CN117821453A - 用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，通过饲喂法将dsRNA传递到烟粉虱体内，收集干扰后的烟粉虱雌成虫进行繁殖力的检测。结果显示，干扰后，雌性烟粉虱卵巢内的成熟卵子数减少，产卵量显著下降，后代孵化率及体长显著降低。说明干扰ovo基因，雌性烟粉虱的繁殖力锐减。本发明为将来烟粉虱RNAi介导的害虫防治策略提供了较好的候选基因，同时也为将来的田间应用试验提供了理论依据。

Description

用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因及其应用。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci，属半翅目Hemiptera，粉虱科Aleyrodidae，是一种广泛分布于中国、美国、印度、马来西亚、日本等国的世界性农业害虫。作为多食性害虫，烟粉虱的寄主范围十分广泛，寄主植物多达420余种，包括葫芦科、十字花科、豆科、茄科等。烟粉虱可直接刺吸寄主植物的汁液，导致植物果实发育不均匀，叶片焦黄、萎蔫和植株矮小。其次，烟粉虱会分泌蜜露，对叶片和果实进行侵害，导致煤污病。更重要的是，烟粉虱能作为载体传播超过200种植物病毒，对植物造成严重危害。据相关数据统计，烟粉虱每年造成的经济损失达数十亿美元。如果不加以控制，其后果将愈发严重。目前，烟粉虱的防治多采用化学药剂，但常年用药，导致烟粉虱抗药性的产生。且化学防治带来的农药残留问题、食品安全问题及环境污染问题也日益严重。因此，亟需开发一种绿色有效且环境安全的防治方法。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种广泛存在于真核生物的转录后基因沉默现象，其原理是dsRNA(double-stranded RNA)可引起生物体内同源序列mRNA的特异性降解。RNAi现象最早是在研究秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans反义RNA(antisenseRNA)的过程中被发现，其后陆续在真菌、果蝇、拟南芥、昆虫、小鼠等多种真核生物中发现。它在真核生物中参与抵御病毒感染、抑制转座子活性、调控基因的表达，且在机体的发育调控及生理代谢方面具有重要的生物学意义。RNAi的快速发展，为深入了解生物的基因功能提供了可行且便利的技术手段，且为开发对环境友好的害虫治理方法奠定了基础。由于RNAi技术可以靶向干扰害虫基因，对非靶标昆虫影响小，在害虫绿色防治中具有广阔的应用前景。

昆虫生殖细胞的分化受snf、ovo、otu等性别决定基因的调控。ovo基因最早在果蝇中被发现，它能调控果蝇生殖细胞的形成和发育。在雌性果蝇中，ovo的强突变会导致雌性卵巢无法正常形成生殖细胞，而弱突变则导致卵巢畸形，产生肿瘤。目前，ovo的同源基因在人、小鼠、涡虫、线虫、斑马鱼、家蚕等生物中被鉴定出来，且它们在控制生殖细胞发育方面表现出极强的功能保守性。因此，ovo具有成为害虫防治靶标基因的潜力。然则，国内外尚没有关于烟粉虱ovo基因的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，其可有效抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种生物制剂，其可有效抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

本发明还要解决的技术问题在于，提供上述的RNAi靶标基因在防治烟粉虱中的应用。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种烟粉虱的防治方法，其易于操作，效果良好。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因的制备方法。

本发明还要解决的技术问题在于，提供一种引物对。

为了解决上述问题，本发明公开了一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，其正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。该RNAi靶标基因在烟粉虱生殖发育过程中起着非常重要的作用，沉默该基因，对烟粉虱个体的生殖发育造成严重的影响。

需要说明的是，本发明中RNAi靶标基因并不限于SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的序列，其还可以是在SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列上经过一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除得到的，具有与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示序列相同生物活性的衍生序列。

相应的，本发明还公开了一种用于防治烟粉虱的生物制剂，其包括上述的RNAi靶标基因，该生物制剂可通过注射、饲喂或体壁渗透进入烟粉虱体内。

作为上述技术方案的改进，所述生物制剂为饲喂式制剂、注射剂或喷施性RNA农药。

相应的，本发明还公开了上述的RNAi靶标基因在防治烟粉虱中的应用，所述RNAi靶标基因用于抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

