CN109897873A - 一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法 - Google Patents
一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于兼养雨生红球藻γ‑氨基丁酸的富集方法，主要包括：首先利用乙酸钠作为有机碳源培养雨生红球藻至对数培养期后期，经新鲜BBM培养基稀释重悬浮后作为诱导培养液。用纯水配制1g/L NaCl母液，将NaCl母液添加到已经稀释好的诱导藻液中稀释NaCl母液，并将藻液置于高光照下培养；隔天收集藻液，并利用有机溶剂浸提藻细胞内γ‑氨基丁酸(γ‑GABA)，检测γ‑GABA含量。本发明操作简单易行，能够缩短藻细胞生长周期，提高雨生红球藻生物量并大幅提高雨生红球藻中γ‑GABA的含量。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体地说，涉及一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法。
背景技术
微藻因其生长速率快且生命力旺盛被广泛关注，微藻可用来生产多种副产物，主要包括油脂、蛋白质、碳水化合物、天然色素、抗氧化剂、氨基酸等。γ-GABA因其具有抗焦虑、抗氧化和生殖生理功能，从而成为学者广泛关注的焦点，但目前天然γ-GABA基本从植物中提取，微藻与植物相比有生长周期短的优势，我们通过检测发现雨生红球藻中也含有γ-GABA，但含量不高，如何提高雨生红球藻的γ-GABA含量和γ-GABA产率是亟待解决的问题。
雨生红球藻属于一种单细胞绿藻，它具有特殊的生物学性质，其生长周期分为快速生长繁殖的游动细胞阶段和积累次级产物的不动细胞(孢子)阶段，这两个阶段所需的适宜培养条件差别较大。在游动细胞阶段，藻体生长繁殖快，需要充足的营养、弱光和适宜的温度，此外，研究表明植物在冷害、热激、盐、机械刺激和低氧等胁迫条件下能够增强谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase,GAD)的活性，从而富集γ-GABA；其中盐胁迫方法简单易行、安全环保。陈春旭等在NaCl浓度为133.5mM、培养温度为33℃胁迫条件下诱导糙米发芽，发现外源NaCl处理能刺激GAD活性，提高γ-GABA含量(陈春旭,王利勤,郭元新,等.盐胁迫对发芽糙米富集γ-氨基丁酸及蛋白组分变化的影响[J].食品科学,2018,39(5):87-92.)。雨生红球藻同植物一样可进行光合作用，推测盐胁迫同样可以提高雨生红球藻中γ-GABA含量。Malcolm R.Brown发现很多海藻细胞中也含有γ-GABA(Brown M R.The amino-acidand sugar composition of 16 species of microalgae used in mariculture[J].Journal of Experimental Marine Biology&Ecology,1991,145(1):79-99.)。雨生红球藻是淡水藻，相较于海藻来说，生存环境最大的差异在于盐浓度的不同，推测盐浓度的提高有利于雨生红球藻中γ-GABA的富集。
现有生物技术中的天然γ-GABA的富集主要采用基因工程改造技术，通过发酵改造过的工程菌株提高γ-GABA的产量。此方法成本较高，且存在一定的食品安全性问题。而植物中γ-GABA的富集一般采用化学诱导剂诱导植物积累γ-GABA，但其含量和产率仍较低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法，结合兼养-光诱导两步法培养策略，采用可兼养的雨生红球藻，进行藻种兼养的培养使藻细胞在短时间内快速生长，随后稀释至适当的浓度进行光诱导培养，同时结合NaCl诱导藻细胞大量积累γ-GABA，然后利用有机溶剂提取藻细胞内γ-GABA。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在光照条件下，以醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液；
步骤2、诱导藻细胞积累γ-GABA：用纯水配制1g/L的NaCl母液，将NaCl母液添加到诱导藻液中调节NaCl浓度，并置于高光照条件下诱导培养；
步骤3、隔天收集藻细胞，检测γ-GABA含量。
可选地，所述步骤1中的光照培养温度为24-26℃，光照培养强度为2800-3500lx。
可选地，所述步骤1中的醋酸钠的加入量为1.5-2.5g/L。
可选地，所述步骤1中的诱导藻液浓度为0.1-0.5g/L。
可选地，所述步骤2中的诱导藻液中的NaCl浓度为0.2-0.6g/L。
可选地，所述步骤2中的诱导条件为：温度26-28℃，光强12000-14000lx。
