CN109943570A - 烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1及其应用，所述烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA，其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1是从烟粉虱唾液腺发现的新基因，通过RNAi技术获得BtFer1基因的dsRNA，并导入烟粉虱沉默BtFer1基因后，能够显著降低烟粉虱成虫在番茄植株上的存活率。

Description

烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1及其应用

技术领域

本发明涉及烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

烟粉虱属半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae害虫，其寄主范围十分广泛，主要危害十字花科类、茄果类、瓜类、豆类等作物，是棉花、番茄和烟草等多种经济作物的重要害虫。烟粉虱不仅通过刺吸植物汁液造成植株衰弱、生长发育受阻；还可传播多种植物病毒病，导致作物病毒病流行并暴发成灾。但是目前尚不清楚烟粉虱传播病毒的分子机制，对烟粉虱的功能基因研究也相对较少。

在植物与烟粉虱长期的协同进化过程中，植物建立起一套精密而又复杂的防御体系以应对烟粉虱取食为害。同时，烟粉虱也进化出了多种行为和生理机制以应对植物的防御，从而适应多种不同的寄主植物并顺利存活。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性的dsRNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶细胞表达沉默，产生的相应功能表型缺失的现象。RNAi技术在基因功能方面的研究是一项快速、高效、便于操作的可使靶基因失活的技术。近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，从而达到利用或防治其危害的目的。因此，深入研究影响烟粉虱存活的关键基因，以该基因作为防治烟粉虱的靶标基因是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1，通过RNAi技术获得BtFer1基因的dsRNA，并导入烟粉虱沉默BtFer1基因后，能够显著降低烟粉虱成虫在番茄植株上的存活率，因而可用于防治烟粉虱。

为实现上述目的，本发明是这样实现的：

在本发明的第一方面，提供了一种烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或者为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列经过添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了含有所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的重组载体、重组菌、细胞系。

在本发明的第三方面，提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1以及其重组载体、重组菌、细胞系在防治烟粉虱中的应用。

在本发明的第四方面，提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA，其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。还可根据烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1设计其他与该dsRNA核苷酸序列不一样的dsRNA，也在本发明的保护范围之内。

在本发明的第五方面，提供了烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA的制备方法，以烟粉虱cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO.6的上游引物、序列为SEQ ID NO.7的下游引物进行PCR扩增得到含有T7启动子的基因片段，即为dsRNA的模板；再将dsRNA的模板逆转录合成和纯化即得到烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA。

在本发明的第六方面，提供了所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA在抑制BtFer1基因的表达、防治烟粉虱中的应用。

在本发明的第七方面，提供了一种防治烟粉虱的方法，将所述的dsRNA导入烟粉虱。

本发明是以饲喂的方式将dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液，用所述混合液饲喂烟粉虱。需要说明的是，以其他方式将dsRNA导入烟粉虱，比如注射等，都在本发明的保护范围之内。

在本发明的第八方面，提供了一种防治烟粉虱的药物，其活性成分为以下至少一种：

所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1；

所述的重组载体；

所述的重组菌；

所述的dsRNA。

本发明具备的有益效果是：

本发明提供的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1是从烟粉虱唾液腺发现的新基因，通过RNAi技术获得BtFer1基因的dsRNA，并导入烟粉虱沉默BtFer1基因后，能够显著降低烟粉虱成虫在番茄植株上的存活率。本发明的试验结果明确了BtFer1基因在烟粉虱适应寄主植物过程中的重要作用，为进一步研究烟粉虱取食过程中的反防御机理和利用植物抗虫性控制烟粉虱的策略提供了理论依据。

附图说明

图1为BtFer1基因经dsRNA处理后对烟粉虱成虫存活率的影响；

图2为BtFer1基因经dsRNA处理后的干扰效率；所有数据均用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平P<0.05。