相应的，本发明还公开了一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因的制备方法，其包括：

(1)以烟粉虱cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物，序列如SEQ IDNO.8所示的下游引物进行扩增，得到用于合成dsRNA的模板；

(2)以所述模板合成dsRNA，消除DNA和单链RNA后纯化，即得到用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因。

作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，扩增反应的反应体系包括：Es taq mix12.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物0.5μL，浓度为10μmol/L的下游引物0.5μL，烟粉虱cDNA1μL，无菌蒸馏水10.5μL；

反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。

作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，合成dsRNA的反应体系包括：Express T7 2×Buffer 10μL，用于合成dsRNA的模板1μg，Enzyme Mix,T7 express 2μL，Nuclease-FreeWater补齐至20μL；

合成dsRNA的条件为：37℃温育0.5～6h，70℃反应10min，在20～30℃放置20min。

相应的，本发明还公开了一种引物对，其包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物。

本发明利用生物信息学技术，分析了烟粉虱基因组，注释并克隆了烟粉虱ovo基因，获得了ovo基因的全长序列，然后按下面步骤进行实验：1)提取烟粉虱总RNA，反转录得到cDNA；2)设计带有T7序列的特异性引物；3)通过PCR技术扩增目的基因干扰片段，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；4)回收干扰片段，并进行测序验证；5)利用dsRNA合成试剂盒合成目的基因片段dsRNA；6)进行RNAi实验，把靶标基因dsRNA传递到烟粉虱体内；7)统计死亡率，计算干扰效率，观察表型。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明提供了一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，通过饲喂法将dsRNA传递到烟粉虱体内，收集干扰后的烟粉虱雌成虫进行繁殖力的检测。结果显示，干扰后，雌性烟粉虱卵巢内的成熟卵子数减少，产卵量显著下降，后代孵化率及体长显著降低。说明干扰ovo基因，雌性烟粉虱的繁殖力锐减。本发明为将来烟粉虱RNAi介导的害虫防治策略提供了较好的候选基因，同时也为将来的田间应用试验提供了理论依据。

附图说明

图1为实施例2中ovo基因的干扰效率图；

图2是实施例2中饲喂dsEGFP和dsOVO后烟粉虱的存活率图；

图3是实施例2中饲喂dsEGFP和dsOVO对烟粉虱的影响，包括雌虫卵巢内的成熟卵子数(A)、雌虫的产卵量(B)、卵的孵化率(C)及后代体长(D)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1 dsRNA的合成

1、供试昆虫

烟粉虱最早于2009年6月采自北京中蔬大森林花卉市场所售一品红(Euphorbiapulcherrima Willd.)上，而后在玻璃温室中于棉花(Gossypium herbaceumL.cv.Zhongmian 49)上继代饲养。为了保持种群的纯度，每隔2-3代用线粒体细胞色素氧化酶Ι(mtCOI)进行监测。

2、供试试剂

RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，cDNA反转录试剂盒RT reagent Kit(Takara Biotech)，dsRNA合成试剂盒T7 RiboMAX^TMExpress RNAi System，荧光定量试剂盒SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN，Beijing，China)和胶回收试剂盒(Promega)，DNA分子量标准、X-Gal和IPTG(TIANGEN，Beijing，China)，氨苄青霉素钠盐(Amresco)，琼脂糖(北京擎科)，pEASY-T1 vector(北京全式金)，ES-Taq Mix DNA聚合酶。其它实验室常用化学试剂(分析纯)均为市售。

3、主要仪器

荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 3)，PCR仪(Bio-Rad S1000)，Nanodrop(ThermoScientific Nanodrop 2000)，离心机(Eppendorf 5417R)，水浴锅(北京六一制造厂)，电泳仪和凝胶成像系统(Bio-Rad)，恒温箱和高压灭菌锅(SanYo)，组织研磨仪(上海净信科技)，移液器(Eppendorf)，超纯水仪(ZMQ55VOTI Mini Q)，超净工作台(苏州净化科技有限公司)。

