CN109890428A - 用于真皮填充剂应用的凝聚层透明质素水凝胶 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含基于透明质酸的水凝胶的真皮填充剂。水凝胶是通过阴离子多糖诸如透明质酸与阳离子多糖诸如壳聚糖之间的离子相互作用形成的凝聚层。真皮填充剂可用于加强软组织的强度，减少软组织的缺陷并改善软组织的质量。

Description

用于真皮填充剂应用的凝聚层透明质素水凝胶

背景技术

本公开整体涉及可注射真皮填充剂。真皮填充剂是包含阴离子多糖和阳离子多糖的水凝胶组合物。更具体地，水凝胶在透明质酸与阳离子多糖之间包含离子复合物。

可注射真皮填充剂是充当皮肤内的微整形填充针剂(volumizer)，或填充皮肤内或皮肤下空隙的占位剂的凝胶，以减少皱纹或其他皮肤缺陷的出现。真皮填充剂也可用于整修特定软组织特征(包括面部特征)，或用于替换真皮组织。真皮填充剂材料呈生物惰性，从而仅经由对相邻的组织的机械压力来实现其目标。真皮填充剂已示出在体内持续至多18个月。为了实现修复深度皱纹或皮肤缺陷或者整修特定面部特征所期望的结果，希望这些凝胶具有足够的提升能力、良好的模制性能和/或可注射性。

透明质酸(HA)也称为透明质素，是一种存在于遍及人体的多种组织，包括结缔组织、上皮组织和神经组织内的非硫酸化糖胺聚糖。HA大量存在于不同的皮肤层内，在这些皮肤层具有多种功能，诸如确保良好的水合作用，有助于细胞外基质的构成，充当填充材料，并且参与组织修复机制。然而，皮肤中所存在的HA及其他基体聚合物诸如胶原蛋白和弹性蛋白的量随年龄而有所减少。例如，重复暴露于来自日光或其他来源的紫外光导致真皮细胞产生的HA减少并且其降解速率增大。这种物质的损失导致各种皮肤状况诸如皱纹、凹陷、水分损失以及促进老化外观的其他不期望状况。

可注射真皮填充剂已被成功地用于处理老化皮肤，并且减少其他皮肤缺陷，诸如疤痕或软组织轮廓缺陷。这些填充剂可替换损失的内源性基体聚合物，或者提高/有利于现有基体聚合物的功能，从而处理这些皮肤状况。

由于其优异的生物相容性，HA已被视为真皮填充剂应用的理想候选。HA由具有游离羧酸根基团的重复二糖单元构成；因此，HA在生理pH下为阴离子多糖。

为了在最佳持续时间内有效地作为真皮填充剂，HA通常是化学交联的，因为非交联HA在体内具有较短的持效时间。化学交联方法包括迈克尔加成、硫醇-烯偶联、自由基聚合、使用二胺或多胺作为交联剂的碳二亚胺化学法(例如，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC))，以及使用1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)作为交联剂的环氧化学法。其他常用的化学交联剂包括二乙烯基砜(DVS)和1，2，7，8-二环氧基辛烷(DEO)，以及本文所公开的其他试剂。这些化学交联方法提供了具有共价键合的骨架的HA。

常规化学交联的水凝胶的一个限制在于它们通常需要冗长的纯化步骤。用常规交联方法制成的化学交联的HA水凝胶的另一个限制在于它们通常不从它们交联时起就可注射，并且必须被进一步处理以使其作为真皮填充剂而可注射。例如，为了可通过细针注入，交联HA凝胶通常再水合至期望的浓度，随后使水合凝胶筛分通过精细多孔筛网或均化工艺来进一步处理。非交联HA有时作为进一步处理步骤而添加，从而提高凝胶的润滑性和可注射性。交联HA水凝胶的进一步处理的一个缺陷在于，凝胶通常在这些附加处理步骤期间，尤其是在具有高储能模量(G′)的水凝胶情况下丧失其粘结性。因此，材料的提升能力和模制性能可能在处理皮肤或软组织的用途中受到影响，例如，材料可能就深度皱纹和整修应用而言受到影响。

克服化学交联的水凝胶的局限性的另一个方法在于注射低粘度的包含化学-或UV-交联性官能团的HA，并且原位形成水凝胶。该方法的缺陷在于前体呈反应性，难以制备、处理和储存，并且遭遇到较低医生可用性的问题。

仍然需要良好的真皮填充剂来处理和改善软组织的外观，包括皮肤。

发明内容

本发明提供了一种可用于处理受试者的软组织(诸如皮肤)的包含凝聚层水凝胶的真皮填充剂组合物。凝聚层水凝胶包含基于“阴离子HA”多糖(如本文进一步所述，诸如透明质酸)与阳离子多糖之间的电荷-电荷相互作用的非共价复合物。复合物通过多糖的阴离子与阳离子之间的静电和/或离子相互作用产生。更具体地，相互作用发生在阴离子HA多糖离子与阳离子多糖离子之间。在一些方面，相互作用通过HA的羧酸根阴离子与阳离子多糖的阳离子之间的离子相互作用产生。因此，相比于经由共价键所连接的常规交联HA水凝胶的固定相互作用，本发明的凝聚层HA水凝胶的多糖之间的键合相互作用更为动态。例如，本发明凝聚层HA水凝胶的阴离子-阳离子相互作用可能例如在剪切或其他条件下被破坏，并且相同或不同的阴离子-阳离子相互作用可在相同或不同的阴离子-阳离子对之间形成。这样，凝聚层水凝胶是“自修复”的，并且有利地保持粘结性并且可模塑而无需使用前的多个均化或筛分步骤。因此，本发明的凝聚层HA基水凝胶提供了优于常规化学交联的HA基真皮填充剂的多个优势。例如，本发明的许多水凝胶能够被处理为真皮填充剂而无需有时需要从化学交联凝胶移除化学残余物的某些冗长的化学交联和复杂纯化步骤，无需通过筛分、均化进一步处理，其可能破坏凝胶完整性并导致形成不利于可注射性的凝胶颗粒，或者无需添加非交联HA来提高润滑性或可注射性。

在一些方面，相对于化学交联的HA基水凝胶，本发明的凝聚层HA基水凝胶就其期望的应用如真皮填充剂材料而言具有足够或改善的特性，包括足够或改善的粘结性、模制性能、提升能力和/或可注射性。

在本发明的一个方面，提供了通常包含凝聚层HA水凝胶的真皮填充剂。在一些方面，水凝胶包含阴离子HA和阳离子多糖。在一些方面，水凝胶在阴离子HA与阳离子多糖之间包含离子复合物。

在一些方面，水凝胶包含阴离子HA多糖，其本身为透明质酸(HA)。在其他方面，阴离子HA是“改性HA”，即已被改性成引入除羧酸根之外的一个或多个阴离子基团的HA，并且其中阴离子基团可以相同或不同，如本文进一步所定义。在一些方面，水凝胶包含同阴离子的阴离子HA。在其他方面，水凝胶包含杂阴离子的阴离子HA。在一些方面，水凝胶包含选自非交联阴离子HA、交联阴离子HA、以及它们的混合物的阴离子HA。在一些方面，水凝胶包含非交联HA、交联HA、或它们的混合物。

在一些方面，凝聚层水凝胶包含阳离子多糖。在一些方面，阳离子多糖已被改性成引入一个或多个附加的阳离子基团，和/或相对于其未改性形式不同的阳离子基团。在一些方面，水凝胶包含同阳离子的未改性或经改性的阳离子多糖。在其他方面，水凝胶包含杂阳离子的未改性或经改性的阳离子多糖。在一些方面，阳离子多糖是壳聚糖。在其他方面，阳离子多糖是三甲基壳聚糖。

在本发明的其他方面，提供了阳离子多糖即“阳离子HA”，以及制备其的方法。在本发明的另外方面，提供了包含阳离子HA的凝聚层水凝胶。在另一些方面，阳离子HA选自非交联阳离子HA、交联阳离子HA、以及它们的混合物。

在另一方面，提供了还包含美容剂或其他试剂诸如维生素、抗氧化剂和/或亮肤剂的真皮填充剂组合物。

在另一方面，本发明的凝聚层HA水凝胶提供于生理上可接受的载体中。在一些方面，生理上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水或非交联HA。

在另一方面，本发明的凝聚层HA水凝胶具有良好的模制性能。在一些方面，凝聚层HA水凝胶具有约50Pa至约5,000Pa的储能模量(G′)。在其他方面，凝聚层HA水凝胶具有约500Pa至约2,000Pa，或约500Pa至约1500Pa，或约500Pa至约1,000Pa的储能模量。在其他方面，凝聚层HA水凝胶具有约500Pa的储能模量。在其他方面，凝聚层HA水凝胶具有约1450Pa的储能模量。

在另一方面，本发明的凝聚层HA水凝胶可通过至少18号，更优选地至少27号针，或甚至更高规格的针注入。在一些方面，真皮填充剂和凝聚层HA水凝胶组合物可通过针注入而无需在注射之前筛分和/或匀化组合物。

在另一种方面，本发明提供了制备包含凝聚层HA水凝胶的真皮填充剂的一般方法。在一些实施方案中，该方法包括在阴离子HA与阳离子多糖之间形成离子复合物。在一些实施方案中，该方法包括在HA自身与阳离子多糖之间形成离子复合物。在另一种方面，本发明提供了制备具有不同流变学特性的凝聚层HA水凝胶的方法，其可基于阴离子HA多糖和阳离子多糖各自相应的阴离子和/或阳离子的pKa值形成。在一些方面，该方法包括提供生理上可接受的载体中的凝聚层HA水凝胶。在一些方面，该方法提供了凝聚层HA水凝胶，其储能模量(G′)在约50Pa至约5,000Pa范围内，例如约500Pa至约2,000Pa、约500Pa至约1500Pa，或约500Pa至约1,000Pa，或储能模量为约500Pa或约1450Pa。在本方法的一些方面，所提供的真皮填充剂不需要通过针(诸如细针)注入之前的进一步处理步骤，诸如筛分和/或匀化。

