CN109943597B - 一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，该方法包括以下步骤：（1）将固定液泵入酶膜反应器中；（2）将s‑羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，使两者酶活都为10ku/L‑100ku/L，随后泵入酶膜反应器中，并在10‑20℃下循环1h‑3h；（3）将含有浓度为5%‑30%的4‑氯乙酰乙酸乙酯、浓度为50‑300g/L的葡萄糖、浓度为0%‑70%的有机溶剂混合溶液泵入酶膜反应器，并进行循环；（4）待酶催化反应开始6‑24h后，在膜的另一侧通入和反应中相同的有机溶剂，并进行循环。该利用酶膜反应器耦合萃取制备s‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的方法，利用酶膜反应器耦合萃取制备s‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，可以源源不断的收集产物，解除产物对酶的抑制或者对细胞的毒害。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体为一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。
背景技术
s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的药物中间体和手性醇，经过氰化、还原等反应后，可以用于很多活性药物的合成，更是合成全球销量排名前十的他汀类药物立普妥的关键手性中间体，市场需求量极大。
制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯主要采用生物方法，目前普遍使用的方法是采用微生物法制备羰基还原酶和辅酶再生系统，然后利用这两个酶生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯合成s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，由于s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯不溶于水，且对细胞/酶有较大的毒性，因此一般普遍采用水/有机溶剂两相体系反应，可以使产物在水相中保持低浓度，减少其对细胞的毒害作用。
但是，由于酶或者细胞的存在，会使有机溶剂和水发生乳化成为均一相，对后续的萃取工艺产生了困难，降低了得率，专利文献CN104651292A公开了一种利用大孔吸附树脂原位移除底物产物抑制的方法，但是此种方法需用大量的洗脱剂，且需要树脂再生，会产生大量的废水和固废，操作繁琐，成本也较大。
因此，研究新型的无污染的、可连续生产的、能耗小、成本低、产率较高、提取纯度较高的酶法以及萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将固定液泵入酶膜反应器中，在25℃下循环30min-2h；
（2）将s-羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，使两者酶活都为10ku/L-100ku/L，随后泵入酶膜反应器中，并在10-20℃下循环1h-3h；
（3）将含有浓度为5%-30%的4-氯乙酰乙酸乙酯、浓度为50-300g/L的葡萄糖、浓度为0%-70%的有机溶剂混合溶液泵入酶膜反应器，并进行循环；
（4）待酶催化反应开始6-24h后，在膜的另一侧通入和反应中相同的有机溶剂，并进行循环，待酶膜反应器中不含有产物时，整个工艺过程结束。
优选的，所述膜，可以是陶瓷膜、混合纤维酯微孔滤膜、硝酸纤维素滤膜、聚偏氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜、再生纤维素滤膜、聚酰胺滤膜、聚四氟乙烯滤膜以及聚氯乙烯滤膜以及上述材料的改性复合膜。
优选的，所述膜的截留精度为1kD-100kD。
优选的，所述步骤（1）所使用的固定液可以是戊二醛、环氧氯丙烷、己二胺、顺丁烯二酸、双偶氮苯。
优选的，所述步骤（2）所使用的s-羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶可以是酶粉、酶液、基因工程菌中的一种或多种。
优选的，所述步骤（3）所述的有机溶剂可以是乙酸乙酯、醋酸丁酯、甲苯、二甲苯、辛醇、氯仿、异丙醇、正己烷、环己烷、正丁醇、异丁醇、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或者两种。
优选的，所述步骤（3）中，温度控制为20-40℃，pH控制在5.0-8.0，酶反应时间为6-24h。
优选的，所述步骤（4）中，温度控制为20-40℃，膜间压差控制在0.02-0.5Mpa。
优选的，所述该方法所使用的气相色谱仪为FULI9790气相色谱仪，其中，化学纯度检测条件为：检测器选用FID检测器，色谱柱选用SE-54毛细管色谱柱（30m*0.32mm*0.5μm），进样量2.0μL，汽化室温度250℃，检测器温度260℃，采取程序升温方式：130℃保持5min，每分钟升温5℃，升温到240℃时保持10min；光学纯度检测条件为：检测器选用FID检测器，色谱柱选用GC/CP-Chirasil-DexCB，进样量10μL，汽化室温度280℃，检测器温度280℃，采取程序升温方式：110℃保持2min，每分钟升温2℃，升温到160℃时保持2min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可以源源不断的收集产物，解除产物对酶的抑制或者对细胞的毒害，摩尔转化率得以提高，更加有利于工业化生产；该方法能够减少在反应以及萃取过程中的乳化现象，提高收率，减少有机溶剂的损耗，且无需萃取多次，操作简单方便，有利于规模化工业生产。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将戊二醛泵入酶膜反应器中，在25℃下循环30min；