可选地，所述步骤3中的收藻及γ-GABA含量检测具体方法为：隔天收集藻液，先将藻液经3500r/min离心富集10min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉；其次称取0.1g干燥粉，将样品置于烘干过的研钵中，加入6ml乙酸进行研磨提取1h，每20min振荡一次，6037×g离心15min，收集上清；然后在振荡条件下加入4ml乙醇去除大分子聚合物，16770×g离心20min；收集上清并真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物用0.5ml蒸馏水溶解，2683×g离心10min；取300μL样品或γ-GABA标准品上清液真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物溶解于60μL体积比为2:2:1的乙醇-水-三乙胺中，真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物溶解于90μL体积比为7:1:1:1的乙醇-水-三乙胺-异硫腈酸苯酯中，室温反应20min形成PTC-GABA，真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃；残余物溶解于300μL含80％流动相A和20％流动相B，PH＝5.8的溶液中，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测；准确称取0.1gγ-GABA标准品，用超纯水配制成1mg/ml的储备液，存放于试剂瓶中，保存在4℃冰箱，使用前配制成适宜浓度的工作液用于液相色谱标准曲线制作；通过标准曲线得到γ-GABA浓度c(mg/L)，最终得到γ-GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。
可选地，色谱柱为C18柱，waters,25cm×4.6mmol/L，5μmol/L；流动相A为混合溶液，流动相B为体积比为60：40的乙腈和水，洗脱梯度为0.6mL/min等梯度洗脱，检测器为waters 996光电二极管阵列检测器，进样量20μL，检测波长为254nm。
可选地，混合溶液的配比为：8.205g乙酸钠，0.5ml三乙胺，0.7ml乙酸，5ml乙腈定容至1L。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明采用两阶段培养的方法；采用兼养促进雨生红球藻生物量的提高再结合诱导的策略来提高γ-GABA含量；乙酸钠作为雨生红球藻在生长繁殖阶段可利用的碳源，为藻体的生长提供了充足的营养。因此在基础培养基中添加乙酸钠来提高雨生红球藻的生物量。
2)本发明操作简单，能够缩短藻细胞的生长周期，提高雨生红球藻的生物量和γ-GABA的产率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明不同浓度NaCl对雨生红球藻生物量的影响；
图2是本发明不同浓度NaCl对γ-GABA含量的影响。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种基于兼养雨生红球藻产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在温度24-26℃、光照2800-3500lx时，以1.5-2.5g/L醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液，藻液浓度为0.1-0.5g/L；
步骤2、诱导藻细胞积累γ-GABA：用纯水配制1g/L的NaCl母液，将适量NaCl母液添加到诱导藻液中使NaCl浓度为0.2-0.6g/L，并置于26℃-28℃、光强12000-14000lx、冷光灯持续光照诱导；
步骤3、隔天收集藻细胞，检测γ-GABA含量：隔天收集藻液，先将藻液经3500r/min离心富集10min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉；其次称取0.1g干燥粉，将样品置于烘干过的研钵中，加入6ml乙酸进行研磨提取1h，每20min振荡一次，6037×g离心15min，收集上清；然后加入4ml乙醇去除大分子聚合物(振荡)，16770×g离心20min；收集上清并真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物用0.5ml蒸馏水溶解，2683×g离心10min；取300μL样品(或γ-GABA标准品)上清液真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(2:2:1)中，真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(异硫腈酸苯酯)(7:1:1:1)中，室温反应20min形成PTC-GABA，真空干燥(0.1Mpa，45℃)；残余物溶解于300μL含80％流动相A和20％流动相B，PH＝5.8的溶液中，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测。准确称取0.1gγ-GABA标准品(sigma)，用超纯水配制成1mg/ml的储备液，存放于试剂瓶中，保存在4℃冰箱，使用前配制成适宜浓度的工作液用于液相色谱标准曲线制作。色谱柱为C18柱(waters,25cm×4.6mmol/L，5μmol/L)；流动相A为混合溶液(8.205g乙酸钠，0.5ml三乙胺，0.7ml乙酸，5ml乙腈定容至1L)，流动相B为乙腈-水(60：40)，洗脱梯度为0.6mL/min等梯度洗脱，检测器为waters 996光电二极管阵列检测器，进样量20μL，检测波长为254nm；通过标准曲线得到γ-GABA浓度c(mg/L)，最终得到γ-GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。