在另一方面，本发明提供了处理受试者的软组织诸如皮肤的方法。在一些方面，处理方法包括加强皮肤或软组织的强度，改善皮肤或软组织的质量，或减少受试者的皮肤或软组织的缺陷。在一些方面，该方法包括将本发明的真皮填充剂施用(例如注射)到受试者的软组织或皮肤中的步骤。在一些方面，该方法包括将真皮填充剂施用(例如注射)到受试者的真皮区域或皮下区域中的步骤。在一些方面，该方法包括将真皮填充剂施用(例如注射)到受试者的软组织的甚至较深区域中的步骤(例如出于盈容和外形修整目的)。在一些方面，处理包括成形、填充、盈容或整修受试者的软组织或皮肤。在其他方面，处理包括改善真皮体内稳态，改善皮肤厚度，创伤愈合，或减少受试者的疤痕。在一些方面，皮肤缺陷是皱纹、疤痕、或真皮组织损失。在一些方面，处理在至少约3个月的时段内有效。

本发明的这些及其他方面和优点可易于参照以下附图和具体实施方式来理解和体会。

附图说明

图1示出通过非交联HA和阳离子多糖诸如壳聚糖形成凝聚层HA水凝胶的示意图。A：非交联阴离子多糖诸如HA通过与阳离子多糖诸如壳聚糖的阳离子基团的静电相互作用而缩聚或复合并且包封成核，同时阳离子多糖充当包封缩聚或复合的阴离子HA的连续相。阴离子HA的酶降解受到抑制，因为其包埋在阳离子多糖基体之内；例如，透明质酸酶可用性的下降保护HA免于透明质酸酶降解。B：阴离子HA与阳离子多糖(例如壳聚糖)之间的电荷比接近电荷平衡。HA和壳聚糖形成聚离子复合物并且均匀分布在凝胶基质中。C：阳离子多糖(例如壳聚糖)通过与阴离子HA的阴离子基团的静电相互作用而缩聚或复合或包封成核，同时阴离子HA充当包封缩聚或复合的阳离子多糖(壳聚糖)的连续相。在图1B和图1C中，HA与阳离子多糖形成复合物，从而使透明质酸酶对HA的可用性下降并且保护HA免于透明质酸酶降解。

图2示出通过交联HA和阳离子多糖形成的凝聚层HA水凝胶的示意图。交联HA颗粒通过与阳离子多糖的阳离子基团的静电相互作用而包括在基质中。因为HA在这种情况下交联，HA已具有抗酶降解的特定抗性，该特性可通过包含在凝聚层水凝胶之内而进一步增大。阳离子多糖用于使交联HA凝胶颗粒保持在一起。凝胶由于离子结合的非特异性(即动态或“自修复”)性质而具有改善的粘结性和模制性能。

图3示出用交联HA和不同浓度的高纯度壳聚糖(HPC)制成的水凝胶的外观和机械性能；参见实施例4。(A)注射器中所制备的水凝胶用虚线划出。随着HPC含量从0.04当量增至0.20当量，水凝胶变得更不透明。(B)随着HPC含量增大，水凝胶储能模量(G′)以分步方式减小。报道了1％应变和5Hz频率的储能模量。

图4示出实施例4的水凝胶的凝胶溶胀/解离测试的结果。将水凝胶(约250μL)注入圆柱形模具中并离心以除去气泡。随后将水凝胶转移到PBS(20mL)中并在轨道式震荡器上于37℃和200RPM温育。在前24小时之内，水凝胶达到溶胀平衡，随后保持完整性而无需PBS中进一步解离或分散。虽然未添加壳聚糖的凝胶两天内在PBS缓冲液中解离(未示出)，但所有包含壳聚糖的制剂在至少29天内保持稳定。

具体实施方式

本发明提供了包含凝聚层HA水凝胶的真皮填充剂。水凝胶在阴离子HA与阳离子多糖之间包含离子复合物。在一些实施方案中，阴离子HA是透明质酸，其可为交联或非交联的。

如本文所用，“凝胶”是指遍布其全部体积经流体膨胀的非流体聚合物网络。

如本文所用，“水凝胶”是指遍布其全部体积经水性流体膨胀的非流体聚合物网络。

如本文所用，“凝聚层水凝胶”是指这样的水凝胶，其中非流体聚合物网络在阴离子多糖与阳离子多糖之间包含离子复合物，其中阴离子多糖和阳离子多糖各自独立地为交联或非交联的。离子复合物是非共价复合物；即阴离子多糖与阳离子多糖彼此不共价交联。

本发明的凝聚层水凝胶可通过如下方式形成：使包含阴离子多糖的水性组合物与包含阳离子多糖的水性组合物混合，从而提供遍布其全部体积经水性流体膨胀的非流体聚合物网络。

如本文所用，“凝聚层HA水凝胶”是指这样的水凝胶，其中非流体聚合物网络在阴离子HA多糖与阳离子多糖之间包含离子复合物，其中阴离子HA多糖和阳离子多糖各自独立地为交联或非交联的。离子复合物是非共价复合物；即阴离子HA多糖与阳离子多糖彼此不共价交联。

本发明的凝聚层HA水凝胶可通过如下方式形成：使包含阴离子HA多糖的水性组合物与包含阳离子多糖的水性组合物混合，从而提供遍布其全部体积被水性流体膨胀的非流体聚合物网络。包含阴离子HA多糖的水性组合物可由阴离子HA多糖(其可为交联或非交联的)和水性流体诸如水、pH调节水(例如酸性、中性或碱性水)、或缓冲液制备，以给出可采取多种形式的水性组合物，包括但不限于溶液、悬浮液、或凝胶。相似地，包含阳离子多糖的水性组合物可由阳离子多糖(其可为交联或非交联的)和水性流体诸如水、pH调节水(例如酸性、中性或碱性水)、或缓冲液制备，以给出可采取多种形式的水性组合物，包括但不限于溶液、悬浮液、或凝胶。

如本文所用，“阴离子多糖”是指在生理pH的溶液中具有净负电荷的多糖。应当理解，本文提及到的阴离子多糖并不排除阴离子多糖上存在的一种或多种中性或阳离子官能团，换言之，阴离子多糖仅需在生理pH下(或处于形成或使用凝聚层复合物的pH下)溶液中带有总(净)负电荷。具体地，阴离子多糖是指(a)未经改性并且包含足以使得多糖的总(净)电荷在生理pH下为负的数量的阴离子基团的多糖；以及(b)已被改性过的多糖，(i)以包含足以使得在改性之后多糖的总(净)电荷在生理pH下为负的数量的阴离子基团；(ii)以改变未改性阴离子多糖的一个或多个阴离子的种类，只要多糖的净电荷保持为负即可；(iii)以相对于未改性多糖而言改变(增加或减少)阴离子的数量，只要多糖的净电荷保持为负即可；以及(iv)它们的组合。阴离子多糖的非限制性示例包括HA，其可以是未改性的或者被改性成包含附加和/或不同的阴离子基团，如本文所公开。阴离子多糖可为同阴离子或杂阴离子，并且可为交联或非交联的。

如本文所用，术语“阴离子HA”包括“HA”和“改性阴离子HA”两者。

如本文所用，“HA”是指透明质酸(HA)。HA是阴离子多糖，尤其是糖胺聚糖。此外，“HA”是指透明质酸和任何其透明质酸盐，包括但不限于透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙、以及它们的组合。

如本文所用，术语“改性阴离子HA”是指已被改性成一个或多个羧酸根阴离子被一个或多个另选的阴离子(诸如磺酸根和/或膦酸根)替换的HA。改性阴离子HA可为同阴离子或杂阴离子，并且可为交联或非交联的。

如本文所用，“阳离子多糖”是指在生理pH下(或处于形成或使用凝聚层复合物的pH下)溶液中具有净正电荷的未经改性或改性的多糖。具体地，阳离子多糖是指(a)未改性并且包含足以使得多糖的总(净)电荷在生理pH下为正的数量的阳离子基团的多糖；或者(b)已被改性过的多糖，(i)以包含足以使得在改性之后多糖的总电荷在生理pH下为正的数量的阳离子基团；(ii)以改变未改性多糖的一个或多个阳离子的种类，只要多糖的净电荷保持为正即可；(iii)以相对于未改性多糖而言改变(增加或减少)阳离子的数量，只要多糖的净电荷保持为正即可；以及(iv)它们的组合。阳离子多糖可为同阳离子或杂阳离子，并且可为交联或非交联的。阳离子多糖的非限制性示例包括壳聚糖、三甲基壳聚糖和阳离子HA。

如本文所用，“阳离子HA”是指已被改性成包含足以使得所得多糖的总(净)电荷在生理pH下为正的数量的阳离子基团的HA。阳离子HA为阳离子多糖。阳离子HA可为同阳离子或杂阳离子，并且可为交联或非交联的。

阳离子官能团的非限制性示例包括铵；胍鎓；在环中含有一个或多个质子化氮原子的杂环基；以及在环中含有一个或多个质子化氮原子的杂芳基。如本文所用，“铵”包括伯铵、仲铵、叔铵和季铵。具体地，铵具有以下结构：

其中每个Ra、Rb和Rc独立地选自氢以及未取代或取代的烷基基团，其各自可以相同或不同。例如，当Ra、Rb和Rc各自为氢时，阳离子为伯铵阳离子；当Ra、Rb和Rc各自为烷基时，阳离子为季铵阳离子。

如本文所用，“烷基”意指脂族烃基团，其可为直链或支链并且在链中含有约1至约20个碳原子。优选的烷基基团在链中含有约1至约12个碳原子。更优选的烷基基团在链中含有约1至约6个碳原子。支链意指一个或多个低级烷基基团诸如甲基、乙基或丙基连接到线性烷基链。“烷基”可为未取代的，或任选地被一个或多个可相同或不同的取代基所取代，每个取代基独立地选自卤素、烷基、芳基、杂环基、杂芳基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、烷硫基、氨基、肟(例如＝N-OH)、-NH(烷基)、-NH(环烷基)、-N(烷基)₂、-O-C(O)-烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-SF₅、羧基、-C(O)O-烷基、-C(O)NH(烷基)和-C(O)N(烷基)₂。合适的烷基基团的非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

如本文所用，“杂环基”意指含有约3至约10个环原子，优选地约5至约10个环原子的非芳族饱和单环或多环环系，其中环系中的一个或多个原子是单独或组合的除碳之外的元素，例如氮、氧或硫。环系中不存在相邻的氧和/或硫原子。优选的杂环基含有约5至约6个环原子。杂环基根名之前的前缀氮杂、氧杂或硫杂意指至少一个氮、氧或硫原子分别作为环原子存在。杂环基环中的任何N能够以质子化形式存在。杂环基环中的任何-NH能够以被保护的形式存在，诸如例如作为-N(Boc)、-N(CBz)、-N(Tos)基团等；此类保护也被视为本发明的一部分。杂环基可任选地被一个或多个可相同或不同的“环系取代基”取代，并且如本文所定义。杂环基的氮或硫原子可任选地被氧化成对应的N-氧化物、S-氧化物或S，S-二氧化物。合适的单环杂环基环的非限制性示例包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢噻唑基、内酰胺等等。“杂环基”也包括如上所述杂环基环，其中＝O替换同一环碳原子上的两个可用氢。