具体实施方式

实施例1烟粉虱唾液腺BtFer1基因全长cDNA克隆

1、烟粉虱唾液腺的解剖、唾液腺RNA提取及cDNA合成

解剖烟粉虱成虫的唾液腺，利用Absolutely RNANanoprep Kit(Agilent)试剂盒进行唾液腺总RNA提取，并在-80℃超低温冰箱保存以备用。采用Takara公司的反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit进行cDNA合成。

2、烟粉虱唾液BtFer1基因全长cDNA的PCR扩增

(1)根据烟粉虱唾液腺转录组和基因组中BtFer1基因的全长序列设计引物如表1所示：

表1

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(2)以cDNA为模板，利用上述引物，PCR扩增获得烟粉虱BtFer1基因cDNA全长序列的目的条带：

反应体系为20μL：10×PCR reactionbuffer 2.5μL、dNTP Mix(10mM)0.5μL、Taq聚合酶(2.5U)0.5μL、上游和下游引物(10μM)各0.5μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH₂O 14.5μL。

反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，40个循环；72℃10min。

(3)回收目的条带，并测序。

纯化：利用Transgen公司的EasyPure TM Quick Gel Extraction Kit试剂盒将PCR产物进行切胶纯化。

连接：在0.2mL的离心管中加入上述PCR纯化产物4μL，pMD18-T载体1μL，轻轻混合，室温反应20min，反应结束后置于冰上。

转化：将连接产物加到体积为50μL的Transl-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入500μL液体LB培养基，200rmp，37℃摇床孵育1h，取40μL X-gal(20mg/ml)和8μL的IPTG(500mM)，混匀后均匀涂抹在LB固体培养基上，37℃培养箱放置30min，取200μL菌液涂平板，37℃培养过夜。

鉴定：挑选白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中摇床培养10h，菌液进行菌落PCR。菌落PCR反应体系为10μL：2×EasyTaq SuperMix 5μL、M13上游和下游引物(10μM)各0.5μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH₂O 3μL。

菌落PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物大小，选出重组克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，得到BtFer1基因675bp序列，所得的基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA的获得

所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA的合成方法，是以烟粉虱cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO.6的上游引物、序列为SEQ ID NO.7的下游引物进行PCR扩增得到含有T7启动子的基因片段，即为dsRNA的模板；再将dsRNA的模板逆转录合成和纯化即得到烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA(其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。具体包括如下步骤：

1、dsRNA模板的制备

(1)烟粉虱总RNA提取及cDNA合成。

取烟粉虱成虫30头，放入无RNase的1.5mL离心管中，利用Trizol法提取总RNA，并在-80℃超低温冰箱保存以备用。采用PrimeScript RT Reagent Kit(Takara)反转录试剂盒进行cDNA的合成。

(2)利用Prime Primer 5.0软件设计引物，加上T7启动子(下划线所示序列)后的引物序列如表2所示，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表2

(3)T7引物PCR扩增：

反应体系为50μL：10×PCR reaction buffer 5.0μL、dNTPs 1.0μL、上游和下游引物(10μM)各2.0μL、cDNA模板1.0μL、TranStart Taq DNA聚合酶1.0μL、灭菌ddH2O 38.0μL。

反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

回收PCR产物并测序以确认所扩增的条带为目的条带。

(4)T7引物PCR产物的纯化：

使用Qiaquick PCR Purification Kit(Qiagen,Hilden,Germany)试剂盒纯化PCR产物，纯化所得的PCR产物即为合成dsRNA的模板。

2、dsRNA的合成与纯化

使用Promega公司的T7RiboMax Express RNAi Kit试剂盒合成和纯化dsRNA。

(1)dsRNA合成

使用干净的RNA专用PCR管，加入RiboMax Express T72X Buffer 10.0μL；linearDNAtemplate 1.0μg(依据DNA浓度换算需要加入的体积)；Enzyme Mix，T7Express 2.0μL；Nuclease-Free Water补充到20.0μL；37℃温育30分钟(温育时间可以延长2-6个小时，有利于增加产量)，70℃10分钟，然后室温放置20分钟，缓慢冷却形成dsRNA。