4、RNA提取及cDNA合成

利用Trizol试剂提取烟粉虱总RNA，具体步骤如下：

1)取烟粉虱40头，立即放入液氮中冷冻，防止RNA降解。

2)向烟粉虱样品中加入1ml Trizol和1粒研磨珠，于预冷的组织研磨仪中研磨2-3min，使其充分匀浆，冰上静置5min。

3)加入300μl氯仿，漩涡振荡器剧烈振荡30s，使其充分混匀，冰上静置5min，4℃12000rpm离心15min。

4)轻轻吸取400μl的上清液于干净的离心管中。

5)加入等体积预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，冰上放置10min以沉淀RNA，4℃12000rpm离心10min。

6)倒去上清液，加入1ml提前配置的预冷75％无水乙醇进行漂洗，4℃8000rpm离心5min。

7)倒去乙醇，并小心吸去遗留的液体，室温晾干，加入10μl预冷的DEPC水溶解，用Nanodrop测定RNA的浓度及OD260/OD280的比值，并且用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

根据说明书的指示用TaKaRa公司的反转录试剂盒RT reagent Kit进行cDNA合成，步骤如下：

1)去除基因组DNA：

按如下表1的用量将试剂盒中的各组分加入到干静的离心管中，适度混匀后分装。置于PCR仪中42℃反应2min。

表1

2)合成cDNA

按如下表2将试剂盒中其它组分轻柔混匀，离心后放入PCR仪中37℃反应15min，85℃反应5s，产物保存于-20℃备用。

表2

5、ovo基因的全长克隆

根据已鉴定的烟粉虱ovo基因序列，设计全长引物，引物序列见表3。以烟粉虱成虫cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系：Es taq mix 12.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物(Full-F)0.5μL，浓度为10μmol/L的下游引物(Full-R)0.5μL，模板1μL，无菌蒸馏水10.5μL。反应程序：95℃6min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环后72℃10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测后，通过回收、连接转化，挑取阳性克隆单菌落放大培养，送公司测序，最后得到烟粉虱ovo基因的全长序列(SEQ ID NO.1)。

表3用于ovo基因全长克隆的引物

6、ovo基因dsRNA的制备

所述的烟粉虱ovo基因dsRNA的制备方法，是以烟粉虱cDNA为模板，以序列为SEQID NO.6的上游引物、序列为SEQ ID NO.8的下游引物进行PCR扩增得到含有T7启动子的基因片段，即为dsRNA的模板；再将dsRNA的模板纯化后合成得到烟粉虱ovo基因的dsRNA(其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。具体包括如下步骤：

1)dsRNA模板的制备

将克隆得到的烟粉虱ovo基因全长序列输入果蝇基因中的siRNA结合位点网站http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl设计相应的dsRNA引物，引物序列见表4。利用dsRNA引物，以烟粉虱成虫的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系：Es taq mix12.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物0.5μL，浓度为10μmol/L的下游引物0.5μL，模板1μL，无菌蒸馏水10.5μL；反应程序：95℃10min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环后72℃10min。回收PCR产物并测序以确认所扩增的条带为目的条带。使用胶回收试剂盒(Promega)纯化PCR产物，纯化所得的产物即为合成dsRNA的模板。

表4用于合成dsRNA的引物

2)dsRNA的合成

用dsRNA合成试剂盒T7 RiboMAX^TM Express RNAi System合成dsRNA。使用干净的RNA专用1.5ml离心管，依次加入的试剂见表5

表5

37℃温育30min(温育时间可延长至2-6h，以增加产量)，70℃10min，然后室温放置20min，缓慢冷却形成dsRNA。

3)DNA和单链RNA消除

每20μl体系中加入新稀释的1/200的RNase和RQ1 RNase-Free DNase各1.0μL，37℃温育30min，以除去反应体系中的DNA和单链RNA。