如本文所用，“杂芳基”意指含有约5至约14个环原子，优选地约5至约10个环原子的芳族单环或多环环系，其中一个或多个环原子是单独或组合的除碳之外的元素，例如氮、氧或硫。优选的杂芳基含有约5至约6个环原子。杂环基根名之前的前缀氮杂、氧杂或硫杂意指至少一个氮、氧或硫原子分别作为环原子存在。杂环基环中的任何N能够以质子化形式存在。“杂芳基”可任选地被一个或多个可相同或不同的“环系取代基”取代，并且如本文所定义。杂芳基的氮原子可任选地氧化成对应的N-氧化物。合适杂芳基的非限制性示例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡啶酮(包括N-取代的吡啶酮)、异噁唑基、异噻唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、呋咕基、吡咯基、吡唑基、三唑基、1,2,4-噻二唑基、吡嗪基、哒嗪基、喹噁啉基、酞嗪基、羟吲哚基(oxindolyl)、咪唑并[1，2-a]吡啶基、咪唑并[2，1-b]噻唑基、苯并呋咱基(benzofurazanyl)、吲哚基、氮杂吲哚基、苯并咪唑基、喹啉基、咪唑基、噻吩并吡啶基、喹唑啉基、噻吩并嘧啶基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、异喹啉基、苯并氮杂吲哚基、1，2，4-三嗪基、苯并噻唑基等等。术语“杂芳基”也指部分饱和的杂芳基部分，诸如例如四氢异喹啉基、四氢喹啉基等等。

如本文所用，“环系取代基”意指连接到芳族或非芳族环系上的取代基，其例如替代环系上的可用氢。环系取代基可以相同或不同，各自独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、烷芳基、杂芳烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、烷基杂芳基、羟基、羟烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、酰基、芳酰基、卤素、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基硫代、芳基硫代、杂芳基硫代、芳烷基硫代、杂芳烷基硫代、环烷基、杂环基、-SF₅、-O-C(O)-烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(＝N-CN)-NH₂、-C(＝NH)-NH₂、-C(＝NH)-NH(烷基)、肟(例如＝N-OH)、-NY₁Y₂、-烷基-NY₁Y₂、-C(O)NY₁Y₂、-SO₂NY₁Y₂和-SO₂NY₁Y₂，其中Y₁和Y₂可以相同或不同并且独立地选自氢、烷基、芳基、环烷基和芳烷基。

在一些实施方案中，阳离子多糖的阳离子官能团通过将一种或多种氨基酸引入到多糖中而提供，例如精氨酸侧链可提供胍鎓离子；赖氨酸或鸟氨酸侧链可提供铵离子；组氨酸侧链可提供咪唑鎓离子；脯氨酸可提供吡咯烷鎓离子。

在其他实施方案中，阳离子官能团由多糖的一个或多个重复单元提供。在一些实施方案中，阳离子基团由D-葡糖胺提供，其中伯氨基被质子化以提供伯铵离子。

在一些实施方案中，多糖的伯氨基被烷基化以提供对应的仲铵、叔铵和/或季铵离子。

在一些实施方案中，阳离子多糖是壳聚糖。壳聚糖也称为聚氨葡糖、脱乙酰壳聚糖和聚-(D)葡糖胺，是包括β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(去乙酰单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)的直链多糖。壳聚糖(包括商业制备的壳聚糖)可通过对甲壳质的脱乙酰化提供。在一些实施方案中，脱乙酰化度(％DD)的范围为约60％至约100％。在一些实施方案中，壳聚糖的氨基具有约6.5的pKa值，其导致在酸性到中性溶液中，包括生理pH下质子化(即形成铵离子)，其中电荷密度依赖于pH和％DD。在一些实施方案中，壳聚糖的分子量为约3800道尔顿至约20,000道尔顿。在其他实施方案中，阳离子多糖是烷基氨基壳聚糖。在一个此类实施方案中，阳离子多糖是包括季铵离子的季铵化壳聚糖。在一个特定实施方案中，阳离子多糖是三甲基壳聚糖。

在一些实施方案中，阳离子基团通过衍生化具有含阳离子基团的多糖的阴离子而引入到多糖中，从而用阳离子替换阴离子。在一些实施方案中，多糖是阳离子多糖，并且阳离子被引入以在多糖中包含附加阳离子，例如从而调节阳离子多糖的pKa和/或调整包含多糖的凝聚层水凝胶的流变性。在其他实施方案中，多糖是阴离子多糖，并且引入阳离子以调节多糖的pKa和/或调整包含多糖的水凝胶的流变性。在一些实施方案中，多糖是阴离子多糖，并且引入阳离子基团以使阴离子多糖转化为阳离子多糖。例如，阴离子多糖可为HA，其可转化为阳离子HA。

将胺官能团(即铵阳离子源)引入包含羧酸基团的多糖的方法可通过使多糖与二胺或多胺反应来实现(参见图1a和图1b)。在一些实施方案中，多糖是HA。在一个示例性实施方案中，使包含一个或多个羧酸基团的多糖与二胺或多胺在偶联剂存在下偶联以形成酰胺键。多糖可为HA。可用于将阳离子引入带有羧酸基团的多糖中的胺的非限制性示例包括氨基酸(诸如赖氨酸和鸟氨酸)、六亚甲基二胺(HMDA)、精胺、亚精胺、以及前述物质的衍生物或保护形式。例如，胺可包括一个或多个羧酸酯和/或N-Boc基团，诸如赖氨酸甲酯、N_ε-Boc-赖氨酸甲酯、鸟氨酸甲酯、以及N_δ-Boc-鸟氨酸甲酯。可用于在多糖的羧酸基团与胺之间形成肽键的偶联剂的非限制性示例包括碳二亚胺诸如二环己基碳二亚胺(DCC)，以及水溶性碳二亚胺诸如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1-乙基-3-(3-三甲氨基丙基)碳二亚胺(ETC)、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺(CMC)、以及它们的盐和它们的混合物。

当化合物中的官能团限定为“被保护”时，这意指基团呈改性形式，以当该化合物经历反应时防止保护位点处不期望的副反应。本领域普通技术人员以及通过参考标准教科书诸如例如T.W.Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis(1991)，Wiley，New York将认识到合适的保护基团。例如，氨基可用-(Boc)、-(CBz)或-(Tos)基团等保护，并随后去保护以提供对应的氨基或对应的铵离子。

所提供方法的非限制性实施方案示于方案1a中，其示出包含羧酸基团的多糖与HMDA在EDC存在下偶联。在该实施方案中，一个HMDA氨基形成酰胺键，而另一个氨基提供铵离子。

另一个非限制性实施方案示于方案1b中，其示出包含羧酸基团的多糖与N_ε-Boc-赖氨酸甲酯在EDC存在下偶联，使得赖氨酸的α-氨基与多糖的氨基基团形成酰胺键；随后使用本领域的普通技术人员通常已知的方法对N-ε-BOC基团去保护，以提供铵离子。

方案1a：

方案1b：

在一些实施方案中，使多糖的一个或多个氨基衍生化以引入胍鎓离子。伯铵离子转化为胍鎓离子的方法公开于Hunt等人TUNABLE，HIGH MODULUS HYDROGELS DRIVEN BYIONIC COACERVATION，Advanced Materials，2011，23，2327-2331，该专利的全部公开内容通过该具体参考在此引入。在一个实施方案中，可使包含一个或多个氨基/铵基团的多糖与1H-吡唑-1-甲脒反应，以提供胍鎓阳离子，如方案2a和2b所示。

方案2a：

方案2b：

在一些实施方案中，多糖的所有氨基转化为胍鎓离子。在其他实施方案中，仅多糖的一部分氨基转化为胍鎓基团，并且所得的多糖包含伯铵和胍鎓离子两者。

在另一个实施方案中，多糖的所有氨基被烷基化，例如以提供包含仲铵离子、叔铵离子和/或季铵离子的多糖。在其他实施方案中，仅多糖的一部分氨基被烷基化，并且所得的多糖包含伯铵离子和仲铵离子、叔铵离子和/或季铵离子。

在另一个实施方案中，仅多糖的一部分氨基被烷基化，并且其他氨基转化为胍鎓离子，从而提供包含伯铵离子、仲铵离子、叔铵离子、季铵离子、胍鎓离子、或它们的组合的多糖。

在一些实施方案中，由交联HA制备交联阳离子HA。制备交联HA的方法的非限制性示例在上文有所描述。在一个实施方案中，例如通过引入铵离子(例如参见方案1a和1b)，并任选地通过烷基化铵离子，和/或通过引入胍鎓离子(例如参见方案2a和2b)，对交联HA改性以引入阳离子基团，从而提供带有伯铵离子、仲铵离子、叔铵离子、季铵离子和/或胍鎓离子的交联阳离子HA。

在一些实施方案中，将阴离子基团引入多糖中。在一些实施方案中，多糖是阳离子多糖，并且阴离子被引入以在多糖中包含阴离子，例如从而调节阳离子多糖的pKa和/或调整包含多糖的凝聚层水凝胶的流变性。在其他实施方案中，多糖是HA，并且引入阴离子以调节HA的pKa和/或调整包含HA的水凝胶的流变性。

阴离子官能团的非限制性示例包括羧酸根、膦酸根和磺酸根。在一些实施方案中，如下提供膦酸根和/或磺酸根阴离子：使多糖(诸如HA)的一个或多个羧酸根基团相应地与氨基膦酸反应，以提供包含膦酸根离子的多糖；和/或与氨基氨磺酸反应，以提供包含磺酸根离子的多糖。在一些实施方案中，阴离子官能团的提供是通过将氨基酸引入多糖中，例如能够提供羧酸根离子的天冬氨酸或谷氨酸侧链。

应当理解，当特定基团的pKa可低于7时，特定基团(例如咪唑或N-末端氨基)可充当阳离子，因此可用于在基团质子化的pH条件下形成和/或使用凝聚层凝胶。相反地，应当理解，当特定基团的pKa可高于7时，特定基团可充当阴离子，并且可用于在基团去质子化的pH条件下形成和/或使用凝聚层凝胶。