实施例1
本实施例为基于兼养雨生红球藻产γ-氨基丁酸的方法，其主要步骤为：
(1)在温度24℃、光照2800lx时，以1.5g/L醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液，藻液浓度为0.1g/L。
(2)用纯水配制1g/L的NaCl母液，将适量NaCl母液添加到诱导藻液中使NaCl浓度为0.2g/L，并置于26℃、光强12000lx下诱导培养；
(3)隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂提取藻细胞内γ-GABA，并利用液相色谱检测，检测方法如下：隔天收集藻液，先将藻液经3500r/min离心富集10min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉；其次称取0.1g干燥粉，将样品置于烘干过的研钵中，加入6ml乙酸进行研磨提取1h，每20min振荡一次，6037×g离心15min，收集上清；然后加入4ml乙醇去除大分子聚合物(振荡)，16770×g离心20min；收集上清并真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物用0.5ml蒸馏水溶解，2683×g离心10min；取300μL样品(或γ-GABA标准品)上清液真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺(2:2:1)中，真空干燥(0.1Mpa，45℃)，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC(异硫腈酸苯酯)(7:1:1:1)中，室温反应20min形成PTC-GABA，真空干燥(0.1Mpa，45℃)；残余物溶解于300μL含80％流动相A和20％流动相B，PH＝5.8的溶液中，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测。准确称取0.1gγ-GABA标准品(sigma)，用超纯水配制成1mg/ml的储备液，存放于试剂瓶中，保存在4℃冰箱，使用前配制成适宜浓度的工作液用于液相色谱标准曲线制作。色谱柱为C18柱(waters,25cm×4.6mmol/L，5μmol/L)；流动相A为混合溶液(8.205g乙酸钠，0.5ml三乙胺，0.7ml乙酸，5ml乙腈定容至1L)，流动相B为乙腈-水(60：40)，洗脱梯度为0.6mL/min等梯度洗脱，检测器为waters 996光电二极管阵列检测器，进样量20μL，检测波长为254nm；通过标准曲线得到γ-GABA浓度c(mg/L)，最终得到γ-GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。
发现其生物量为0.73g/L(见图1)，γ-GABA含量较对照组增加了3.52％(见图2)。
实施例2
本实施例为基于兼养雨生红球藻产γ-氨基丁酸的方法，其主要步骤为：
(1)在温度25℃、光照3000lx时，以2g/L醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液，藻液浓度为0.3g/L。
(2)用纯水配制1g/L的NaCl母液，将适量NaCl母液添加到诱导藻液中使NaCl浓度为0.4g/L，并置于27℃、光强13000lx下诱导培养；
(3)隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂提取藻细胞内γ-GABA，并利用液相色谱检测(同实施例1)，发现其生物量和γ-GABA含量分别较对照组增加了2.7％和24.64％(见图1和2)。
实施例3
本实施例为基于兼养雨生红球藻产γ-氨基丁酸的方法，其主要步骤为：
(1)在温度26℃、光照3500lx时，以2.5g/L醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液，藻液浓度为0.5g/L。
(2)用纯水配制1g/L的NaCl母液，将适量NaCl母液添加到诱导藻液中使NaCl浓度为0.6g/L，并置于28℃、光强14000lx下诱导培养；
(3)隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂提取藻细胞内γ-GABA，并利用液相色谱检测(同实施例1)，发现其生物量最高为0.7g/L(见图1)，γ-GABA含量较对照组增加了8.6％(见图2)
