NO20100392A1

NO20100392A1 - Fremgangsmate for fremstilling av fettsyrealkylestere fra lipider i en membrankontraktor

Info

Publication number: NO20100392A1
Application number: NO20100392A
Authority: NO
Inventors: Eddy G Torp; Andreia Manuela Martins Miranda; Inga Marie Aasen
Original assignee: Due Miljo As
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2011-09-19
Also published as: EP2547780A1; JP2013524779A; US20130065283A1; PE20130985A1; WO2011115503A1; CA2798782A1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse omhandler en ny fremgangsmåte for fremstilling av fettsyrealkylestere fra fettsyreinneholdende lipider, det vil si mono-, di- og triglyserider og fosfolipider, i en membrankontraktor.

Description

1. Fagområde for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omhandler en ny fremgangsmåte for fremstilling av fettsyrealkylestere fra lipider, dvs. mono-, di- og triglyserider og fosfolipider, i en membrankontaktor.

2. Oppfinnelsens bakgrunn

Langkjedede omega-3 flerumettede fettsyrer er essensielle fettsyrer for mennesker og må tilføres gjennom kostholdet. Av disse har EPA (eikosapentaen syre, C20:5 A5,8,11,14,17) og DHA (dokosaheksaen syre, C22:6 A4,7,10,13,16,19) spesielle helsefordeler og brukes ikke bare som kosttilskudd, men også farmasøytisk for behandling av hjerte- og karsykdommer (Narayan et al., 2006, Food Rev Internat 22: 291-307). For anrikning av oljer til bruk i funksjonelle matvarer, dyrefor og for medisinske formål, er det behov for konsentrat av fettsyrer eller deres alkylester derivater.

Fettsyre alkylestere produseres fra vegetabilske og marine oljer ved reaksjon med en alkohol i nærvær av en katalysator. For kjemisk transesterifisermg benyttes en basisk katalysator eller f. eks. natrium metoksid eller natrium etoksid, avhengig av ønsket produkt. Et annet alternativ er enzymatisk transesteirfisermg, eller alkoholyse, ved bruk av lipaser. Den kjemiske strukturen av fettsyren og dens posisjon på glyserolmolekylet påvirker adgangen for enzymet. Derfor vil de enklere tilgjengelige fettsyrene frigjøres først. Enzymatisk alkoholyse har tidligere vært benyttet for å anrike glyseridrfaksjonen med LC-PUFA, som EPA og DHA, som beskrevet av f. eks. Haraldsson et al. (1997, JAOCS, 74: 1419-1424) og Lyberg og Adlercreutz (2008, Eur. J. Lipid Sei. Technol., 110: 317-324) og Patent No. US2006/0148047 Al.

Norsk patentsøknad nr 20092243 beskriver en ny fremgangsmåte for å utvinne fettsyrer fra vannholdig biomasse i en membrankontaktormodul. Vi har funnet at tilsvarende membrankontaktor også kan brukes til å fraksjonere fettsyre alkylestere fra lipider.

3. Beskrivelse av oppfinnelsen

En hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor å frembringe en ny fremgangsmåte for fremstilling av fettsyrealkylestere (FAAE).

En annen hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny fremgangsmåte for fremstilling av alkylestere av langkjedede flerumettede fettsyrer (LC-PUFA).

Enda en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny fremgangsmåte for å oppnå alkylestere av omega-3 og/eller omega-6 fettsyrer.

Enda en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å frembringe en ny fremgangsmåte for å oppnå alkylestere av omega-3 fettsyrene DHA og EPA.

Disse og ytterligere hensikter oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelsen omhandler en fremgangsmåte for fraksjonering av fettsyrealkylestere (FAAE) fra lipider i en membrankontaktor, omfattende følgende trinn:

a) enzymatisk alkoholyse av lipidene for å oppnå FAAE på en sekvensiell måte

b) føding av reaksjonsblandingen a) til fødekammeret A i nevnte membrankontaktor og

c) separering av FAAE over membranen til produktkarnmeret B av nevnte membrankontaktor, inneholdende et organisk løsningsmiddel eller en blanding av

løsningsmidler.

I denne sammenheng inkluderer betegnelsen lipider mono-, di- og triglycerider og fosfolipider.