在一些实施方案中，提供了具有不同流变学特性的凝聚层HA水凝胶，其可基于阴离子HA和阳离子多糖各自对应的阴离子和/或阳离子的pKa值形成。例如，电荷-电荷相互作用的强度取决于阴离子和/或阳离子的种类，从而影响所得凝胶的特性。因此，水凝胶的流变性可通过选择具有特定pKa的特定离子基团和/或通过调节各离子基团的相对数量进行调节。在一些实施方案中，同阴离子/同阳离子复合物、同阴离子/杂阳离子复合物、杂阴离子/同阳离子复合物、或杂阴离子/杂阳离子复合物对调节凝胶流变性而言可能是必需的。

在一个实施方案中，本发明的真皮填充剂包含HA基水凝胶，该水凝胶包含阴离子HA和阳离子多糖。在一些实施方案中，阴离子HA是非交联的。在其他实施方案中，阴离子HA是交联的。在一些实施方案中，阳离子多糖是非交联的。在其他实施方案中，阳离子多糖是交联的。

在一些实施方案中，本发明的真皮填充剂包含HA基水凝胶，该水凝胶包含HA和阳离子多糖。在一些实施方案中，HA是非交联的。在其他实施方案中，HA是交联的。在一些实施方案中，阳离子多糖是非交联的。在其他实施方案中，阳离子多糖是交联的。

在一个实施方案中，提供了包含非交联阴离子HA的凝聚层水凝胶。在该示例中，非交联阴离子HA通过与阳离子多糖的阳离子基团相互作用而缩聚(即与阳离子多糖复合)并包封成核，同时阳离子多糖充当其中分散有缩聚的非交联阴离子HA的连续相(参见图1A)。

在另一个实施方案中，提供了包含非交联HA和非交联阳离子多糖诸如壳聚糖的凝聚层水凝胶，其中阴离子HA与阳离子壳聚糖之间的电荷比接近电荷平衡，HA和壳聚糖形成聚离子复合物并且均匀分布在凝胶基质中(参见图1B)。

在另一个实施方案中，提供了包含非交联HA和非交联阳离子多糖诸如壳聚糖的凝聚层水凝胶，其中非交联阳离子多糖通过与阴离子HA的阴离子基团相互作用而缩聚(即与阴离子HA复合)并包封成核，同时阴离子HA充当其中分散有缩聚的非交联阳离子多糖的连续相(参见图1C)。

在另一个实施方案中，提供了包含交联阴离子HA的凝聚层水凝胶。在该示例中，交联阴离子HA多糖与阳离子多糖复合，并且阳离子多糖充当其中分散有交联阴离子HA颗粒的连续相(参见图2)。在一些实施方案中，阳离子多糖充当粘结“胶”以保持或包封交联阴离子HA水凝胶颗粒。

在另一个实施方案中，水凝胶在非交联阴离子HA与交联阳离子HA之间包含离子复合物。HA充当其中分散有交联阳离子HA颗粒的连续相。在一些实施方案中，阴离子HA多糖充当粘结“胶”以保持或包封交联阳离子HA水凝胶颗粒。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶包含同阴离子HA多糖，其中各阴离子具有相同的种类。例如，同阴离子多糖可为HA，其中各阴离子为羧酸根阴离子。

在一些实施方案中，水凝胶包含改性杂阴离子HA(即已被改性成引入一种或多种阴离子来取代羧酸根的HA)，其中阴离子具有不同的种类(例如羧酸根、膦酸根和/或磺酸根)，其各自可具有相同或不同的pKa值。例如，HA可与氨基膦酸在提供具有膦酸根阴离子的同阴离子HA的条件下反应。又如，HA可与氨基氨磺酸(aminosulfamic acid)在提供具有磺酸根阴离子的同阴离子HA的条件下反应。又如，HA可与氨基膦酸在提供具有羧酸根和膦酸根阴离子两者的杂阴离子HA的条件下反应。又如，HA可与氨基氨磺酸在提供具有羧酸根和磺酸根阴离子两者的杂阴离子HA的条件下反应。又如，HA可同时或相继与氨基膦酸和氨基氨磺酸在提供具有羧酸根、膦酸根和磺酸根基团的杂阴离子HA的条件下反应。

在一些实施方案中，凝聚层HA水凝胶包含同阳离子多糖，其中各阳离子具有相同的种类，例如其中各阳离子为伯铵离子。在一些实施方案中，同阳离子多糖是壳聚糖。

在其他实施方案中，凝聚层HA水凝胶包含杂阳离子多糖，其中两个或更多个阳离子具有不同的种类(例如伯铵、季铵、胍鎓和/或咪唑鎓)，其各自可具有相同或不同的pKa值。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶包含同阴离子HA和同阳离子多糖。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA，并且同阳离子多糖是壳聚糖。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶包含同阴离子HA和杂阳离子多糖。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶包含杂阴离子HA和同阳离子多糖。在一些实施方案中，同阳离子多糖是阳离子HA。在一些实施方案中，同阳离子多糖是壳聚糖。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶包含杂阴离子HA和杂阳离子多糖。

在一些实施方案中，水凝胶在同阴离子HA与同阳离子多糖之间包含离子复合物。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA。在一些实施方案中，同阳离子多糖是阳离子HA。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA，并且同阳离子多糖是阳离子HA或壳聚糖。

在一些实施方案中，水凝胶在同阴离子HA与杂阳离子多糖之间包含离子复合物。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA。

在一些实施方案中，水凝胶在杂阴离子HA与同阳离子多糖之间包含离子复合物。在一些实施方案中，同阳离子多糖是阳离子HA或壳聚糖。

在一些实施方案中，水凝胶在杂阴离子HA与杂阳离子多糖之间包含离子复合物。

本发明的非限制性实施方案包括在阴离子多糖与阳离子多糖之间包含离子复合物的水凝胶，其中阴离子多糖选自表1的阴离子多糖实施方案，并且阳离子多糖选自表1的阳离子多糖实施方案，而关于阴离子多糖和阳离子多糖的可能组合不受限制。

表1：

在另一些实施方案中，提供了如表1所述的凝聚层HA水凝胶，该水凝胶还包含美容剂、维生素、抗氧化剂、亮肤剂、或它们的组合。

在另一些实施方案中，如表1和前述段落中所述的凝聚层HA水凝胶提供于生理上可接受的载体诸如例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或非交联HA中。

在一些实施方案中，本发明的HA水凝胶就其作为真皮填充剂的预期应用而言具有足够或改善的模制性能、提升能力和/或可注射性，相对于常规化学交联的基于HA的真皮填充剂有所改善。

在一些实施方案中，凝胶具有约50Pa至约5,000Pa范围内，例如约500Pa至约2000Pa、约500Pa至约1500Pa，或约500Pa至约1000Pa的储能模量(G′)，或具有约500Pa或约1450Pa的储能模量。在一些方面，具有高G’的凝胶可通过改变阴离子HA和阳离子多糖的浓度、阴离子HA与阳离子多糖的相对比率，和/或通过使用用于形成复合物的不同的阴离子和阳离子来调节阴离子-阳离子相互作用获得；例如，阴离子-阳离子对可包含较强的阴离子-阳离子相互作用，诸如磺酸根与胍鎓之间的离子相互作用。

在本发明的一些实施方案中，凝聚层HA水凝胶阻挡了水解酶的可接近性，从而在软组织诸如皮肤中导致较好的水凝胶完整性、持续时间、或两者。在一个实施方案中，透明质酸酶可接近性被阻挡。在另一个实施方案中，水解阳离子多糖的酶被阻挡。在另一个实施方案中，酯酶被阻挡。

在一些实施方案中，本发明的真皮填充剂在引入皮肤或其他软组织之后持续至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、或至少约6个月。在一些实施方案中，本发明的真皮填充剂在引入皮肤或其他软组织中之后持续多至约一年。在其他实施方案中，本发明的真皮填充剂在引入皮肤或其他软组织中之后持续多至约18个月。在特定实施方案中，真皮填充剂在引入皮肤或其他软组织中之后持续约3个月至约18个月。

在一些实施方案中，凝聚层HA水凝胶包含非交联阴离子HA(诸如非交联HA)，分子量范围为约50K至约3百万道尔顿、约100K至约3百万道尔顿、约500K至约3百万道尔顿、或约50K至约2百万道尔顿、约100K至约2百万道尔顿、或约500K至约2百万道尔顿。

在一些实施方案中，水凝胶的HA组分是交联阴离子HA多糖，诸如交联HA。如本文所用，术语“交联”是指使各个聚合物分子或单体链连接成更稳定的结构如凝胶的分子间键。因此，交联阴离子HA多糖具有使至少一个独立的多糖分子连接至另一个多糖分子的至少一个分子间键。

糖胺聚糖多糖诸如HA的交联通常导致形成水凝胶。此类水凝胶具有较高的粘度并且需要相当大的力来通过细针挤出。糖胺聚糖多糖(包括HA)通常可使用二醛和二硫化物交联剂进行交联，包括但不限于多官能的基于PEG的交联剂、二乙烯基砜、二缩水甘油醚以及双环氧化物、双碳二亚胺。HA交联剂的非限制性示例包括多官能的基于PEG的交联剂，如季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE)、二乙烯砜(DVS)、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1，2-双(2，3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1，2，7，8-二环氧基辛烷(DEO)、(亚苯基双-(乙基)-碳二亚胺和1，6-六亚甲基双(乙基碳二亚胺)、己二酸二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(BS)、六亚甲基二胺(HMDA)、1-(2，3-环氧丙基)-2，3-环氧环己烷、或它们的组合。其他可用的交联剂公开于Stroumpoulis和Tezel，Tunably Crosslinked PolysaccharideCompositions，美国专利公布US 2011/0077737，其全文以引用方式并入。使糖胺聚糖多糖交联的方法的非限制性示例描述于例如Piron和Tholin，Polysaccharide Crosslinking，Hydrogel Preparation，Resulting Polysaccharides(s)and Hydrogel(s)，usesThereof，美国专利公布2003/0148995；Lebreton，Cross-Linking of Low and HighMolecular Weight Polysaccharides，Preparation of Injectable MonophaseHydrogels，Polysaccharides and Hydrogels Obtained，美国专利公布2010/0226988；Lebreton，Viscoelastic Solutions Containing Sodium Hyaluronate andHydroxypropyl Methyl Cellulose，Preparation andUses，美国专利公布2008/0089918；Lebreton，Hyaluronic Acid-Based Gels Including Lidocaine，美国专利公布2010/0028438；以及Polysaccharides and Hydrogels thus Obtained，美国专利公布2006/0194758；和Di Napoli，Composition and Method for Intradermal Soft TissueAugmentation，国际专利公布WO 2004/073759；Njikang等人，Dermal FillerCompositions，美国专利公布2013/0096081；这些专利中的每一个均据此全文以引用方式并入本文。

