CN103114132A - 一种用于检测宫颈癌致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测宫颈癌致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。该探针特异性好，降低了假阳性率。该方法经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，重复性，稳定性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测宫颈癌致癌基因的引物探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。
背景技术
宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第3个常见的恶性肿瘤，在发展中国家是仅次于乳腺癌居第2位常见的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。2008年全球估计新发宫颈癌病例52.98万，死亡病例25.51万人，其中85%新发病例在发展中国家（Jemal，2011）。随着宫颈癌筛查的开展，发达国家宫颈癌的发病率及死亡率明显下降。
宫颈癌是目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）的持续感染相关。HPV病毒是一种双链DNA病毒，具有球形外壳，直径55nm，主要感染皮肤粘膜上皮，导致不同病变。目前已经鉴定的HPV病毒超过200种，至少30种与生殖道粘膜感染相关。HPV妇女一生中80%可感染HPV，通常在8-10个月内被自然清除，只有少数(5%)妇女呈持续感染状态。根据HPV病毒与宫颈癌的关系分为高危型和低危型，高危型与宫颈癌相关，常见的亚型有：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、67、68、73、82，宫颈鳞状细胞癌中HPV16型最多见，其次是18、45、31和33型；宫颈腺癌中HPV18和45亚型较常见。低危型与生殖道疣相关，常见的亚型有：6、11、40、42、43、44、53、54、57、61、62、70、72、81、83、CP6108、MM4、MM7、MM9、MM9等。
在癌变初期，准确、快速、便捷地对其进行检测，是控制和治疗的关键。目前，多采取子宫颈刮片细胞学、宫颈管活体组织、阴道镜等检查方法对宫颈癌进行筛查。但是上述几种方法操作繁琐、准确率较低，对实验条件要求高，不适于宫颈癌的早期诊断。
核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR（real-timePCR）灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的问题，且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于宫颈癌含量极低的样本仍然无法检测，准确率较低。
branch-DNA(bDNA)支链DNA技术利用探针捕获待测目标，经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，可以对mRNA做精确的定量检测及动态水平研究。它克服了传统的real-time PCR技术中的种种缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大即可迅速得到更加精确的实验结果。除各种普通样本外，该技术对qPCR很难分析的血液样本与保存多年后mRNA高度降解的FFPE样本同样具有极高的准确度与重现性。
目前还未见利用bDNA技术对宫颈癌致癌基因的检测的相关报道，设计、特异性强的探针具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。该探针特异性好，降低了假阳性率。该方法经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，重复性，稳定性高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针，包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
其中，标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
本发明的探针设计是针对E6/E7mRNA的靶向性设计，特异性捕获Hela细胞中的E6/E7mRNA片段。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV16致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.1或2所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.3或4所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.5或6所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV18致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.7或8所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.9或10所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.11或12所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV31致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.13或14所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.15或16所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.17或18所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV33致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.19或20所