CN109943665A - 一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用 - Google Patents
一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用。本发明所述探针序列包括高危型HPV16、HPV18型中的一种或两种的探针序列；所述HPV16型和HPV18型HPV探针序列均由捕获延伸探针、K型标记延伸探针和封闭探针三类探针序列组成。本发明针对人乳头瘤病毒型E6E7区域进行延伸捕获探针、K型标记探针以及封闭探针的人为优化和设计，通过QuantiMAT技术实现了头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18 E6E7 mRNA的特异性检测，能够及早发现一些微观的分子水平基因突变导致的表观改变，并表现出良好的特异性、准确度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用。
背景技术
头颈部恶性肿瘤是一种局部性的侵袭性疾病，90％以上为鳞状细胞癌。在世界范围内均是主要的公共健康问题，每年约有40多万新增病例。全球约有26％的头颈部鳞癌检测出HPV致癌基因组DNA。新近的研究表明感染有转录活性的HPV的头颈鳞癌，其基因表达谱完全不同于没有感染HPV的肿瘤。这一现象表明HPV感染在头颈鳞癌细胞肿瘤的形成过程中发挥了重要的作用。
HPV感染参与了头颈鳞癌细胞肿瘤的早期发展，表明HPV感染在其形成过程中发挥了重要的作用。已有研究发现，在头颈鳞癌组织中鉴定出的某些致癌性HPV类型与宫颈癌中的HPV类型相同，同时分子生物学实验结果显示他们还具有相同的病毒癌基因蛋白，即HPV高危型E6及E7。与宫颈癌相似，HPV16也是HPV阳性头颈癌中最常见的HPV分型。其主要的致病机制是HPV感染人类粘膜组织后，HPV DNA以游离或者整合形式进入宿主细胞内，病毒基因组中的早期区域E6及E7通过与p53、pRB、cyclinA、cyclinE及CDK2等相互作用，导致细胞加速增殖和转化。HPV感染代表了一类不同的头颈鳞癌致癌的分子通路。因而它已经逐渐被认为是继吸烟、饮酒之后的第三大头颈鳞癌的致病因素。因此，对头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18E6E7mRNA实现特异性检测，能够及早发现一些微观的分子水平基因突变导致的表观改变具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用。本发明提供的探针序列对于检测头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18E6E7mRNA有较高的特异性和灵敏度。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列，包括HPV16和/或HPV18型探针序列；所述HPV16、HPV18型探针序列均由捕获延长探针(Capture extender，CE)、标记延长探针(Labelextender，LE)和封闭探针(Blocking，BL)组成；
所述HPV16型捕获延长探针序列如SEQ ID No.1～6所示，所述HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.7～30；所述HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.31-36所示；
所述HPV18型捕获延长探针序列如SEQ ID No.37～44所示，所述HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.45～70；所述HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.71-73所示。
在一个具体实施例中，考察了本发明探针序列的灵敏度和准确度结果显示，本发明探针序列对样本检测的准确率达100％，对照组探针序列的准确率仅为43％。灵敏度也明显优于对照探针序列，表明本发明所述探针序列对头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18E6E7mRNA的检测有更高的准确度和灵敏度。因此，本发明还提供了所述探针序列在制备检测头颈鳞癌致癌基因的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测头颈鳞癌致癌基因的试剂盒包括本发明所述探针序列。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括括放大分子、预放大分子、碱性磷酸酶标记的报告探针、蛋白酶K、化学发光底物、底物催化剂、裂解液、洗脱液、探针稀释液、偶联有通用探针的载体中的一种或两种以上；
所述通用探针与权利要求1中所述捕获延伸探针的部分序列互补；
所述预放大分子包括预放大前导序列和若干倍数的放大前导序列的互补序列；
所述信号放大分子包括放大前导序列和若干倍数的报告探针互补的序列；
所述预放大前导序列与权利要求1中所述标记延长探针部分序列互补。
本发明提供的试剂盒中，预放大分子、放大分子、碱性磷酸酶(AP)标记的报告探针参考申请号为CN201610254920的专利中公开的初级信号放大链、次级信号放大链和AP偶联的报告探针序列进行设计。
在一个具体实施例中，预放大分子序列为：AAGCCGAATCCGAATACGTCGGTAAAATTCGAATGATTC(预放大分子的前导序列)-20×-AGGATCGTAAGTAACTAAGGACTACC(放大分子前导序列的互补序列)；