在一些实施方案中，由交联HA制备改性的交联阴离子HA多糖。制备交联HA的方法的非限制性示例在上文有所描述。在一个实施方案中，交联HA被改性成引入除羧酸根之外的阴离子基团或取代羧酸根的阴离子基团。例如，交联HA可与氨基膦酸反应以提供具有膦酸根阴离子的交联同阴离子HA。又如，交联HA可与氨基氨磺酸反应以提供具有磺酸根阴离子的交联同阴离子HA。又如，交联HA可与氨基膦酸反应以提供具有羧酸根和膦酸根阴离子两者的交联杂阴离子HA。又如，交联HA可与氨基氨磺酸反应以提供具有羧酸根和磺酸根阴离子两者的交联杂阴离子HA。又如，交联HA可同时或相继与氨基膦酸和氨基磺酸反应以提供具有羧酸根、膦酸根和磺酸根基团的交联杂阴离子HA。

根据本说明书，制剂中的“％”定义为重量/重量(即w/w)百分比。例如：1％(重量/重量)意指10mg/g的浓度。

在一个实施方案中，水凝胶组合物包含以足以处理如本文所公开的软组织或皮肤状况的量存在的阴离子HA多糖(诸如HA)。在该实施方案的其他方面，组合物包含阴离子HA(诸如HA)，其例如占总组合物的约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、或约9％、或约10重量％。在该实施方案的另一些方面，组合物包含阴离子HA(诸如HA)，其例如占总组合物的最多1重量％、最多2重量％、最多3重量％、最多4重量％、最多5重量％、最多6重量％、最多7重量％、最多8重量％、最多9重量％、或最多10重量％。在该实施方案的另一些方面，组合物包含阴离子HA(诸如HA)，其例如占总组合物的约0.5重量％至约20重量％、约1重量％至约17重量％、约3重量％至约15重量％、或约5重量％至约10重量％，例如约11重量％、约15重量％或约17重量％。

在该实施方案的一些方面，水凝胶组合物包含以例如约2mg/g、约3mg/g、约4mg/g、约5mg/g、约6mg/g、约7mg/g、约8mg/g、约9mg/g、约10mg/g、约11mg/g、约12mg/g、约13mg/g、约13.5mg/g、约14mg/g、约15mg/g、约16mg/g、约17mg/g、约18mg/g、约19mg/g、或约20mg/g的浓度存在的阴离子HA(诸如HA)。在该实施方案的其他方面，组合物包含以例如至少1mg/g、至少2mg/g、至少3mg/g、至少4mg/g、至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g、至少20mg/g、或至少25mg/g、或约40mg/g的浓度存在的阴离子HA(诸如HA)。在该实施方案的另一些方面，组合物包含以例如最多1mg/g、最多2mg/g、最多3mg/g、最多4mg/g、最多5mg/g、最多10mg/g、最多15mg/g、最多20mg/g、最多25mg/g、或最多40mg/g的浓度存在的阴离子HA(诸如HA)。在该实施方案的另一些方面，组合物包含以例如约7.5mg/g至约19.5mg/g、约8.5mg/g至约18.5mg/g、约9.5mg/g至约17.5mg/g、约10.5mg/g至约16.5mg/g、约11.5mg/g至约15.5mg/g，或约12.5mg/g至约14.5mg/g、或至多约40mg/g的浓度存在的阴离子HA(诸如HA)。

本说明书的一些方面部分地提供了包含具有一定交联度的交联阴离子HA多糖的水凝胶组合物。如本文所用，术语“交联度”是指结合至交联剂的阴离子HA多糖单体单元诸如例如HA的二糖单体单元的百分比。交联度表示为交联剂与阴离子HA的重量百分比。在一些实施方案中，本发明的凝聚层水凝胶包含具有约1重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约2重量％至约10重量％、约3重量％至约10重量％或约5重量％至约10重量％的交联度的交联阴离子HA。在其他实施方案中，本发明的凝聚层水凝胶包含具有小于约10％的交联度的交联阴离子HA。

本说明书的一些方面部分地提供了包含非交联阴离子HA多糖的水凝胶组合物。如本文所用，术语“非交联”是指缺乏使各个阴离子多糖分子或单体链连接的分子间键。因此，非交联阴离子HA多糖(包括非交联HA)不经由共价分子间键连接至任何其他阴离子HA多糖。在该实施方案的一些方面中，真皮填充剂组合物包含非交联阴离子HA多糖，诸如非交联HA。在其他方面，真皮填充剂包含凝聚层HA水凝胶，其中凝聚层复合物包含非交联阴离子HA多糖，诸如非交联HA。

非交联HA多糖呈水溶性并且通常在性质上保持为流体。因此，非交联HA多糖可作为润滑剂与基于凝聚层HA多糖的水凝胶混合，以利于组合物通过细针挤出的过程。

本发明的一些方面部分地提供了包含低分子量阴离子HA多糖、高分子量阴离子HA多糖、或低分子量和高分子量阴离子HA多糖的水凝胶组合物。在提及“阴离子HA”时，如本文所用，术语“高分子量”是指平均分子量为1,000,000Da或更大的阴离子HA多糖(包括HA)。高分子量阴离子HA多糖(包括HA)的非限制性示例是约1,500,000Da、约2,000,000Da、约2,500,000Da、约3,000,000Da、约3,500,000Da、约4,000,000Da、约4,500,000Da、或约5,000,000Da的那些。在提及“阴离子HA”时，如本文所用，术语“低分子量”是指平均分子量小于1,000,000Da的阴离子HA多糖(包括HA)。低分子量阴离子HA多糖(诸如HA)的非限制性示例是约100,000Da、约200,000Da、约300,000Da、约400,000Da、约500,000Da、约600,000Da、约700,000Da、或约800,000Da、或约900,000Da的那些。

在一个实施方案中，真皮填充剂组合物包含非交联低分子量阴离子HA多糖，或包含由非交联低分子量阴离子HA所制成的交联阴离子HA多糖，其中非交联低分子量阴离子HA具有例如约100,000Da、约200,000Da、约300,000Da、约400,000Da、约500,000Da、约600,000Da、约700,000Da、约800,000Da、或约900,000Da的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联低分子量阴离子HA具有例如最多100,000Da、最多200,000Da、最多300,000Da、最多400,000Da、最多500,000Da、最多600,000Da、最多700,000Da、最多800,000Da、最多900,000Da、或最多950,000的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联低分子量HA具有例如约100,000Da至约500,000Da、约200,000Da至约500,000Da、约300,000Da至约500,000Da、约400,000Da至约500,000Da、约500,000Da至约950,000Da、约600,000Da至约950,000Da、约700,000Da至约950,000Da、约800,000Da至约950,000Da、约300,000Da至约600,000Da、约300,000Da至约700,000Da、约300,000Da至约800,000Da、或约400,000Da至约700,000Da的平均分子量。

在另一个实施方案中，组合物包含非交联高分子量阴离子HA多糖(诸如非交联HA)，或包含由非交联高分子量HA所制成的交联阴离子HA多糖，其中非交联高分子量阴离子HA具有例如约1,000,000Da、约1,500,000Da、约2,000,000Da、约2,500,000Da、约3,000,000Da、约3,500,000Da、约4,000,000Da、约4,500,000Da、或约5,000,000Da的平均分子量。在该实施方案的其他方面，非交联高分子量阴离子HA具有例如至少1,000,000Da、至少1,500,000Da、至少2,000,000Da、至少2,500,000Da、至少3,000,000Da、至少3,500,000Da、至少4,000,000Da、至少4,500,000Da、或至少5,000,000Da的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联高分子量阴离子HA具有例如约1,000,000Da至约5,000,000Da、约1,500,000Da至约5,000,000Da、约2,000,000Da至约5,000,000Da、约2,500,000Da至约5,000,000Da、约2,000,000Da至约3,000,000Da、约2,500,000Da至约3,500,000Da、或约2,000,000Da至约4,000,000Da的平均分子量。在另一些方面，非交联高分子量阴离子HA具有例如大于2,000,000Da且小于约3,000,000Da、大于2,000,000Da且小于约3,500,000Da、大于2,000,000Da且小于约4,000,000Da、大于2,000,000Da且小于约4,500,000Da、大于2,000,000Da且小于约5,000,000Da的平均分子量。

在另一个实施方案中，真皮填充剂包含各种比率的高分子量阴离子HA多糖与低分子量阴离子HA多糖的组合；例如，高分子量阴离子HA与低分子量阴离子HA的比率可为约20∶1、约15∶1、约10∶1、约5∶1、约1∶1、约1∶5、约1∶10、约1∶15、或约1∶20。在一些实施方案中，使高分子量阴离子HA多糖与低分子量阴离子HA多糖以前述比率交联。

在一些实施方案中，凝聚层水凝胶的阳离子多糖以足以处理本文所公开的皮肤状况的量存在。在该实施方案的其他方面，组合物包含阳离子多糖，其例如占总组合物的约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、或约9％、或约10重量％。在该实施方案的另一些方面，组合物包含阳离子多糖，其例如占总组合物的最多1重量％、最多2重量％、最多3重量％、最多4重量％、最多5重量％、最多6重量％、最多7重量％、最多8重量％、最多9重量％、或最多10重量％。在该实施方案的另一些方面，组合物包含阳离子多糖，其例如占总组合物的约0.5重量％至约20重量％、约1重量％至约17重量％、约3重量％至约15重量％、或约5重量％至约10重量％，例如约11重量％、约15重量％或约17重量％。