En skjematisk representasjon av memhrankontaktor-enheten er vist i figur 1.

Den enzymatiske reaksjonen skjer i en enzymreaktor R som inneholder lipider, alkohol, enzym og, om nødvendig, andre løsningsmidler. Enzymene er foilrmnvis irnmobilisert på en bærer som lett kan fjernes. Reaksjonsblandingen, som inneholder frigitte FAAE, fødes til fødekammeret A av membrankontaktoren og tilbake til reaktor R. Et organisk løsningsmiddel eller blanding av løsningsmidler sirkuleres fra en produktgjenvinningstank T til produktkarnmeret B av membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstank T, mens FAAE transporteres over membranen M ved diffusjon fra kammer A, til kammer B hvor FAAE akkumulerer. I figur 1 indikerer pilen i membranen reming av transport.

Denne nye fremgangsmåten benytter enzymatisk alkoholyse for å oppnå en sekvensiell frigivelse av fettsyre alkylestere, kombinert med membranifltrering for fraksjonering og separering av FAAE. Sekvensiell frigivelse oppnås ved å la en første lipase få virke for en lenger periode eller å tilsette en annen lipase. I første trinn dannes FAAE av mettede og monoumettede medium- til langkjedede fettsyrer, spesielt C16 og Cl 8, ved hjelp av en første lipase. I siste trinn dannes FAAE av medium- til langkjedede flerumettede fettsyrer, spesielt DHA og EPA, ved å la den første lipasen virke en lenger periode eller ved å tilsette en annen lipase. Mellom første og siste trinn kan det gjennomføres ytterligere trinn, avhengig av ønskede fettsyrealkylestere. De fleste FAAE dannet i første trinn, separeres over membranen før neste trinn initieres.

HydrofUe og hydrofobe membraner kan benyttes, med hydrofobe membraner som mest sannsynlige valg dersom upolare løsningsmidler skal anvendes.

Hydrofobe membraner kan lages av ethvert hydrofobt polymermateriale, som for eksempel polyimider. Forskjellige polymerer kan benyttes, fortrinnsvis, men ikke begrenset til Lenzing P84 og Matrimid 5218. Membranene kan forsterkes av et porøst bærelag framstilt av for eksempel ikke-vevd polyester herdet materiale.

Membraner anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse kan være porøse eller ikke-porøse. Fullstendig belagte asymmetriske polyirmdmembraner framstilt ved fase inversjon kan anvendes (GB Patent Søknad No. 0909967.2). Membranen bør fungere som en barriere mellom FAAE og ureagerte glyserider.

Konfigurasjon for membrankontaktor-enheten tilpasses den valgte membranutformingen. Enhver utforming kjent av fagpersoner innen teknikken, slik som spiral, hulfiber eller flate membraner kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.

Lipid alkoholyse utføres ved å la mono-, di-, og triglyserider og fosfolipider reagere med en alkohol for å frigi FAAE. Reaksjonen katalyseres av ett eller flere enzymer. Lipider kan være av enhver opprinnelse, slike som animalske, vegetabilske eller mikrobielle, men av spesiell interesse er marine og mikrobielle oljer som inneholder LC-PUFA, slik som EPA og/eller DHA. Marine oljer kan være fra enhver marin biomasse eller marine dyr, slik som alger, zooplankton, fisk og pattedyr.

FAAE som kan separeres i henhold til foreliggende oppfinnelse, er FAAE av alle interessante fettsyrer. Dette kan være alkylestere av medium- til langkjedede fettsyrer bestående av fjorten til tjue karbonatomer, enten mettede eller monoumettede. Eksempler er de mettede fettsyrene myristinsyre (C14:0), palmitinsyre (Cl6:0), stearinsyre (Cl8:0) og arakidonsyre (C20:0), og de monoumettede oljesyre (C18:l) og gadoleinsyre (C20:l). Imidlertid, de foretrukne FAAE for separering i henhold til foreliggende oppfinnelse er alkylestere av langkjedede, flerumettede fettsyrer (LC-PUFA) med en karbonfcjede som er lenger enn atten karbonatomer, og minst tre dobbeltbindinger, særlig EPA og DHA.