放大分子序列为:GGTAGTCCTTAGTTACTTACGATCCT(放大分子前导序列)-20×-GAATCCATTGAATCCTGTGATT(报告探针的互补序列)
AP偶联的报告探针序列为：AATCACAGGATTCAATGGATTC-AP。
在一些实施方案中，预放大分子序列中，放大分子前导序列的互补序列为AGGATCGTAAGTAACTAAGGACTACC，若干倍数具体为20倍。
在一些实施方案中，放大分子序列中，报告探针互补的序列为GGTAGTCCTTAGTTACTTACGATCCT GAATCCATTGAATCCTGTGATT，若干倍数具体为20倍。
在一些实施方案中，本发明采用的载体为细胞培养板。
通用探针可通过包被液包被在细胞培养板上，所述通用探针与本发明的捕获延伸探针部分序列互补配对。
在一些实施方案中，本发明提供的通用探针序列如SEQ ID No.74所示。
在一些实施方案中，所述探针稀释液包括Hepe钠盐、Hepe游离酸、无水氯化锂、十二烷基硫酸锂和Brij-35。
在一些实施方案中，化学发光底物为AMPPD或CDP-star，所述底物催化剂为十二烷基硫酸锂。
在一些实施方案中，裂解液选自Hepes钠盐、Hepes游离酸、氯化锂、乙二酸四乙酸、十二烷基硫酸锂中的一种；所述洗脱液为十二烷基硫酸锂或柠檬酸钠。
在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒还包括HPV16的阳性质控品和阴性质控品、HPV18的阳性质控品和阴性质控品。
本发明提供的探针序列由捕获延长探针、标记延长探针和封闭探针组成；捕获延伸探针的一部分序列与偶联载体(如细胞培养板)的通用探针结合，另一部分序列与目标RNA结合；K型标记延伸探针的部分序列与目标RNA结合，另一部分序列与预放大分子前导序列互补；预放大分子的重复区域与放大分子的前导序列互补；放大分子的重复区域与AP标记的报告探针互补；封闭探针用来封闭一些位点，以提高检测结果的特异性。本发明所述探针结合信号放大前体、放大体、碱性磷酸酶标记的探针，通过上述杂交，单个扩增单元可将信号放大400倍，20组扩增单元可以放大8000倍，大大提高了检测灵敏度。
在化学发光底物、信号放大前体、信号放大体以及AP报告探针均一致的前提下，采用本发明探针序列对样本检测的准确率达100％，对照组探针序列的准确率仅为43％。表明本发明所述探针序列对头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18E6E7mRNA的检测有更高的准确度。
对于同一阳性样本，采用本发明探针序列所检测到的信号值明显高于对照探针序列，结果表明本发明探针序列通过对捕获延伸探针、K型标记探针以及封闭探针的认人为优化、设计，对于头颈鳞癌主要致病亚型HPV16、18E6E7mRNA的检测具有更高的特异性、准确度和灵敏度。
具体实施方式
本发明公开了一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明试剂盒
1、探针序列
选自本发明所述高危型HPV16和/或18型的获延长探针、标记延长探针和封闭探针；
HPV16型捕获延长探针序列如SEQ ID No.1～6所示，HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.7～30；HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.31-36所示；
HPV18型捕获延长探针序列如SEQ ID No.37～44所示，HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.45～70；HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.71-73所示。
2、其他组分
与细胞培养板偶联的通用探针：序列为；TAGCTTGGGCTTAGTCGTT
预放大分子序列为：AAGCCGAATCCGAATACGTCGGTAAAATTCGAATGATTC(预放大分子的前导序列)-20×-AGGATCGTAAGTAACTAAGGACTACC(放大分子前导序列的互补序列)；
放大分子序列为:GGTAGTCCTTAGTTACTTACGATCCT(放大分子前导序列)-20×-GAATCCATTGAATCCTGTGATT(报告探针的互补序列)
AP偶联的报告探针序列为：AATCACAGGATTCAATGGATTC-AP。
化学发光底物：AMPPD。
实施例2探针序列特异性、灵敏度和准确度检测
本实施例使用一个加样臂、孵育器、化学发光判读仪、洗板机实现QuantiMAT实验操作的全自动进行。具体操作流程包括如下步骤，按照表1进行加样。
1、55度杂交3.5小时：
抓取手臂抓取加样过的微孔板，将其置于设置温度在55度的孵育器托盘中，集成软件给予指令让托盘入仓，并开始计时。
2、洗板过程实现：
孵育结束，抓取手臂从孵育器中抓到微孔板并将微孔板转移至洗板机上，洗板机根据样本数量按照预先设定步骤程序开始自动洗板，洗板结束自行归位。
3、加入预放大分子试剂：
抓取手臂将洗板结束的微孔板从洗板机上抓取到孵育器2的位置上，抓取手臂从耗材区域扎入枪头开始移液，将配置的好的预放大分子试剂依次从试剂区域转移到微孔板中。直至移液结束。
4、重复步骤1，将时间调整为40分钟；
5、重复步骤2；
6、重复步骤3，试剂改为放大分子试剂；
7、重复步骤1，将时间调整为40分钟；
8、重复步骤2；
9、重复步骤3，试剂改为探针标记物试剂；
10、重复步骤1，将温度调整为50度，时间调整为40分钟；