在该实施方案的一些方面，水凝胶组合物包含以例如约2mg/g、约3mg/g、约4mg/g、约5mg/g、约6mg/g、约7mg/g、约8mg/g、约9mg/g、约10mg/g、约11mg/g、约12mg/g、约13mg/g、约13.5mg/g、约14mg/g、约15mg/g、约16mg/g、约17mg/g、约18mg/g、约19mg/g、或约20mg/g的浓度存在的阳离子多糖。在该实施方案的其他方面，组合物包含以例如至少1mg/g、至少2mg/g、至少3mg/g、至少4mg/g、至少5mg/g、至少10mg/g、至少15mg/g、至少20mg/g、或至少25mg/g、或约40mg/g的浓度存在的阳离子多糖。在该实施方案的另一些方面，组合物包含以例如最多1mg/g、最多2mg/g、最多3mg/g、最多4mg/g、最多5mg/g、最多10mg/g、最多15mg/g、最多20mg/g、最多25mg/g、或最多40mg/g的浓度存在的阳离子多糖。在该实施方案的另一些方面，组合物包含以例如约7.5mg/g至约19.5mg/g、约8.5mg/g至约18.5mg/g、约9.5mg/g至约17.5mg/g、约10.5mg/g至约16.5mg/g、约11.5mg/g至约15.5mg/g，或约12.5mg/g至约14.5mg/g、或至多约40mg/g的浓度存在的阳离子多糖。

本说明书的一些方面部分地提供了包含具有一定交联度的交联阳离子多糖的水凝胶组合物。如本文所用，术语“交联度”是指结合至交联剂的阳离子多糖单体单元诸如例如阳离子多糖的二糖单体单元的百分比。交联度表示为交联剂与阳离子HA的重量百分比。在一些实施方案中，本发明的凝聚层水凝胶包含具有约1重量％至约15重量％、约1重量％至约10重量％、约2重量％至约10重量％、约3重量％至约10重量％或约5重量％至约10重量％的交联度的交联阳离子多糖。在其他实施方案中，本发明的凝聚层水凝胶包含具有小于约10％的交联度的交联阳离子多糖。

本说明书的一些方面部分地提供了包含非交联阳离子多糖的水凝胶组合物。如本文所用，术语“非交联”是指缺乏使各个阳离子多糖分子或单体链连接的分子间键。因此，非交联阳离子多糖不经由共价分子间键连接至任何其他阳离子多糖。在该实施方案的一些方面，真皮填充剂组合物包含非交联阳离子多糖。在其他方面，真皮填充剂包含凝聚层HA水凝胶，其中凝聚层复合物包含非交联阳离子多糖。

本发明的一些方面部分地提供了包含低分子量阳离子多糖、高分子量阳离子多糖、或低分子量和高分子量阳离子多糖的水凝胶组合物。在提及“阳离子多糖”时，如本文所用，术语“高分子量”是指平均分子量为1,000,000Da或更大的那些。高分子量阳离子多糖的非限制性示例包括约1,500,000Da、约2,000,000Da、约2,500,000Da、约3,000,000Da、约3,500,000Da、约4,000,000Da、约4,500,000Da、以及约5,000,000Da的那些。在提及“阳离子多糖”时，如本文所用，术语“低分子量”是指平均分子量小于1,000,000Da的那些。低分子量阳离子多糖的非限制性示例包括约100,000Da、约200,000Da、约300,000Da、约400,000Da、约500,000Da、约600,000Da、约700,000Da、约800,000Da、以及约900,000Da的那些。

在一个实施方案中，真皮填充剂组合物包含非交联低分子量阳离子多糖或由非交联低分子量阳离子多糖所制成的交联阳离子多糖，其中非交联低分子量阳离子多糖具有例如约100,000Da、约200,000Da、约300,000Da、约400,000Da、约500,000Da、约600,000Da、约700,000Da、约800,000Da、或约900,000Da的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联低分子量阳离子多糖具有例如最多100,000Da、最多200,000Da、最多300,000Da、最多400,000Da、最多500,000Da、最多600,000Da、最多700,000Da、最多800,000Da、最多900,000Da、或最多950,000的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联低分子量阳离子多糖具有例如约100,000Da至约500,000Da、约200,000Da至约500,000Da、约300,000Da至约500,000Da、约400,000Da至约500,000Da、约500,000Da至约950,000Da、约600,000Da至约950,000Da、约700,000Da至约950,000Da、约800,000Da至约950,000Da、约300,000Da至约600,000Da、约300,000Da至约700,000Da、约300,000Da至约800,000Da、或约400,000Da至约700,000Da的平均分子量。

在另一个实施方案中，组合物包含非交联高分子量阳离子多糖或由非交联高分子量阳离子多糖所制成的交联阳离子多糖，其中非交联高分子量阳离子多糖具有例如约1,000,000Da、约1,500,000Da、约2,000,000Da、约2,500,000Da、约3,000,000Da、约3,500,000Da、约4,000,000Da、约4,500,000Da、或约5,000,000Da的平均分子量。在该实施方案的其他方面，非交联高分子量阳离子多糖具有例如至少1,000,000Da、至少1,500,000Da、至少2,000,000Da、至少2,500,000Da、至少3,000,000Da、至少3,500,000Da、至少4,000,000Da、至少4,500,000Da、或至少5,000,000Da的平均分子量。在该实施方案的另一些方面，非交联高分子量阳离子多糖具有例如约1,000,000Da至约5,000,000Da、约1,500,000Da至约5,000,000Da、约2,000,000Da至约5,000,000Da、约2,500,000Da至约5,000,000Da、约2,000,000Da至约3,000,000Da、约2,500,000Da至约3,500,000Da、或约2,000,000Da至约4,000,000Da的平均分子量。在另一些方面，非交联高分子量阳离子多糖具有例如大于2,000,000Da且小于约3,000,000Da、大于2,000,000Da且小于约3,500,000Da、大于2,000,000Da且小于约4,000,000Da、大于2,000,000Da且小于约4,500,000Da、大于2,000,000Da且小于约5,000,000Da的平均分子量。

在另一个实施方案中，真皮填充剂包含各种比率的高分子量阳离子多糖与低分子量阳离子多糖的组合。在该实施方案的一些方面中，真皮填充剂包含比率为约20∶1、约15∶1、约10∶1、约5∶1、约1∶1、约1∶5、约1∶10、约1∶15、或约1∶20的高分子量阳离子多糖和低分子量阳离子多糖的组合。在一些实施方案中，高分子量阳离子多糖与低分子量阳离子多糖以前述比率交联。

本文所公开的真皮填充剂组合物或凝聚层HA水凝胶还可包含当组合物施用于个体时提供有益效果的另一种试剂或试剂的组合。此类有益剂包括但不限于美容剂或其他成分。此类有益剂的非限制性示例包括抗氧化剂、止痒剂、抗蜂窝炎剂、抗瘢痕剂、抗炎剂、麻醉剂、抗刺激剂、脱皮剂、张紧剂、抗痤疮剂、亮肤剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、保湿剂、或维生素。在一些实施方案中，试剂被添加并捕集在凝聚层内而不改变试剂，因此提供了缓慢释放并递送试剂的方式。该方法的显著优点在于其掺入有益剂而不使其交联至凝聚层HA凝胶复合物，使得这些组分能够以其天然态被捕集，具有由HA凝聚层凝胶的密度、扩散率、降解率和/或流变性所控制的受调节的释放率。在一些实施方案中，试剂与凝聚层HA水凝胶的一种或多种多糖形成离子或静电相互作用。在一些实施方案中，试剂的释放由试剂与一种或多种凝聚层HA多糖之间的离子或静电相互作用所控制。在另一个实施方案中，凝聚层HA复合物被调节成用于较快或较慢地释放试剂；例如，凝聚层HA复合物的多糖的数量、种类和/或pKa值能够被调节成用于较快或较慢地释放试剂。释放特征可为数天、或数周、或数月，或甚至更久以实现期望的有益效果。

本说明书的一些方面部分地提供了可任选地包含麻醉剂或其盐的真皮填充剂组合物。麻醉剂优选地为局部麻醉剂，即致使可逆局部麻醉并丧失伤害性感受的麻醉剂，诸如例如氨基酰胺局部麻醉剂和氨基酯局部麻醉剂。本文所公开的组合物中所包含的麻醉剂的量是施用真皮填充剂组合物时有效地减轻个体所发生的疼痛的量。因此，本说明书中所公开的真皮填充剂组合物中所含的麻醉剂的量为总组合物的约0.1重量％至约5重量％。麻醉剂的非限制性示例包括利多卡因、氨布卡因、阿莫拉酮、阿米洛卡因、丁氧普鲁卡因、苯佐卡因、贝托卡因、珍尼柳酯、布比卡因、布他卡因、氨苯丁酯、布坦卡因、莫诺卡因、butoxycaine、卡替卡因、氯普鲁卡因、乙基苯酰芽子碱、可卡因、环美卡因、地布卡因、dimethysoquin、二甲卡因、地哌冬、dycyclonine、芽子定、芽子碱、氯乙烷、依替卡因、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、formocaine、海克卡因、羟丁卡因、对胺苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因、左沙屈尔、利多卡因、马比佛卡因、美普卡因、美布卡因、氯甲烷、麦替卡因、纳依卡因、奥他卡因、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、芬那卡因、石炭酸、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、普莫卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、psuedococaine、吡咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏、它们的组合、以及它们的盐。芽子碱、氯乙烷、依替卡因、β-优卡因、尤普罗辛、非那可明、formocaine、海克卡因、羟丁卡因、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮氨卡因、左沙屈尔、利多卡因、马比佛卡因、美普卡因、美布卡因、氯甲烷、麦替卡因、纳依卡因、奥他卡因、奥索卡因、奥昔卡因、对乙氧卡因、芬那卡因、石炭酸、哌罗卡因、匹多卡因、聚多卡醇、普莫卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、丙泮卡因、丙美卡因、丙哌卡因、丙氧卡因、psuedococaine、吡咯卡因、罗哌卡因、水杨醇、丁卡因、托利卡因、三甲卡因、佐拉敏、它们的组合、以及它们的盐。氨基酯局部麻醉剂的非限制性示例包括普鲁卡因、氯普鲁卡因、可卡因、环美卡因、cimethocaine(拉罗卡因)、丙氧卡因、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙美卡因、丁卡因(阿美索卡因)。氨基酰胺局部麻醉剂的非限制性示例包括阿替卡因、布比卡因、辛可卡因(狄布卡因)、依替卡因、左布比卡因、利多卡因(利诺卡因)、马比佛卡因、哌罗卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、以及三甲卡因。本文所公开的组合物可包含单一麻醉剂或多种麻醉剂。组合局部麻醉剂的非限制性示例是利多卡因/丙胺卡因(EMLA)。