(2)DNA和单链RNA消除

加入1/200的RNase(用RNase Nuclease-Free Water稀释两百倍)和1.0μL RQ1RNase-Free DNase，37℃温育30分钟，以除去反应体系中的模板DNA和单链RNA。

(3)dsRNA纯化

每管加入0.1倍体积的3M Sodium Acetate(pH 5.2)和1倍体积的异丙醇，缓慢混匀后冰上放置5分钟，可以观察到管内出现絮状物沉淀，然后4℃15000rpm离心15分钟，然后加入0.5mL 70％的乙醇进行漂洗，8000rpm离心5分钟，然后室温晾干大约15分钟，加入适量的灭菌ddH₂O，存储在-80℃。

实施例3经dsRNA处理后对烟粉虱在番茄上存活率的影响

一、人工饲料和饲喂装置的准备：

取一小块封口膜，第一层尽量拉伸的很薄，覆盖在两端通透的玻璃管一端，然后加入200μL含有dsRNA的30％蔗糖溶液，再取一小块封口膜适量拉伸后覆盖在液滴上，尽量排除气泡，制作一个双层封口膜形成的含有营养液和dsRNA的小袋，以供烟粉虱取食。玻璃管下端覆以纱布以保持通气，玻璃管周围和下端用遮光布包裹，有利于烟粉虱向顶端封口膜聚集，从而更好的取食dsRNA溶液。

二、dsRNA在降低烟粉虱存活率中的作用：

取初羽化的烟粉虱成虫约200头放入饲喂装置中，将处理好的玻璃管放置在培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源，培养条件为温度为26±1℃，光暗比为14:10，相对湿度为70-80％。饲喂含有BtFer1基因的蔗糖液(浓度为500ng/μL)的dsRNA48h后，将烟粉虱放置在棉花上恢复12h，之后转移至番茄上进行生测。

将夹叶笼夹在番茄叶片背面，每个夹叶笼放10头饲喂过dsRNA的烟粉虱(5雌5雄)，每个夹叶笼作为一个重复，每组20个重复。以饲喂含有GFP dsRNA且灭菌处理过的30％蔗糖溶液的烟粉虱作为对照。利用SPSS 17.0统计软件分析饲喂不同溶液后烟粉虱的死亡率。

结果如图1所示，饲喂BtFer1基因dsRNA的烟粉虱存活率显著低于对照组(P<0.001)。

三、dsRNA抑制BtFer1基因的表达：

饲喂48h后，将烟粉虱置于棉花上，随后在第1、3、5、7天收集烟粉虱定量测定干扰效果。

利用Prime Primer 5.0软件设计引物，如表3所示，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表3

烟粉虱唾液腺总RNA提取及cDNA合成：同实施例1。以烟粉虱唾液腺cDNA为模板，使用SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)荧光定量PCR检测BtFer1基因的表达量。反应体系为25μL：2×SuperReal PreMix Plus 12.5μL、50×ROX Reference Dye 0.2μL、上游和下游引物(10μM)各0.75μL、cDNA模板1.0μL、灭菌ddH₂O 9.8μL。反应条件为：94℃15min；94℃10s，60℃20s，72℃32s，40个循环。

利用2^-ΔCt方法计算基因的相对表达量。采用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，表达量数据采用平均数±标准误来表示，表达量的比较采用Tukey’s honestlysignificant difference(HSD)，显著性检验水平P<0.05。

干扰结果如图2所示，由此确保了干扰效果为烟粉虱唾液BtFer1基因所产生。因此，本发明的试验结果说明BtFer1基因在烟粉虱适应寄主植物过程中起着重要的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)