（2）将s-羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，使两者酶活都为10ku/L，随后泵入酶膜反应器中，并在20℃下循环1h，所使用的膜为陶瓷膜，截留精度为50kD；
（3）将含有浓度为10%的4-氯乙酰乙酸乙酯、浓度为100g/L的葡萄糖、浓度为10%的乙酸乙酯混合溶液泵入酶膜反应器，并进行循环，温度控制为30℃，pH控制在6.5，酶反应时间为12h；
（4）待酶催化反应开始8h后，在膜的另一侧通入乙酸乙酯，并进行循环，温度控制为30℃，膜间压差控制在0.2Mpa，萃取时间为4h，萃取结束后，检测产物的纯度以及含量，并计算收率，最终产品的纯度是96.3%，收率为95%。
实施例2
一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将戊二醛泵入酶膜反应器中，在25℃下循环30min；
（2）将s-羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，使两者酶活都为50ku/L，随后泵入酶膜反应器中，并在15℃下循环2h，所使用的膜为PVDF中空纤维膜，截留精度为5kD；
（3）将含有浓度为15%的4-氯乙酰乙酸乙酯、浓度为150g/L的葡萄糖、浓度为40%的醋酸丁酯混合溶液泵入酶膜反应器，并进行循环，温度控制为30℃，pH控制在7.2，酶反应时间为24h；
（4）待酶催化反应开始18h后，在膜的另一侧通入醋酸丁酯，并进行循环，温度控制为30℃，膜间压差控制在0.5Mpa，萃取时间为8h，萃取结束后，检测产物的纯度以及含量，并计算收率，最终产品的纯度是99.5%，收率为99%。
本发明所使用的气相色谱仪为FULI9790气相色谱仪，化学纯度检测条件为：检测器：FID检测器，色谱柱：SE-54毛细管色谱柱（30m*0.32mm*0.5μm）；进样量2.0μL；汽化室温度250℃，检测器温度260℃；采取程序升温方式：130℃保持5min，每分钟升温5℃，升温到240℃时保持10min；
光学纯度检测条件为：检测器：FID检测器，色谱柱：GC/CP-Chirasil-DexCB；进样量10μL；汽化室温度280℃，检测器温度280℃；采取程序升温方式：110℃保持2min，每分钟升温2℃，升温到160℃时保持2min。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）将戊二醛泵入酶膜反应器中，在25℃下循环30min-2h；
（2）将s-羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，使两者酶活都为10ku/L-100ku/L，随后泵入酶膜反应器中，并在10-20℃下循环1h-3h；
（3）将含有浓度为5%-30%的4-氯乙酰乙酸乙酯、浓度为50-300g/L的葡萄糖、浓度为0%-70%的有机溶剂混合溶液泵入酶膜反应器，并进行循环；
（4）待酶催化反应开始6-24h后，在膜的另一侧通入和反应中相同的有机溶剂，并进行循环，萃取时间为4h或8h，整个工艺过程结束。
2.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述膜，是陶瓷膜、混合纤维酯微孔滤膜、硝酸纤维素滤膜、聚偏氟乙烯滤膜、醋酸纤维素滤膜、再生纤维素滤膜、聚酰胺滤膜、聚四氟乙烯滤膜以及聚氯乙烯滤膜以及上述材料的改性复合膜。
3.根据权利要求2所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述膜的截留精度为1kD-100kD。
4.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述步骤（2）所使用的s-羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶是酶粉、酶液、基因工程菌中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述步骤（3）所述的有机溶剂是乙酸乙酯、醋酸丁酯、甲苯、二甲苯、辛醇、氯仿、异丙醇、正己烷、环己烷、正丁醇、异丁醇、邻苯二甲酸二丁酯中的一种或者两种。
6.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，温度控制为20-40℃，pH控制在5.0-8.0，酶反应时间为6-24h。
7.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，温度控制为20-40℃，膜间压差控制在0.02-0.5Mpa。
8.根据权利要求1所述的一种利用酶膜反应器耦合萃取制备s-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于：所述该方法所使用的气相色谱仪为FULI9790气相色谱仪，其中，化学纯度检测条件为：检测器选用FID检测器，色谱柱选用SE-54毛细管色谱柱30m*0.32mm*0.5μm，进样量2.0μL，汽化室温度250℃，检测器温度260℃，采取程序升温方式：130℃保持5min，每分钟升温5℃，升温到240℃时保持10min；光学纯度检测条件为：检测器选用FID检测器，色谱柱选用GC/CP-Chirasil-DexCB，进样量10μL，汽化室温度280℃，检测器温度280℃，采取程序升温方式：110℃保持2min，每分钟升温2℃，升温到160℃时保持2min。
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