在该实施方案的其他方面，本文所公开的真皮填充剂组合物包含按总组合物的重量计例如约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约2.0％、约3.0％、约4.0％、约5.0％、约6.0％、约7.0％、约8.0％、约9.0％，或约10％的量的麻醉剂。在另一些方面，本文所公开的组合物包含按总组合物的重量计例如至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少2.0％、至少3.0％、至少4.0％、至少5.0％、至少6.0％、至少7.0％、至少8.0％、至少9.0％、或至少10％的量的麻醉剂。在另一些方面，本文所公开的真皮填充剂组合物包含按总组合物的重量计例如最多0.1％、最多0.2％、最多0.3％、最多0.4％、最多0.5％、最多0.6％、最多0.7％、最多0.8％、最多0.9％、最多1.0％、最多2.0％、最多3.0％、最多4.0％、最多5.0％、最多6.0％、最多7.0％、最多8.0％、最多9.0％、或最多10％的量的麻醉剂。在另一方面，本文所公开的真皮填充剂组合物包含按总组合物的重量计例如约0.1％至约0.5％、约0.1％至约1.0％、约0.1％至约2.0％、约0.1％至约3.0％、约0.1％至约4.0％、约0.1％至约5.0％、约0.2％至约0.9％、约0.2％至约1.0％、约0.2％至约2.0％、约0.5％至约1.0％、或约0.5％至约2.0％的量的麻醉剂。

在另一个实施方案中，本文所公开的真皮填充剂不包含麻醉剂。

本说明书的一些方面部分地提供了表现出复数模量、弹性模量、粘性模量和/或tanδ的凝聚层HA水凝胶组合物。如本文所公开的组合物的粘弹性在于，当施加力(应力，变形)时组合物具有弹性组分(类似于固体，诸如例如交联阴离子或阳离子HA多糖)和粘性组分(类似于液体，诸如例如非交联HA多糖或载体相)。描述该特性的流变学属性是复数模量(G*)，其定义了组合物的总抗变形性。复数模量是具有实部和虚部的复数：G*＝G′+iG″。G*的绝对值是Abs(G*)＝Sqrt(G′2+G″2)。复数模量可定义为弹性模量(G′)与粘性模量(G″)之和。Falcone等人，Temporary Polysaccharide Dermal Fillers：A Model forPersistence Based on Physical Properties，Dermatol Surg.35(8)：1238-1243(2009)，该文献全文以引用方式并入本文。

弹性模量或弹性模数是指水凝胶材料的抗变形能力，或相反地，当向对象施加力时对象的非永久性变形的趋势。弹性模量的特征为组合物的坚实度并且也称为储能模量，因为其描述了从组合物的运动存储的能量。弹性模量描述了弹性与强度之间的相互作用(G′＝应力/应变)，并因此提供了组合物的硬度或柔度的定量测量。对象的弹性模量定义为弹性变形区域内其应力-应变曲线的斜率：λ＝应力/应变，其中λ是以帕斯卡计的弹性模量；应力是致使变形的力除以施加力的面积；并且应变是应力引起的改变与对象初始状态之比。尽管依赖于施加力的速度，较刚硬组合物将具有较高的弹性模量并且其将耗费较大的力使材料变形给定的距离，诸如例如注射。指定应力如何测量(包括方向)允许限定多种类型的弹性模量。三种主要的弹性模量为拉伸模量、剪切模量和体弹性模量。

粘性模量也称为损耗模量，因为其描述了作为粘性耗散损失的能量。Tan δ是粘性模量与弹性模量的比率，tanδ＝G″/G′。Falcone，同上，2009。对于本说明书所公开的tanδ值，tanδ获自于1Hz频率下的动态模量。较低tanδ对应于较刚硬、较坚硬、或更具弹性的组合物。

在另一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物表现出例如约25Pa、约50Pa、约75Pa、约100Pa、约125Pa、约150Pa、约175Pa、约200Pa、约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约450Pa、约500Pa、约550Pa、约600Pa、约650Pa、约700Pa、约750Pa、约800Pa、约850Pa、约900Pa、约950Pa、约1,000Pa、约1,200Pa、约1,300Pa、约1,400Pa、约1450Pa、约1,500Pa、约1,600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2,000Pa、约2,100Pa、约2,200Pa、约2,300Pa、约2,400Pa、约2,500Pa、约3000Pa、约4000Pa、约5000Pa、约6000Pa、约7000Pa、约8000Pa、约9000Pa、或约10,000Pa的弹性模量。在该实施方案的其他方面，水凝胶组合物表现出例如至少25Pa、至少50Pa、至少75Pa、至少100Pa、至少125Pa、至少150Pa、至少175Pa、至少200Pa、至少250Pa、至少300Pa、至少350Pa、至少400Pa、至少450Pa、至少500Pa、至少550Pa、至少600Pa、至少650Pa、至少700Pa、至少750Pa、至少800Pa、至少850Pa、至少900Pa、至少950Pa、至少1,000Pa、至少1,200Pa、至少1,300Pa、至少1,400Pa、至少1,500Pa、至少1,600Pa、至少1700Pa、至少1800Pa、至少1900Pa、至少2,000Pa、至少2,100Pa、至少2,200Pa、至少2,300Pa、至少2,400Pa、或至少2,500Pa的弹性模量。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合物表现出例如最多25Pa、最多50Pa、最多75Pa、最多100Pa、最多125Pa、最多150Pa、最多175Pa、最多200Pa、最多250Pa、最多300Pa、最多350Pa、最多400Pa、最多450Pa、最多500Pa、最多550Pa、最多600Pa、最多650Pa、最多700Pa、最多750Pa、最多800Pa、最多850Pa、最多900Pa、最多950Pa、最多1,000Pa、最多1,200Pa、最多1,300Pa、最多1,400Pa、最多1,500Pa、或最多1,600Pa的弹性模量。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合物表现出例如约25Pa至约150Pa、约25Pa至约300Pa、约25Pa至约500Pa、约25Pa至约800Pa、约125Pa至约300Pa、约125Pa至约500Pa、约125Pa至约800Pa、约400Pa至约1,600Pa、约500Pa至约1,600Pa、约600Pa至约1,600Pa、约700Pa至约1,600Pa、约800Pa至约1,600Pa、约900Pa至约1,600Pa、约1,000Pa至约1,600Pa、约1,100Pa至约1,600Pa、约1,200Pa至约1,600Pa、约500Pa至约2,500Pa、约1,000Pa至约2,500Pa、约1,500Pa至约2,500Pa、约2,000Pa至约2,500Pa、约1,300Pa至约1,600Pa、约1,400Pa至约1,700Pa、约1,500Pa至约1,800Pa、约1,600Pa至约1,900Pa、约1,700Pa至约2,000Pa、约1,800Pa至约2,100Pa、约1,900Pa至约2,200Pa、约2,000Pa至约2,300Pa、约2,100Pa至约2,400Pa、或约2,200Pa至约2,500Pa的弹性模量。在另一些方面，提供了表现出例如约50Pa至约5,000Pa、约100Pa至约5,000Pa、约100Pa至约4,000Pa、约100Pa至约3,000Pa、约100Pa至约2,000Pa，或约100Pa至约1,000Pa、或约500Pa的弹性模量的水凝胶组合物。在另一些方面，提供了表现出例如约20Pa至约3,000Pa、约20Pa至约2,000Pa、约20Pa至约1,000Pa、约50Pa至约3,000Pa、约50Pa至约2,000Pa，或约50Pa至约1,000Pa的弹性模量的水凝胶组合物。

在另一个实施方案中，本文所公开的水凝胶组合物表现出例如至少约500Pa的高弹性模量(高储能模量(G′))。

在另一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物表现出粘性模量。在该实施方案的一些方面，水凝胶组合物表现出例如约10Pa、约20Pa、约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约150Pa、约200Pa、约250Pa、约300Pa、约350Pa、约400Pa、约450Pa、约500Pa、约550Pa、约600Pa、约650Pa、或约700Pa的粘性模量。在该实施方案的其他方面，水凝胶组合物表现出例如最多10Pa、最多20Pa、最多30Pa、最多40Pa、最多50Pa、最多60Pa、最多70Pa、最多80Pa、最多90Pa、最多100Pa、最多150Pa、最多200Pa、最多250Pa、最多300Pa、最多350Pa、最多400Pa、最多450Pa、最多500Pa、最多550Pa、最多600Pa、最多650Pa、或最多700Pa的粘性模量。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合表现出例如约10Pa至约30Pa、约10Pa至约50Pa、约10Pa至约100Pa、约10Pa至约150Pa、约70Pa至约100Pa、约50Pa至约350Pa、约150Pa至约450Pa、约250Pa至约550Pa、约350Pa至约700Pa、约50Pa至约150Pa、约100Pa至约200Pa、约150Pa至约250Pa、约200Pa至约300Pa、约250Pa至约350Pa、约300Pa至约400Pa、约350Pa至约450Pa、约400Pa至约500Pa、约450Pa至约550Pa、约500Pa至约600Pa、约550Pa至约650Pa、或约600Pa至约700Pa的粘性模量。

在另一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物表现出一定的tanδ。在该实施方案的一些方面，水凝胶组合物表现出例如约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、或约2.5的tanδ。在该实施方案的其他方面，水凝胶组合物表现出例如最多0.1、最多0.2、最多0.3、最多0.4、最多0.5、最多0.6、最多0.7、最多0.8、最多0.9、最多1.0、最多1.1、最多1.2、最多1.3、最多1.4、最多1.5、最多1.6、最多1.7、最多1.8、最多1.9、最多2.0、最多2.1、最多2.2、最多2.3、最多2.4、或最多2.5的tanδ。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合物表现出例如约0.1至约0.3、约0.3至约0.5、约0.5至约0.8、约1.1至约1.4、约1.4至约1.7、约0.3至约0.6、约0.1至约0.5、约0.5至约0.9、约0.1至约0.6、约0.1至约1.0、约0.5至约1.5、约1.0至约2.0、或约1.5至约2.5的tanδ。

本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物还可通过将水凝胶粉碎成颗粒并任选地与载体相诸如药学上可接受的载体诸如例如水、盐水溶液(包括PBS)、甘油和/或非交联HA混合来进一步处理，以形成可注射或局部物质，如溶液、油、洗剂、凝胶、软膏剂、霜剂、浆液、油膏剂或糊剂。因此，所公开的凝聚层HA水凝胶组合物可为单相或多相组合物。凝聚层HA水凝胶能够被研磨至直径为约10μm至约1000μm，诸如约15μm至约30μm、约50μm至约75μm、约100μm至约150μm、约200μm至约300μm、约450μm至约550μm、约600μm至约700μm、约750μm至约850μm、或约900μm至约1,000μm的粒径。颗粒可通过精细多孔筛网经由均化或筛分来进一步处理。