Enzymene som anvendes er lipaser, f. eks., men ikke begrenset til, lipaser av mikrobiell opprinnelse, slik som 1,3- posisjonsspesifikke og ikke-spesifikke lipaser fra Candida rugosa, Candida cylindracea, Candida antarctica, Pseudomonas sp, Mucor Javanicus, Mucor mihei, Thermomyces lanuginosus (LipozymeTL 100L), og blandinger derav. Selektivitet med hensyn til fettsyrer og frigivelseshastigheten for de enkelte fettsyrealkylesterene er kriterier for valg av best egnede enzym.

Lipasene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, kan immobiliseres på et lett separerbart fast bæremateriale. Det er vanlig praksis å immobilisere enzym ved adsorpsjon til for eksempel kelitt- partikler (Torres et al, 2008, Biokjemisk Engineering Journal, 42:105-110), polypropylen (Lyberg et al, 2008, Eur. J. Lipid Sei. Technol., 110: 317-324) eller i membranen (Giorno et al, 2006, Journal av Membran Science, 276: 59-67). Nyligere er det også introdusert materialer slik som nanofibere og magnetiske nanopartikler (Prakasham et al, 2007, J. Phys. Chem. C, 111: 3842-3847; Wang et al, 2009, J. Mol. Catal. B., 56: 189-195).

Alkoholen anvendt i alkoholysereaksjonen bør fortrinnvis velges fra lavere alkylalkoholer (Cl-C6), basert på anvendelsen av produktet og/eller krav knyttet til videre rensing. Tilsats av flere løsningsmidler i fødefasen kan vurderes dersom det er nødvendig å forbedre separasjonen mellom reagerte og ikke-reagerte glyserider og/eller forbedre flytegenskapene.

Produktfasen som sirkulerer fra produktgjenvinningstank T til produktkammer B i membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstank T, er til å begynne med fylt med et egnet organisk løsningsmiddel eller en blanding av løsningsmidler. Fortrinnvis består løsningsmiddelet eller løsningsnn^delblandingen av en alkohol som spesifisert før, og/eller et upolart løsningsmiddel, fortrinnvis, men ikke begrenset til heksan, cycloheksan, heptan, pentan, toluen, dikloretan, diklormetan, dietylleter, etyllacetat, aceton, eller enhver blanding derav.

I en utførelsesform tilsettes en støkiometrisk mengde av alkohol, eller et lite overskudd, og immobilisert enzym til lipidene i fødefasen. Reaksjonen skjer i enzymreaktoren R inntil mettede og monoumettede fettsyre alkylestere er frigitt. Reaksjonsblandingen fødes så til kammer A i membrankontaktoren. Fødefasen består nå av FAAE, ikke-reagerte glyserider og glyserol, og eventuelt en restmengde av alkohol. Kun frigitte FAAE passerer gjennom membranen til produktfasen i kammer B, hvor mottakende løsningsmiddel eller blanding av løsningsmidler, sirkulerer.

Når ønsket separasjon er oppnådd, tilsettes en mengde alkohol nødvendig for å reagere med resterende mono- og diglyserider i enzymreaktoren R. Første enzym kan nå erstattes med et annet. Når alkoholysen er fullstendig, tilføres føden igjen til kammer A i membrankontaktoren, og de dannete FAAE vil passere igjennom membran M til produktfasen i kammer B, som nå er erstattet med rent løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding.

Mellom første og siste trinn, kan ytterligere trinn gjennomføres, avhengig av ønskede fettsyrealkylestere.

Prosessbetingelsene vil variere avhengig av membran, råmateriale, enzym, løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding, og fettsyrealkylestere som skal fraksjoneres. Opumahsering av prosessbetingelsene er innenfor kunnskapen til fagpersonen innen teknikken og vil utføres i henhold til dette.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres som en baten prosess, en serni-kontinuerlig eller en kontinuerlig prosess. Dersom en semi-kontinuerlig eller en kontinuerlig prosess foretrekkes, kan andelen etanol i reaksjonsblandingen kontrolleres ved diafiltrering.