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.21或22所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.23或24所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV35致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.25或26所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.27或28所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.29或30所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV39致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.31或32所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.33或34所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.35或36所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV45致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.37或38所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.39或40所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.41或42所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV51致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.43或44所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.45或46所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.47或48所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV52致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.49或50所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.51或52所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.53或54所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV56致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.55或56所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.57或58所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.59或60所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV58致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.61或62所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.63或64所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.65或66所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV59致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.67或68所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.69或70所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.71或72所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV68致癌基因的探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.73或74所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.75或76所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.77或78所示。
本发明还提供了上述探针用于制备检测宫颈癌致癌基因的试剂盒；
其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
本发明还提供了一种用于检测宫颈癌致癌基因的试剂盒，包括探针；
探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
其中，标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
本发明还提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV16致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.1或2所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.3或4所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.5或6所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV18致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.7或8所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.9或10所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.11或12所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV31致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.13或14所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.15或16所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.17或18所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV33致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.19或20所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.21或22所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.23或24所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV35致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.25或26所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.27或28所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.29或30所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV39致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.31或32所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.33或34所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.35或36所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV45致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.37或38所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.39或40所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.41或42所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV51致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.43或44所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.45或46所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.47或48所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV52致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.49或50所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.51或52所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.53或54所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV56致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.55或56所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.57或58所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.59或60所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV58致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.61或62所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.63或64所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.65或66所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV59致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.67或68所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.69或70所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.71或72所示。
本发明提供了一种用于检测高危亚型人乳头瘤病毒HPV68致癌基因的试剂盒，包括探针，其中，探针包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
标记延伸探针的序列SEQ ID No.73或74所示；
捕获延伸探针的序列SEQ ID No.75或76所示；
预放大探针的序列SEQ ID No.77或78所示。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中还包括酶标记的放大探针、阳性校准品、阴性对照品、底物、底物催化剂、裂解液、缓冲液。
在本发明的另一些实施例中，本发明提供的试剂盒中还包括固定探针、酶标记的放大探针、阳性校准品、阴性对照品、底物、底物催化剂、裂解液、缓冲液。