4)dsRNA纯化

每管加入0.1倍体积的3M Sodium Acetate(pH 5.2)和1倍体积的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀后冰上放置5min，然后4℃15000rpm离心15min。加入预先配好的预冷70％乙醇0.5ml进行漂洗，8000rpm离心5min，然后室温晾干约15min，加入1-2倍体积的Nuclease-Free Water，存储在-20℃(-80℃长期保存)。

实施例2饲喂法RNAi实验

1)饲喂液的准备

首先用ddH₂O配制30％的蔗糖溶液和5％的酵母浸出物，充分溶解后，用0.22μm的细菌滤器进行过滤，防止实验过程中的细菌感染。饲喂液用RNA-free的离心管分装，于-20℃保存。

2)烟粉虱饲喂

利用50×20mm的玻璃装置对烟粉虱进行体外的干扰试验：首先准备好dsRNA，以外源基因EGFP为对照，用上述饲喂液配制成合适的实验浓度；取封口膜覆盖在玻璃管内一端，加入200μL配置好的饲喂液，再另附一层封口膜，制作一个含有营养液及dsRNA的饲喂小袋，供烟粉虱取食；将烟粉虱置于玻璃管内，准备黑色棉塞和管套，人工创造一个黑暗的环境，将玻璃管置于光照培养箱中，把有饲喂小袋的一端向着光源，保持培养箱的光照为14：10，湿度为70％。

3)RNA干扰

首先通过合成目的基因及外源基因EGFP的dsRNA(试验组记为dsOVO，对照组记为dsEGFP)，EGFP的dsRNA引物序列是SEQ ID NO.11的上游引物、序列为SEQ ID NO.12的下游引物。对ovo基因进行RNA干扰实验，每个实验设置3-4个生物学重复。干扰2天后，统计烟粉虱的死亡率，并用实时荧光定量PCR检测ovo基因的干扰效率，再收集干扰后的烟粉虱雌成虫进行繁殖力的检测。具体步骤如下：

一、烟粉虱存活率的检测

取初羽化的烟粉虱成虫约50头放入饲喂装置中，将装置置于光照培养箱中，饲喂小袋的方向朝向光源，培养条件的温度为25±1℃，光暗比为14:10，相对湿度为70％。饲喂含有ovo基因的dsRNA(浓度为500ng/μL)48h后，统计烟粉虱的存活率。每组设置3-4个生物学重复。利用SPSS19.0软件分析饲喂dsRNA溶液后烟粉虱的存活率。结果如图2所示，饲喂ovo基因dsRNA的烟粉虱存活率与对照组无显著差异，且均在90％以上，说明该dsRNA溶液对烟粉虱无毒害作用。

二、干扰效率的检测

1.荧光定量引物的筛选：根据克隆得到的烟粉虱ovo基因全长序列，利用PrimerPremier 5.0软件设计符合荧光定量试验要求的特异性引物，然后以烟粉虱成虫cDNA为模板，利用所设计的引物，首先进行普通PCR，电泳检测PCR产物，确定产物大小正确且为单一明亮条带，并送公司测序以检验引物的特异性。接着，利用ABIQuantStudio 3实时荧光定量仪进行RT-qPCR，将模板浓度梯度稀释，按照荧光定量试剂盒推荐的体系和程序进行操作，对引物的扩增效率进行检测。反应程序：95℃15min；95℃10s，60℃30s，72℃30s，循环40次，在72℃延伸的时候获得熔解曲线。最后筛选出合适的荧光定量引物，引物序列见表6。

2.内参基因的选择根据前人的研究报道，选择了SDHA作为本实验的内参基因。

表6用于荧光定量试验的引物

3.数据分析：利用ABI处理RT-qPCR数据，根据2^-ΔΔCt计算得到基因的相对表达量，其中，引物的扩增效率(E)的计算公式为E＝[10(-1/斜率)-1]×100％。采用SPSS19.0软件进行数据的统计分析，表达量数据采用平均数±标准误来表示，表达量的比较采用Tukey，显著性检验水平P<0.05。