In en foretrukken utførelsesform fjernes palmitin- (C16:0), stearin- (C18:0) og oljesyre (C18:l) alkylestere, og alkylestere av andre lett angripelige fettsyrer, i første trinn av den trinnvise enzymatiske alkoholysen. Alkylestere av mettede og monoumettede fettsyrer utgjør minst 50%, fortrinnsvis minst 70%, mest fortrinnsvis minst 90% i forhold til vekt av totale FAAE i produktfasen som separeres i første trinn av den enzymatiske alkoholysen. Andelen av DHA- og EPA-alkylestere i produktfasen i dette trinnet bør ikke være høyere enn 10%, fortrinnsvis ikke høyere enn 5%.

Hovedandelen av LC-PUFA alkylestere frigis i siste trinn av den trinnvise enzymatiske alkoholysen, enten ved fortsatt virkning av det første enzymet eller ved hjelp av et senere tilsatt enzym. I en foretrukken utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse utgjør langkjedede flerumettede fettsyrer minst 50%, fortrinnsvis minst 60%, fortrinnvis minst 80% i forhold til vekt av totale fettsyrealkylestere i produktfasen som separeres i siste trinn av den enzymatiske alkoholysen. Ved valg av et egnet enzym kan EPA separeres fra DHA i et mellomtrinn (H. Breivik et al., 1997, JAOCS, 74(11): 1425-1429).

Etter avslutning av prosessen ifølge oppfinnelsen kan løsningsmiddelet eller blandingen av løsningsmidler gjenvinnes. Gjenvinning av løsningsmidler utføres fortrinnsvis ved "organic solvent nanofiltration" (OSN) heller enn ved destillasjon i dette foreslåtte system. Imidlertid kan enhver egnet fremgangsmåte for løsningsmiddelgjenvinning benyttes. FAAE i produktgjenvhiningstank T oppkonsentreres, mens organisk løsningsmiddel gjenvinnes ved nanofiltrerhig.

Oppkonsentrerte FAAE i produktgjenvinningstanken T kan renses videre ved metoder kjent av fagpersoner, slik som molekylær destillasjon eller kromatografi, men spesielt ved høyytelse motstrøms kromatografi (HPCCC).

4. Figurer

Figur 1 viser en skjematisk presentasjon av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fettsyrealkyl-ester-rikfase (fødefase) sirkuleres fra en enzymreaktor R til kammer A av membrankontaktoren og tilbake til enzymreaktor R. Organisk løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding sirkuleres fra en produktgjenvinningstank T til kammer B av membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstank T. Fettsyrealkylestere transporteres over membran M ved diffusjon fra fødefase i kammer A til produktfase i kammer B hvor det ønskede produktet akkumulerer. Figur 2 viser sammensetningen av fødefasen og akkumulering av fettsyre etyllestere (FAEE) i produktfasen i eksperimentet beskrevet i Eksempel 1. FAEE ble framstilt ved kjemisk transesterifisering av torskelevertran med etanol. All FAEE til stede i fødefase hadde tilsvarende masseoverføringshastigheter over membran.

5. Eksempel

Følgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1: Kjemisk etanolyse fulgt av membran separering.

For å demonstrere at fettsyrealkylestere kan transporteres gjennom en hydrofob membran, ble følgende eksperiment utført: En løsning med høyt innhold av fettsyre etyllestere (FAEE) ble framstilt ved kjemisk transesterifisering av torskelevertran med etanol. 50 ml etanol (99.9 %) inneholdende 1.5% kaliumhydroksid ble tilsatt til 184 g torskelevertran (Møllers tran, Axellus AS, Norge) i en Erlenmeyer kolbe. Etter spyling med nitrogen og grundig forsegling ble flasken plassert i et vannbad på 55°C og blandingen ble rørt i 30 minutt ved 1000 rpm. Når den kjemiske etanolysen var fullført, ble røringen stoppet og blandingen fikk stå i 30 minutt. Fasene var da fullstendig separarert i en tung fase (glyserol) og en lett fase (etyllestere). 50 ml av den lette fasen, inneholdende fettsyre etyllestere, ble overført til en ren Erlenmeyer flaske og fortynnet fem ganger ved tilsats av 200 ml etanol (99.9 %). Denne løsningen ble deretter brukt som fødefase i membransepareringsforsøket.