作为优选，酶标记的放大探针中的所述酶为碱性磷酸酶。
作为优选，阳性校准品为高危亚型人乳头瘤病毒mRNA的同源性序列合成的DNA寡核苷酸。
本发明提供的试剂盒中，高危亚型人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68。
本发明还提供了一种用于非检测疾病用途的宫颈癌致癌基因的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：取不同浓度梯度的高危亚型人乳头瘤病毒的mRNA，通过捕获延伸探针、固定探针与固相载体连接，高危亚型人乳头瘤病毒的mRNA通过标记延伸探针与预放大探针连接后，预放大探针与酶标记的放大探针连接，获得标准复合物；取酶标记的放大探针中酶的底物及其底物催化剂与标准复合物混合，孵育，获得标准光强度，根据浓度与光强度的关系建立标准曲线；
步骤2：取宫颈上皮脱落细胞，经裂解获得待测样品的mRNA；
待测样品的mRNA通过捕获延伸探针、固定探针与固相载体连接；
待测样品的mRNA通过标记延伸探针与预放大探针连接后，预放大探针与酶标记的放大探针连接，获得待测复合物；
取酶标记的放大探针中所述酶的底物及其底物催化剂与待测复合物混合，孵育，获得待测光强度；
步骤3：根据待测光强度以及步骤1中标准曲线获得待测样品的浓度。
作为优选，本发明提供的检测方法中，孵育温度为53～56℃，孵育时间为3～4h。
与HCII法相比，本发明提供的方法阳性预测值较低。首先，这是由DNA和RNA的生理作用机理决定的，DNA是稳定的双链结构，而mRNA是单链线性结构，在整个细胞活动周期中，DNA承载者全部遗传信息，而mRNA只是在特定时期、特定的场合才会通过DNA转录出来，完成蛋白质的翻译后，mRNA就会被Rnase降解。通常DNA的这种调节时间比较短暂，导致mRNA存在周期比DNA短的很多，这就决定了RNA的阳性预测值比DNA低。其次，由HPV病毒的结构决定的。HPV病毒的结构为双链环状DNA结构，分别由L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7等片段组成，HCII检测的是L1片段，是高保守片段，这段区域主要作用是负责合成形成HPV病毒的外壳，对于早期游离的HPV感染，是普遍可以检测到L1片段的，因为，此时的HPV病毒刚侵入宿主，正处于频繁的复制期，所以，阳性预测值很高，但是，此时的感染通常是一过性的，会被人体的自身免疫系统自动清除掉，虽然，阳性预测值高，DNA会混入很多临床无关条件，如上皮衰亡细胞、细胞碎屑、已经失活的病毒、及其他干扰等，所以，DNA检测无法区分病毒活性。
与HCII相比，本发明提供的方法具有如下优点：更高的特异性，检测标本中的HPVmRNA E6/E7可直接体现宫颈细胞病变的程度，避免了HPV DNA因自身免疫清楚及其它临床无关条件造成的假阳性，特殊的探针设计避免了探针混和物与其他HPV病毒的交叉反应，能消除假阴性和假阳性；相关性，与上皮病变程度的相关性优于基于DNA的检测方法；取样简单，样品保存无需严格条件，样品可源自液基细胞学检测后剩余宫颈细胞或新鲜采集宫颈细胞，对于常温放置的48天内的标本仍然可以用于检测；可靠，无需DNA/RNA纯化，无需样品PCR扩增，从而避免繁琐操作导致的变异和错误；具有更高的敏感度，每次检测的检测范围≤200拷贝；灵活，可区分HPV各种亚型并可根据客户需要提供不同组合的HPV病毒亚型测试试剂盒；操作流程简单，无需特殊实验环境；设备简单，QuantiVirusTM冷光仪便宜可靠（96孔/12孔），可应用于不同级别医院，操作方便；反应条件的优化，孵育温度由50℃调整为53～56℃，孵育时间由过夜孵育（15h）缩短为3～4h，在得到相近或更优的试验结果的同时节省了检测所需时间。
本发明提供一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法。该探针特异性好，降低了假阳性率。该方法经过杂交、信号放大、酶促化学发光，实现对待测核酸的定量检测，不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，重复性，稳定性高。
附图说明
图1示96微孔板模拟布板示意图；其中，行A至行B示阴性对照孔，行C至行D示hela细胞株100cells/μL，行E至行F示hela细胞株50cells/μL，行G至行H示hela细胞株25cells/μL；
图2示实施例1中Hela细胞株100cells/ul、hela细胞株50cells/ul与hela细胞株25cells/ul三者的光度计平行检测相对光度单位（RLU）结果分布；
图3示实施例1中Hela细胞株100cells/ul、hela细胞株50cells/ul与hela细胞株25cells/ul三者的净平均信号值后的线性相关性图线。
具体实施方式
本发明公开了一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的用于检测宫颈癌致癌基因的探针、试剂盒及用于非检测疾病目的的检测方法中所用高危亚型人乳头瘤病毒及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取HeLa细胞设计三个梯度，原始梯度为100cells/μL，次级梯度为50cells/μL，末级梯度为25cells/μL。三个梯度的体积都一致。96微孔板模拟布板示意图如图1所示。
取样：取样前，先用棉签擦拭宫颈表面的粘液和血液，将取样器的前面刷毛部分轻轻的深插入子宫颈的通道内，以便后面刷毛能够完全接触到子宫颈移行处，柔和的向前抵住取样器，并按同一个时针方向转动取样器3-5周整。
样本处理：恒温箱设置到裂解所需温度65℃；将离心管和标本对应编号，确认无误；标本管内液体混匀后转移到离心管中，3000rpm、离心5min，倒掉上清，加2ml去离子水、悬浮沉淀，3000rpm、5min离心，倒掉上清；每个样本加入200μL裂解液、400μL去离子水、5μL蛋白酶K，混匀后放入恒温箱65℃孵育1小时，间或混匀一两次；如果样本量大，则裂解液、去离子水、蛋白酶K配成裂解混合液（参照有质控试剂配置表），每个样本加入605μL细胞裂解液。
布板：提前20min配液（准备配液管，管外标注对照/样本缓冲液，以便区分），准备封板贴纸；将96孔捕获包被板提前20min取出，放置至室温；所有-20℃保存试剂均放置在冰上溶解，使用后尽快放入冰箱保存；在标本裂解完成后，取出标本，将恒温箱调至杂交所需温度55℃；本实验需要2个质控孔、2个空白对照及实际标本，故需要配置两份缓冲液（对照缓冲液和标本缓冲液）；
