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的药物组合物，其中，所述缀合物的所述靶向部分是肽、抗体、抗体片段或纳米抗体。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中靶向部分，其中，在不修饰所述靶向部分的情况下进行所述官能部分与所述靶向部分的缀合。
19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中，至少70％，优选至少80％的所述官能部分与所述靶向部分的Fc部分结合，优选与抗体的所述Fc部分结合。
20.根据权利要求13-19中任一项所述的药物组合物，其中，所述缀合物的所述官能部分是治疗性化合物、诊断化合物和/或螯合剂。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的药物组合物，其中，所述靶向部分是曲妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗或奥法木单抗，并且其中所述官能部分选自超毒性药物，诸如去铁胺(DFO)、澳瑞他汀F(AF)或选自激酶抑制剂的组。
22.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞靶向缀合物或根据权利要求12或13-21中任一项所述的药物组合物，用于作为药物的用途。
23.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞靶向缀合物或根据权利要求12或13-21中任一项所述的药物组合物，用于治疗癌症的用途。
24.根据权利要求1-11中任一项所述的细胞靶向缀合物或根据权利要求12或13-21中任一项所述的药物组合物，用于治疗乳腺癌或胃癌的用途。
25.用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者给药药学上有效量的权利要求1-11中任一项所述的细胞靶向缀合物或权利要求12或13-21中任一项所述的药物组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述癌症是乳腺癌或胃癌。
27.细胞靶向缀合物，用于作为药物的用途，所述缀合物包括靶向部分和通过接头与所述靶向部分结合的一个或多个官能部分，其中，所述接头包括过渡金属络合物。
28.根据权利要求27所述的细胞靶向缀合物，用于治疗癌症特别是乳腺癌或胃癌的用途。
29.根据权利要求27或28所述的细胞靶向缀合物，其中，所述缀合物的所述接头包括铂络合物。
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