In membrankontaktoren ble en asymmetrisk polyimidmembran benyttet. Matrimid 5218 ble valgt på grunn av de velkjente hydrofobe egenskaper for denne polymeren. Flate membraner ble framstilt ved faseinversjon; "dopeMøsning ble framstilt ved at nødvendig mengde polymer ble løst i dimetylformamid (DMF). Membranen hadde en molekylvektgrense på~35kDa og filtreringsareal i membrankontaktoren var 4lem .

FAEE-løsning i etanol (fødefase) og organisk løsningsmiddel (produktfase, i dette tilfelle også etanol), adskilt av den hydrofobe membranen, sirkulerte kontinuerlig (gear pumpe) på hver side av membranen. Shkuleringshastigheten var den samme på begge sider, for å unngå fase-gjennombrudd, siden samme løsningsmiddel ble brukt på begge sider.

Opprinnelige volumer av føde- og produktfaser var henholdsvis 250 og 200 ml. Eksperimentet ble utført i romtemperatur ved atmosfærisk trykk i 8 timer. Prøver (1 ml) ble tatt fra begge faser etter 1,2, 5 og 8 timer. Etter inndamping av etanol under nitrogen, ble FAEE oppløst i heksan inneholdende 0.02% metyl heneicosanoat (>99% renhet, intern standard) og 0.5% BHT. Prøvene ble videre analysert med GC for kvantifisering av FAEE.

Sanmiensetningen av fødefasen (hovedsakelig FAEE) og korresponderende akkumulering av FAEE i produktfasen i løpet av eksperimentet er vist i figur 2.14 % av total FAEE i initiell fødefase var transportert til produktfasen etter 8 timer. Alle FAEE i fødefasen hadde tilsvarende masseoverføringshastigheter over membranen.

Dette eksempelet demonstrerer at fettsyrealkylestere kan transporteres fra en fettsyrealkylester-rikfase igjennom en hydrofob membran til en produktfase i et membrankontaktorsystem.

Claims

1. Fremgangsmåte for fraksjonering av fettsyrealkylestere (FAAE) fra lipider i en membran kontaktor, omfattende følgende trinn: a) enzymatisk alkoholyse av lipider for å oppnå en sekvensiell frigivelse av FAAE b) føding av reaksjonsblandingen a) til fødekammer A i nevnte membrankontaktor; og c) separering av FAAE over en membran M til produktkammer B av nevnte membrankontaktor, inneholdende et organisk løsningsmiddel eller en blanding av løsningsmidler

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor a) den enzymatiske reaksjonen skjer i en enzymreaktor R inneholdende lipider, alkohol, enzym og om nødvendig andre løsningsmidler, b) reaksjonsblandingen, som inneholder frigitte FAAE, fødes til fødekammer A i membrankontaktor og tilbake til reaktor R, c) et organisk løsningsmiddel eller en blanding av løsningsmidler sirkuleres fra en produktgjenvinningstank T til produktkammer B av membrankontaktoren og tilbake til produktgjenvinningstank T, og d) FAAE passerer membran M ved diffusjon fra kammer A til produktkammer B, hvor FAAE akkumuleres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor oppsett er som vist i figur 1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor enzym er immobilisert på et bæremateriale som lett kan separeres fra reaksjonsblandingen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, hvor FAAE frigis sekvensielt, der mettede og monoumettede medium- til langkjedede fettsyrer hovedsakelig frigis i et første trinn og flerumettede fettsyrer hovedsakelig frigis i et siste trinn.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor alkylestere av mettede og monoumettede fettsyrer utgjør minst 50%, fortrinnvis minst 70%, mest fortrinnvis minst 90% i forhold til vekt av totale FAAE i produktfasen separert i første trinn.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor alkylestere av langkjedede fettsyrer utgjør minst 50%, fortrinnvis minst 60%, mest fortrinnvis minst 80% i forhold til vekt av totale FAAE i produktfasen separert i siste trinn.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor lipidene er valgt fra gruppen omfattende mono-, di- og triglyserider og fosfolipider av enhver opprinnelse.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor alkoholen fortrinnsvis er en lavere alkylalkohol (C1-C6).

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nevnte løsningsmiddel eller løsningsmiddelblanding er valgt fra gruppen omfattende lavere alkylalkoholer og/eller upolare løsningsmidler, fortrinnsvis heksan, cycloheksan, heptan, pentan, toluen, dikloretan, diklormetan, dietylleter, etyllacetat, aceton, og blandinger derav.