每孔缓冲液组分：
对照缓冲液
标本缓冲液
对照孔：1）空白孔：2μL去离子水+98μL对照缓冲液
2）质控孔：2μL阳性质控+98μL对照缓冲液
样本孔：50μL标本+50μL标本缓冲液。
布板完成后，用封板贴纸封板，放入55℃恒温箱3.5h（此步骤可以选择过夜孵育）；在杂交捕获期间，可以配置1×洗脱液（参照有质控试剂配比表）。
加标本时，要取上清液，遇到粘性标本，可在标本中提留时间长些，让移液器有足够时间吸液，移出液面时，枪尖在管壁来回滑动几下，以便割断粘液；加完标本可直接加入标本缓冲液，避免了调移液器；加水时，取2μL去离子水，在孔上方先打成水珠状，慢慢接近液面，直到接触液面即可。
其中，检测探针包括标记延伸探针、捕获延伸探针和固定探针；
标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示。
信号放大：
1、配置预放大、放大、探针标记物溶液，可在杂交捕获时间结束配置，根据个人操作速度选择配置时间（参照有质控试剂配比表配置）；
2、由于预放大、放大、探针标记三步需要相同的稀释液，且用量相同，可同时取3个配液管，做好标记，同时加入稀释液，在孵育时间结束前2min加入预放大分子、放大分子、探针标记物，混匀即可）;
3、备3个配液管，做好编号，1号管加入稀释液、预放大分子，混匀。2号管、3号管分别加入稀释液备用；
4、杂交孵育时间结束后，取板，用刀片割开待检区封板纸，倒尽板内液体（倒液时要迅速，避免孔间污染）；
5、用预先配好的1×洗脱液洗板，每孔200μL，洗3次，在纱布或吸水纸上拍尽孔内液体；
6、将配好的1号管，预放大分子溶液加入板中，每孔100μL（注意：若五六步用同一把移液器，请注意调整量程，第五步为200，第六步为100）；
7、封板贴纸封板，放入恒温箱55℃，孵育40min；
8、重复4-5步骤，放大分子加入2号管，混匀后每孔100μL加入板中；
9、封板贴纸封板，放入恒温箱55℃，孵育40min；
10、重复4-5步骤，注意，取板时将恒温箱温度调至50℃，探针标记物加入3号管，混匀后每孔100μL加入板中；
11、封板贴纸封板，放入恒温箱50℃，孵育40min。
如果杂交捕获过夜孵育，则预放大分子、放大分子、探针标记物杂交孵育时间增加至50min。
其中，预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
添加底物：配置底物溶液（参照有质控试剂配比表）：孵育时间结束前5-10min配置底物溶液，准备配液管，加入底物和底物催化剂，混匀后避光保存；孵育结束，取板，同时将恒温箱温度调至46℃；用刀片割开待检区封板纸，倒尽板内液体（倒液时要迅速，避免孔间污染），1×洗脱液洗板，每孔200μL，洗3次，在纱布或吸水纸上拍尽孔内液体；将配好的底物溶液加入板中，每孔100μL（注意：若三四步用同一把移液器，请注意调整量程，第三步为200，第四步为100）；封板后放入恒温箱46℃，20min。
读板：根据标准品获得光强度与浓度制作标准曲线，根据待测品的光强度结合标准曲线获得待测品的浓度。
读板结果见表1，图2至图3。
表196微孔板读板结果
从数据中可以看出，阴性对照的平均值为4442，标准差值为257，变异系数为6%；hela细胞株100cells/ul的平均值为524200，标准差为12068，变异系数为2%；hela细胞株50cells/ul的平均值为317520，标准差为5195，变异系数为2%；hela细胞株25cells/ul的平均值为138676，标准差为6304，变异系数为5%；所有样品的检测孔间CV均小于6%。说明检测方法的变异系数小，准确度高，所有样品的信号值与浓度呈正线性相关性。R^2=0.9983接近于1.0说明检测方法的灵敏度高，线性好。
实施例2
取样：取样前，先用棉签擦拭宫颈表面的粘液和血液，将取样器的前面刷毛部分轻轻的深插入子宫颈的通道内，以便后面刷毛能够完全接触到子宫颈移行处，柔和的向前抵住取样器，并按同一个时针方向转动取样器3-5周整。
样本处理：恒温箱设置到裂解所需温度65℃；将离心管和标本对应编号，确认无误；标本管内液体混匀后转移到离心管中，3000rpm、离心5min，倒掉上清，加2ml去离子水、悬浮沉淀，3000rpm、5min离心，倒掉上清；每个样本加入200μL裂解液、400μL去离子水、5μL蛋白酶K，混匀后放入恒温箱65℃孵育1小时，间或混匀一两次；如果样本量大，则裂解液、去离子水、蛋白酶K配成裂解混合液（参照有质控试剂配置表），每个样本加入605μL细胞裂解液。
布板：提前20min配液（准备配液管，管外标注对照/样本缓冲液，以便区分），准备封板贴纸；将96孔捕获包被板提前20min取出，放置至室温；所有-20℃保存试剂均放置在冰上溶解，使用后尽快放入冰箱保存；在标本裂解完成后，取出标本，将恒温箱调至杂交所需温度55℃；本实验需要2个质控孔、2个空白对照及实际标本，故需要配置两份缓冲液（对照缓冲液和标本缓冲液）；
每孔缓冲液组分：
对照缓冲液
标本缓冲液
对照孔：1）空白孔：2μL去离子水+98μL对照缓冲液
2）质控孔：2μL阳性质控+98μL对照缓冲液
样本孔：50μL标本+50μL标本缓冲液。
布板完成后，用封板贴纸封板，放入55℃恒温箱3.5h（此步骤可以选择过夜孵育）；在杂交捕获期间，可以配置1×洗脱液（参照有质控试剂配比表）。
加标本时，要取上清液，遇到粘性标本，可在标本中提留时间长些，让移液器有足够时间吸液，移出液面时，枪尖在管壁来回滑动几下，以便割断粘液；加完标本可直接加入标本缓冲液，避免了调移液器；加水时，取2μL去离子水，在孔上方先打成水珠状，慢慢接近液面，直到接触液面即可。
其中，检测探针包括标记延伸探针、捕获延伸探针和固定探针；
标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示。
信号放大：
1、配置预放大、放大、探针标记物溶液，可在杂交捕获时间结束配置，根据个人操作速度选择配置时间（参照有质控试剂配比表配置）；
2、由于预放大、放大、探针标记三步需要相同的稀释液，且用量相同，可同时取3个配液管，做好标记，同时加入稀释液，在孵育时间结束前2min加入预放大分子、放大分子、探针标记物，混匀即可）;
3、备3个配液管，做好编号，1号管加入稀释液、预放大分子，混匀。2号管、3号管分别加入稀释液备用；
4、杂交孵育时间结束后，取板，用刀片割开待检区封板纸，倒尽板内液体（倒液时要迅速，避免孔间污染）；
5、用预先配好的1×洗脱液洗板，每孔200μL，洗3次，在纱布或吸水纸上拍尽孔内液体；