<400> 1

atggatgcaa aactgagcct tcttctcttg ctgggtgctg tcgctgcggc tagcgctgaa 60

ttttgctaca gcgatgtcgt cggagcttgc agtcccacag gctcagaatt ggccaactgt 120

aatgccaagt atggagctgc ccacgaagta atgaaagatt tacagagcta tgtcaataca 180

cacataaccc gcaactggca atatctttta atgtcaactt acttcaacaa ctacgagaaa 240

aaccgtgctg gtttctccaa actttacaag aaactgtccg acaccgcatg ggaggacgcc 300

attgacctca tcaaatacat tggcaaacgt ggaggtaaaa tggacttcgg tttcaggaag 360

gaagacactt accgcgctaa tgttgatact tatgaaatgc atgaactggg aagtcttgca 420

aaggctttgg acatccaaaa gtctctagct gaagaatcac accacattca cggagaagcc 480

atgcgcagga agcaagactt ccacgaccca gaggttggtt ctttcatcga gaacaaattc 540

gttcaccaac atgctgatgc cgtacgtgaa ttggccggac actcaagcga cttgaagaaa 600

ttgatgagca acacagccga tcagagcctt gcactgtaca tctttgacca gcatcttcag 660

aagtcacttg gttaa 675

<210> 2

<211> 395

<212> DNA

<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)

<400> 2

ccttcttctc ttgctgggtg ctgtcgctgc ggctagcgct gaattttgct acagcgatgt 60

cgtcggagct tgcagtccca caggctcaga attggccaac tgtaatgcca agtatggagc 120

tgcccacgaa gtaatgaaag atttacagag ctatgtcaat acacacataa cccgcaactg 180

gcaatatctt ttaatgtcaa cttacttcaa caactacgag aaaaaccgtg ctggtttctc 240

caaactttac aagaaactgt ccgacaccgc atgggaggac gccattgacc tcatcaaata 300

cattggcaaa cgtggaggta aaatggactt cggtttcagg aaggaagaca cttaccgcgc 360

taatgttgat acttatgaaa tgcatgaact gggaa 395

<210> 3

<211> 395

<212> DNA

<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)

<400> 3

ttcccagttc atgcatttca taagtatcaa cattagcgcg gtaagtgtct tccttcctga 60

aaccgaagtc cattttacct ccacgtttgc caatgtattt gatgaggtca atggcgtcct 120

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agttgttgaa gtaagttgac attaaaagat attgccagtt gcgggttatg tgtgtattga 240

catagctctg taaatctttc attacttcgt gggcagctcc atacttggca ttacagttgg 300

ccaattctga gcctgtggga ctgcaagctc cgacgacatc gctgtagcaa aattcagcgc 360

tagccgcagc gacagcaccc agcaagagaa gaagg 395

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaatcttc ctccctcg 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctctgatc ggctgtg 17

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg agaccttctt ctcttgctgg gtg 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggg agattcccag ttcatgcatt tca 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attgatgagc aacacagccg 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaccaagtga cttctgaaga tgct 24

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcggaaaatt accgtgag 18

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaacttgtga tctactcctc tcgtg 25

Claims (9)

1.一种烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1，其特征在于，所述烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1在防治烟粉虱中的应用。

3.一种重组载体，其特征在于，包含有权利要求1所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组载体。

5.烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA，其特征在于，其正义链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA的制备方法，其特征在于，以烟粉虱cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO.6的上游引物、序列为SEQ ID NO.7的下游引物进行PCR扩增得到含有T7启动子的基因片段，即为dsRNA的模板；再将dsRNA的模板逆转录合成和纯化即得到烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1的dsRNA。

7.权利要求5所述的dsRNA在抑制BtFer1基因的表达、防治烟粉虱中的应用。

8.一种防治烟粉虱的方法，其特征在于，将权利要求5所述的dsRNA导入烟粉虱。

9.一种防治烟粉虱的药物，其特征在于，其活性成分为以下至少一种：

权利要求1所述的烟粉虱唾液铁蛋白基因BtFer1；

权利要求3所述的重组载体；

权利要求4所述的重组菌；

权利要求5所述的dsRNA。