11、重复步骤2；
12、重复步骤3，将试剂改为底物混合液试剂；
13、重复步骤1，将温度调整为46度，时间调整为20分钟；
14、抓取手臂从孵育器托盘中抓住微孔板转移至判读仪器中，读数，分析软件根据数据计算出样本的结果值。
表1
本发明以未感染HPV16/18的喉部、口腔细胞样本为阴性质控样本，，以感染HPV的喉癌、口腔癌、口咽癌、鼻咽癌患者样本为阳性样本，采用本发明探针序列对50例阴性质控样本和50例阳性样本进行检测，确定以1.0作为正常值上限，即正常参考值为0～1.0，当检测结果≥1.0时可判定样本为HPV感染存在。
参照实施例2的操作流程，采用本发明提供的探针序列及表2所示的对照组探针序列对45例头颈鳞癌组织样本进行检测，以HPV16型armored RNA为阳性质控品。其中，通过免疫组化确定19例喉癌中有2例HPV阳性，18例口腔癌中有3例HPV阳性，6例口咽癌中有1例HPV阳性，2例鼻咽癌中有1例HPV阳性，感染型别以HPV 16型为主。检测结果值为0～1.0，判定为阴性，当检测结果≥1.0时可判定阳性，即样本感染HPV，按照该判断标准进行判断，结果见表3～5。
对照组试剂盒：表2所示的对照组探针序列及实施例1中试剂盒配套组分。
表2对照组探针序列
表3对照组探针序列检测结果
| 癌症类型 | 总例数 | 阳性 | 阴性 | 免疫组化结果 |
| 喉癌 | 19 | 1 | 18 | HPV+2例 |
| 口腔癌 | 18 | 2 | 16 | HPV+3例 |
| 口咽癌 | 6 | 0 | 6 | HPV+1例 |
| 鼻咽癌 | 2 | 0 | 2 | HPV+1例 |
表4本发明探针序列检测结果
| 癌症类型 | 总例数 | 阳性 | 阴性 | 免疫组化结果 |
| 喉癌 | 19 | 2 | 17 | HPV+2例 |
| 口腔癌 | 18 | 3 | 15 | HPV+3例 |
| 口咽癌 | 6 | 1 | 5 | HPV+1例 |
| 鼻咽癌 | 2 | 1 | 1 | HPV+1例 |
表5
上述未感染HPV的喉癌、口腔癌、口咽癌、鼻咽癌样本中，用本发明提供的探针序列进行检测，结果与免疫组化结果完全一致，结果表明，本发明探针序列特异性高，不会出现假阳性。
由表3～4结果可知，本发明探针序列能够准确检测出45例样本中7个HPV阳性样本(HPV+)，准确率为100％，对照探针序列的准确率仅为43％。
由表5可知，采用本发明探针序列能够获得更高的检测信号值，表明本发明所述探针序列具备更高的检测灵敏度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州科蒂亚生物技术有限公司
<120> 一种用于检测头颈鳞癌致癌基因检测的探针序列及其试剂盒、应用
<130> MP1901632
<160> 74
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcccttagt tttatacatg aattattgta gttttttaac gactaagccc aagcta 56
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
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<400> 2
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<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 44
<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 8
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ttaccgg 67
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<211> 52
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<400> 41
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<400> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tccaccctat tttttactag tataagatta taatttattt ttgaatcatt cgaattttac 60
cgg 63
<210> 46
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtttcggtct gaccgttttc ggttttttac gtattcggat tcggctt 47
<210> 47
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctcaaacatg gccgtgcgtt agtttttgaa tcattcgaat tttaccgg 48
<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cggggtcgtg ttgctggatc tttttacgta ttcggattcg gctt 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catgcaccga ttcttccagc actttttacg tattcggatt cggctt 46