对比例1
为说明本发明方法中NaCl浓度对藻细胞中γ-GABA积累的影响，本对比例为兼养光诱导培养模式下微藻的γ-GABA积累方法，其中NaCl浓度为0g/L，其主要步骤为：
(1)在温度25℃、光照3000lx时，以2g/L醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液，藻液浓度为0.3g/L。
(2)用纯水配制1g/L的NaCl母液，将适量NaCl母液添加到诱导藻液中使NaCl浓度为0g/L，并置于26℃、光强12000lx下诱导培养；
(3)隔天离心收集藻细胞，利用有机溶剂提取藻细胞内γ-GABA，并利用液相色谱检测，发现其生物量为0.74g/L(见图1)，γ-GABA含量最高可达30.95mg/g(见图2)。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于兼养雨生红球藻γ-氨基丁酸的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、诱导藻液的制备：在光照条件下，以醋酸钠为碳源的基础BBM培养基兼养培养雨生红球藻，待雨生红球藻生长至对数生长期后期收集藻细胞，用新鲜的BBM培养基稀释重悬浮藻细胞作为诱导藻液；
步骤2、诱导藻细胞积累γ-GABA：用纯水配制1g/L的NaCl母液，将NaCl母液添加到诱导藻液中调节NaCl浓度，并置于高光照条件下诱导培养；
步骤3、隔天收集藻细胞，检测γ-GABA含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的光照培养温度为24-26℃，光照培养强度为2800-3500lx。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的醋酸钠的加入量为1.5-2.5g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的诱导藻液浓度为0.1-0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的诱导藻液中的NaCl浓度为0.2-0.6g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的诱导条件为：温度26-28℃，光强12000-14000lx。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的收藻及γ-GABA含量检测具体方法为：隔天收集藻液，先将藻液经3500r/min离心富集10min，并用蒸馏水反复洗涤2次后冻干制成干藻粉；其次称取0.1g干燥粉，将样品置于烘干过的研钵中，加入6ml乙酸进行研磨提取1h，每20min振荡一次，6037×g离心15min，收集上清；然后在振荡条件下加入4ml乙醇去除大分子聚合物，16770×g离心20min；收集上清并真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物用0.5ml蒸馏水溶解，2683×g离心10min；取300μL样品或γ-GABA标准品上清液真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物溶解于60μL体积比为2:2:1的乙醇-水-三乙胺中，真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃，残余物溶解于90μL体积比为7:1:1:1的乙醇-水-三乙胺-异硫腈酸苯酯中，室温反应20min形成PTC-GABA，真空干燥，真空干燥压强为0.1Mpa，真空干燥温度为45℃；残余物溶解于300μL含80％流动相A和20％流动相B，PH＝5.8的溶液中，然后用0.45μm的滤膜过滤，待测；准确称取0.1gγ-GABA标准品，用超纯水配制成1mg/ml的储备液，存放于试剂瓶中，保存在4℃冰箱，使用前配制成适宜浓度的工作液用于液相色谱标准曲线制作；通过标准曲线得到γ-GABA浓度c(mg/L)，最终得到γ-GABA含量：P(mg/g)＝c(mg/L)V(mL)/m(g)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，色谱柱为C18柱，waters,25cm×4.6mmol/L，5μmol/L；流动相A为混合溶液，流动相B为体积比为60：40的乙腈和水，洗脱梯度为0.6mL/min等梯度洗脱，检测器为waters 996光电二极管阵列检测器，进样量20μL，检测波长为254nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，混合溶液的配比为：8.205g乙酸钠，0.5ml三乙胺，0.7ml乙酸，5ml乙腈定容至1L。
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