4.利用果蝇基因中的siRNA结合位点网站设计了5对烟粉虱ovo基因的干扰引物，分别为dsOVO-F1/R1、dsOVO-F2/R1、dsOVO-F3/R1、dsOVO-F1/R2、dsOVO-F2/R2，引物序列见表4。为了筛选出干扰效率最高的dsRNA引物，我们以烟粉虱成虫的cDNA为模板，利用这5对引物合成相应的dsRNA(dsOVO-F1/R1、dsOVO-F2/R1、dsOVO-F3/R1、dsOVO-F1/R2、dsOVO-F2/R2分别对应dsOVO1、dsOVO2、dsOVO3、dsOVO4和dsOVO5)，dsRNA的合成方法同实施例1。将这几组dsRNA分别饲喂烟粉虱成虫48h后，检测ovo基因的表达量变化，以此计算ovo基因的干扰效率。结果如图1所示，除dsOVO-F1/R2这一对干扰引物外，其余干扰引物均能降低ovo基因的表达量。且相比之下，dsOVO-F1/R1引物对的干扰效率最好，因此我们选择dsOVO-F1/R1作为干扰引物进行后续的试验。

三、干扰后烟粉虱雌成虫的繁殖力检测

利用筛选出的合适dsRNA引物，合成dsRNA，并用饲喂法对初羽化的雌性烟粉虱进行RNA干扰试验。饲喂2天后，收集雌成虫。一部分雌虫直接解剖，观察其卵巢发育，另一部分成虫转移置含有棉花苗的塑料瓶中产卵。每5头为一组，共设置20个重复，外源基因EGFP为对照。待成虫产卵7天后，将棉花叶片置于显微镜下统计卵的个数。结果如图3(AB)所示，ovo干扰组的烟粉虱雌虫卵巢内的成熟卵子数减少，产卵量显著下降。将带卵的棉花苗放回干净无虫的塑料瓶中继续饲养，10天后将棉花苗取出，在显微镜下记录孵化的若虫数量，计算卵的孵化率。结果如图3C所示，ovo干扰组的烟粉虱雌虫所产的卵孵化率显著低于对照组。待孵化的若虫全部羽化，收集羽化的成虫，在显微镜下测量其体长变化。结果如图3D所示，ovo干扰组的烟粉虱后代体长显著降低。因此，我们认为，ovo基因影响烟粉虱雌虫的繁殖力，是烟粉虱在RNAi介导的害虫防治策略中较为理想的靶标基因。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因，其特征在于，其正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种用于防治烟粉虱的生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的RNAi靶标基因。

3.如权利要求1所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂通过注射、饲喂或体壁渗透进入烟粉虱体内。

4.如权利要求2或3所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为饲喂抑制剂、注射剂或喷施性RNA农药。

5.如权利要求1所述的RNAi靶标基因在防治烟粉虱中的应用，其特征在于，所述RNAi靶标基因用于抑制雌性烟粉虱的繁殖力。

6.一种防治烟粉虱的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的RNAi靶标基因导入烟粉虱。

7.一种用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因的制备方法，其特征在于，包括：

(1)以烟粉虱cDNA为模板，以序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物，序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物进行扩增，得到用于合成dsRNA的模板；

(2)以所述模板合成dsRNA，消除DNA和单链RNA后纯化，即得到用于烟粉虱防治的RNAi靶标基因。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增反应的反应体系包括：Es taq mix 12.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物0.5μL，浓度为10μmol/L的下游引物0.5μL，烟粉虱cDNA 1μL，无菌蒸馏水10.5μL；

反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后在72℃延伸10min。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，合成dsRNA的反应体系包括：Express T7 2×Buffer 10μL，用于合成dsRNA的模板1μg，Enzyme Mix,T7 express 2μL，Nuclease-Free Water补齐至20μL；

合成dsRNA的条件为：37℃温育0.5～6h，70℃反应10min，在20～30℃放置20min。

10.引物对，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物和序列如SEQ IDNO.8所示的下游引物。