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttcgtaaatc tgtaaataga aacttgtata ccttttttga atcattcgaa ttttaccgg 59
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gataaaaagc gtaggcacat aatacacatt tttgaatcat tcgaatttta ccgg 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgaatattg ataatgccta tattcactta tcttattttt acgtattcgg attcggctt 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgtttgcat taacatgtct ttctttttct tcatttttga atcattcgaa ttttaccgg 59
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atctggccgg tccacaccat tttttgaatc attcgaattt taccgg 46
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cttgtggctt gttctgcttg tcctttttac gtattcggat tcggctt 47
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acagcatctg ctgtagagta cgaatttttg aatcattcga attttaccgg 50
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ctcttcgttg tagctccttt ttgc 24
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accctctctt ctaatgtttt cccataaa 28
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<212> DNA
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cacgcatgac gttacacttg gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tagcttgggc ttagtcgtt 19
Claims (10)
1.一种用于检测头颈鳞癌致癌基因的探针序列，其特征在于，包括HPV16和/或HPV18型探针序列；所述HPV16、HPV18型探针序列均由捕获延长探针、标记延长探针和封闭探针组成；
所述HPV16型捕获延长探针序列如SEQ ID No.1～6所示，所述HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.7～30；所述HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.31-36所示；
所述HPV18型捕获延长探针序列如SEQ ID No.37～44所示，所述HPV16型标记延长探针序列如SEQ ID No.45～70；所述HPV16型封闭探针序列如SEQ ID No.71-73所示。
2.权利要求1所述的探针序列在制备检测头颈鳞癌致癌基因的试剂盒中的应用。
3.一种检测头颈鳞癌致癌基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述探针序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括放大分子、预放大分子、碱性磷酸酶标记的报告探针、蛋白酶K、化学发光底物、底物催化剂、裂解液、洗脱液、探针稀释液、偶联有通用探针的载体中的一种或两种以上；
所述通用探针与权利要求1中所述捕获延伸探针的部分序列互补；
所述预放大分子包括预放大分子前导序列和若干倍数的放大分子前导序列的互补序列；
所述信号放大分子包括放大分子前导序列和若干倍数的报告探针互补的序列；
所述预放大前导序列与权利要求1中所述标记延长探针部分序列互补。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为细胞培养板。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述通用探针的引物如SEQ ID No.74所示。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针稀释液包括Hepe钠盐、Hepe游离酸、无水氯化锂、十二烷基硫酸锂和Brij-35。
8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD或CDP-star，所述底物催化剂为十二烷基硫酸锂。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液选自Hepes钠盐、Hepes游离酸、氯化锂、乙二酸四乙酸、十二烷基硫酸锂中的一种；所述洗脱液为十二烷基硫酸锂或柠檬酸钠。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括HPV16的阳性质控品和阴性质控品、HPV18的阳性质控品和阴性质控品。
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