6、将配好的1号管，预放大分子溶液加入板中，每孔100μL（注意：若五六步用同一把移液器，请注意调整量程，第五步为200，第六步为100）；
7、封板贴纸封板，放入恒温箱55℃，孵育40min；
8、重复4-5步骤，放大分子加入2号管，混匀后每孔100μL加入板中；
9、封板贴纸封板，放入恒温箱55℃，孵育40min；
10、重复4-5步骤，注意，取板时将恒温箱温度调至50℃，探针标记物加入3号管，混匀后每孔100μL加入板中；
11、封板贴纸封板，放入恒温箱50℃，孵育40min。
如果杂交捕获过夜孵育，则预放大分子、放大分子、探针标记物杂交孵育时间增加至50min。
其中，预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
添加底物：配置底物溶液（参照有质控试剂配比表）：孵育时间结束前5-10min配置底物溶液，准备配液管，加入底物和底物催化剂，混匀后避光保存；孵育结束，取板，同时将恒温箱温度调至46℃；用刀片割开待检区封板纸，倒尽板内液体（倒液时要迅速，避免孔间污染），1×洗脱液洗板，每孔200μL，洗3次，在纱布或吸水纸上拍尽孔内液体；将配好的底物溶液加入板中，每孔100μL（注意：若三四步用同一把移液器，请注意调整量程，第三步为200，第四步为100）；封板后放入恒温箱46℃，20min。
读板：根据标准品获得光强度与浓度制作标准曲线，根据待测品的光强度结合标准曲线获得待测品的浓度。
HPV DNA（HC2法）数据与HPV mRNA数据对比：
收集标本共86例，结合细胞学检测结果，DNA检测结果和宫颈稳态检测试剂盒检测结果，见表2、3。
表2不同TBS级别样本分别用DNA方法学与RNA方法学的阳性率比较
DNA检测阳性率为53.5％，RNA检测阳性率为37.2%。从表中看出，DNA的检测阳性率要高于RNA的检测阳性率。
表3不同TBS级别样本以DNA检测结果印证RNA检测的阳性率
由表中可以看出，DNA检测阳性率虽然高于RNA，但是，RNA检测的阴性预测值要高于DNA检测。
实验的重复性：结果见表4。
表4同一份样本重复两次实验结果的重现率
同一份样本使用本发明的检测方法最终平均重现率达到85%。证明本发明的重复性良好。
细胞学与我们数据相关性：细胞学读片结果和宫颈稳态检测试剂盒检测结果，见表5。
表5大批量TBS已分级样本使用本发明的检测阳性率
| 细胞学结果 | 宫颈稳态检测阳性 | 宫颈稳态检测阴性 | 总计 | 阳性率 |
| 阴性 | 291 | 1260 | 1551 | 19% |
| ASC-US | 660 | 2110 | 2770 | 24% |
| ASC-H | 201 | 280 | 481 | 42% |
| LSIL | 580 | 361 | 941 | 62% |
| HSIL* | 411 | 441 | 852 | 45% |
| 总计 | 2143 | 4452 | 6595 | 32% |
由表中数据可知随着宫颈癌TBS分级上走，本发明的检测阳性率呈行进性上扬。说明本发明对宫颈癌临床各阶段的行进发展有良好的监测作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于检测宫颈癌致癌基因的探针，其特征在于，包括捕获延伸探针、标记延伸探针和预放大探针；
其中，所述标记延伸探针的序列如SEQ ID No.1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、43、44、49、50、55、56、61、62、67、68、73、74中任一序列所示；
所述捕获延伸探针的序列如SEQ ID No.3、4、9、10、15、16、21、22、27、28、33、34、39、40、45、46、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76中任一序列所示；
所述预放大探针的序列SEQ ID No.5、6、11、12、17、18、23、24、29、30、35、36、41、42、47、48、53、54、59、60、65、66、71、72、77、78中任一序列所示。
2.根据权利要求1所述的探针用于制备检测宫颈癌致癌基因的试剂盒。
3.一种用于检测宫颈癌致癌基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标记的放大探针、阳性校准品、阴性对照品、底物、底物催化剂、裂解液、缓冲液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括固定探针。
6.根据权利要求4所述酶标记的检测探针，其特征在于，所述酶标记的放大探针中的所述酶为碱性磷酸酶。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性校准品为高危亚型人乳头瘤病毒mRNA的同源性序列合成的DNA寡核苷酸。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述高危亚型人乳头瘤病毒为HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59或HPV68。
9.一种用于非检测疾病用途的宫颈癌致癌基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取不同浓度梯度的高危亚型人乳头瘤病毒的mRNA，通过捕获延伸探针、固定探针与固相载体连接，所述高危亚型人乳头瘤病毒的mRNA通过标记延伸探针与预放大探针连接后，所述预放大探针与酶标记的放大探针连接，获得标准复合物；取所述酶标记的放大探针中所述酶的底物及其底物催化剂与所述标准复合物混合，孵育，获得标准光强度，根据浓度与光强度的关系建立标准曲线；
步骤2：取宫颈上皮脱落细胞，经裂解获得待测样品的mRNA；
所述待测样品的mRNA通过捕获延伸探针、固定探针与固相载体连接；
所述待测样品的mRNA通过标记延伸探针与预放大探针连接后，所述预放大探针与酶标记的放大探针连接，获得待测复合物；
取所述酶标记的放大探针中所述酶的底物及其底物催化剂与所述待测复合物混合，孵育，获得待测光强度；
步骤3：根据所述待测光强度以及步骤1中所述标准曲线获得所述待测样品的浓度。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述孵育温度为53～56℃，孵育时间为3～4h。
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