本说明书的一些方面部分地提供了可注射的本文所公开的组合物。如本文所用，术语“可注射”是指具有使用带有针诸如细针的注射装置，将组合物施用到个体的皮肤或其他软组织中所需的特性的材料。如本文所用，术语“细针”是指27号或更高规格的针(其中较高规格指示较小的外径)。本文所公开的组合物的注射能力可通过对如上所讨论的水凝胶颗粒筛分来实现。在一些实施方案中，可实现本文所公开的组合物的注射能力而无需通过精细多孔筛网经由均化或筛分来进一步处理水凝胶。

在该实施方案的方面中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物可通过细针注射。在该实施方案的其他方面，本文所公开的水凝胶组合物可通过例如18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号、25号、26号、27号、28号、29号、30号、31号或32号针注射。在该实施方案的另一些方面，本文所公开的水凝胶组合物可通过例如至少21号、至少25号、至少27号、至少30号、或至少32号针注射。在该实施方案的另一些方面，本文所公开的水凝胶组合物可通过例如18号至35号、18号至25号、21号至35号、21号至34号、21号至33号、21号至32号、21号至27号、或27号至32号针注射。

在该实施方案的一些方面，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物可采用约60N、约55N、约50N、约45N、约40N、约35N、约30N、约25N、约20N、或约15N的挤压力以100mm/min的速度注射。在该实施方案的其他方面，本文所公开的水凝胶组合物可采用约60N或更小、约55N或更小、约50N或更小、约45N或更小、约40N或更小、约35N或更小、约30N或更小、约25N或更小、约20N或更小、约15N或更小、约10N或更小、或约5N或更小的挤压力通过27号针注射。在该实施方案的另一些方面，本文所公开的水凝胶组合物可采用约60N或更小、约55N或更小、约50N或更小、约45N或更小、约40N或更小、约35N或更小、约30N或更小、约25N或更小、约20N或更小、约15N或更小、约10N或更小、或约5N或更小的挤压力通过30号针注射。在该实施方案的另一些方面，本文所公开的水凝胶组合物可采用约60N或更小、约55N或更小、约50N或更小、约45N或更小、约40N或更小、约35N或更小、约30N或更小、约25N或更小、约20N或更小、约15N或更小、约10N或更小、或约5N或更小的挤压力通过32号针注射。

本发明的一些方面部分地提供了表现出粘结性的本文所公开的水凝胶组合物。粘结性(也称为内聚引力、内聚力或压缩力)是材料的物理特性，由用于结合分子的材料内的类似分子之间的分子间引力引起。粘结性以克-力(gmf)表示。除其他因素外，粘结性还受到初始游离HA多糖的分子量比例、HA多糖的交联度、交联后残余的游离HA多糖的量、以及水凝胶组合物的pH的影响。组合物应当有足够粘结力以便保持位于施用部位。另外，在特定应用中，足够的粘结性对组合物在机械负荷循环事件中保持其形状并因此保持功能性而言很重要。因此，在一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物表现与水同等的粘结性。在另一个实施方案中，本文所公开的水凝胶组合物表现出足以保持定位于施用部位的粘结性。在另一个实施方案中，本文所公开的水凝胶组合物表现出足以保持其形状的粘结性。在另一个实施方案中，本文所公开的水凝胶组合物表现出足以保持其形状和功能性的粘结性。

本说明书的一些方面部分地提供了表现出生理上可接受的同渗容摩的本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物。如本文所用，术语“同渗容摩”是指溶液中渗透活性溶质的浓度。如本文所用，术语“生理可接受的同渗容摩”是指根据活生物体的正常机能或其特征的同渗容摩。因此，所施用的如本文所公开的水凝胶组合物表现出施用于哺乳动物时基本不具有长期或永久性有害效应的同渗容摩。同渗容摩以每升溶剂的渗透活性溶质的渗摩(Osmol/L或Osm/L)表示。同渗容摩不同于摩尔浓度，因为其度量渗透活性溶质颗粒的摩尔数而非溶质的摩尔数。该差别的产生是因为一些化合物可在溶液中解离，而其他不能。溶液的同渗容摩可由以下表达来计算：其中是渗透系数，其说明了溶液的非理想程度；η是分子解离成的微粒(例如离子)的数量；并且C是溶质的摩尔浓度；并且i是表示特定溶质的种类的指数。本文所公开的水凝胶组合物的同渗容摩可用测量溶液的常规方法进行测量。

在一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物表现出生理可接受的同渗容摩。在该实施方案的一些方面，水凝胶组合物表现出例如约100mOsm/L、约150mOsm/L、约200mOsm/L、约250mOsm/L、约300mOsm/L、约350mOsm/L、约400mOsm/L、约450mOsm/L，或约500mOsm/L的同渗容摩。在该实施方案的其他方面，水凝胶组合物表现出例如至少100mOsm/L、至少150mOsm/L、至少200mOsm/L、至少250mOsm/L、至少300mOsm/L、至少350mOsm/L、至少400mOsm/L、至少450mOsm/L、或至少500mOsm/L的同渗容摩。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合物表现出例如最多100mOsm/L、最多150mOsm/L、最多200mOsm/L、最多250mOsm/L、最多300mOsm/L、最多350mOsm/L、最多400mOsm/L、最多450mOsm/L、或最多500mOsm/L的同渗容摩。在该实施方案的另一些方面，水凝胶组合物表现出例如约100mOsm/L至约500mOsm/L、约200mOsm/L至约500mOsm/L、约200mOsm/L至约400mOsm/L、约300mOsm/L至约400mOsm/L、约270mOsm/L至约390mOsm/L、约225mOsm/L至约350mOsm/L、约250mOsm/L至约325mOsm/L、约275mOsm/L至约300mOsm/L、或约285mOsm/L至约290mOsm/L的同渗容摩。

本发明的一些方面部分地提供了表现出基本稳定性的本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物。在提及本文所公开的水凝胶组合物时，如本文所用，术语“稳定性”或“稳定”是指在施用给个体之前存储时不易于以任何实质或显著程度降解、分解、或裂解的组合物。如本文所用，术语“基本热稳定性”、“基本上热稳定”、“高压釜稳定”、或“蒸气灭菌稳定”是指当经受如本文所公开的热处理时基本上稳定的本文所公开的水凝胶组合物。

本文所公开的水凝胶组合物(包括还包含本文所公开的任何试剂或添加剂的水凝胶组合物)的稳定性可通过使水凝胶组合物经受热处理，诸如在常压下或压力下(例如高压灭菌)蒸汽灭菌进行测定。优选地热处理在至少约100℃的温度下进行约1分钟至约10分钟。本文所公开的水凝胶组合物的基本稳定性可通过如下方式评价：1)测定灭菌后本文所公开的水凝胶组合物的挤压力(AF)的变化，其中挤压力变化小于2N指示基本稳定的水凝胶组合物，如由(具有指定试剂和/或添加剂的水凝胶组合物的挤压力)减去(未添加有试剂和/或添加剂的水凝胶组合物的挤压力)所测；和/或2)测定灭菌后本文所公开的水凝胶组合物的流变性的变化，其中tanδ1Hz变化小于0.1指示基本稳定的水凝胶组合物，如由(具有试剂和/或添加剂的凝胶制剂的tanδ1Hz)减去(不具有试剂和/或添加剂的凝胶制剂的tanδ1Hz)所测。因此，本文所公开的基本稳定的水凝胶组合物在灭菌后保持以下特征中的一者或多者：均质性、挤压力、粘结性、阴离子HA浓度、阳离子多糖浓度、试剂或添加剂浓度、同渗容摩、pH、或热处理前水凝胶所需的其他流变特性。

在一个实施方案中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶采用保持本文所公开的期望水凝胶特性的热处理进行处理。在该实施方案的方面中，本文所公开的凝聚层HA水凝胶利用例如约100℃、约105℃、约110℃、约115℃、约120℃、约125℃，或约130℃的热处理进行处理。在该实施方案的其他方面，本文所公开的凝聚层HA水凝胶利用例如至少100℃、至少105℃、至少110℃、至少115℃、至少120℃、至少125℃、或至少130℃的热处理进行处理。在该实施方案的另一些方面，本文所公开的凝聚层HA水凝胶利用例如约100℃至约120℃、约100℃至约125℃、约100℃至约130℃、约100℃至约135℃、约110℃至约120℃、约110℃至约125℃、约110℃至约130℃、约110℃至约135℃、约120℃至约125℃、约120℃至约130℃、约120℃至约135℃、约125℃至约130℃、或约125℃至约135℃的热处理进行处理。

本文所公开的水凝胶组合物的长期稳定性可通过使凝聚层HA水凝胶经受热处理，诸如例如在约45℃环境下储存约60天来测定。本文所公开的凝聚层HA水凝胶的长期稳定性可通过如下方式评价：1)评估水凝胶组合物在45℃热处理后的透明度和颜色，并且透明和未着色水凝胶组合物指示基本上稳定的水凝胶组合物；2)测定本文所公开的凝聚层HA水凝胶在45℃热处理后的挤压力(AF)的变化，其中挤压力的变化小于2N指示基本稳定的凝聚层HA水凝胶组合物，如由(水凝胶组合物在45℃热处理之前的挤压力)减去(水凝胶组合物在45℃热处理之后的挤压力)所测；和/或3)测定本文所公开的凝聚层HA水凝胶在灭菌之后的流变性的变化，其中tanδ1Hz的变化小于0.1指示基本稳定的凝聚层HA水凝胶组合物，如由(凝胶制剂在45℃热处理之前的tanδ1Hz)减去(凝胶制剂在45℃热处理之后的tanδ1Hz)所测。因此，本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物的长期稳定性通过45℃热处理后以下特征中一者或多者的保持进行评价：透明度(透明性和半透明性)、均质性和粘结性。

在该实施方案的一些方面，凝聚层HA水凝胶组合物在室温下例如约3个月、约6个月、约9个月、约12个月、约15个月、约18个月、约21个月、约24个月、约27个月、约30个月、约33个月、或约36个月内基本稳定。在该实施方案的其他方面，凝聚层HA水凝胶组合物在室温下例如至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少21个月、至少24个月、至少27个月、至少30个月、至少33个月、或至少36个月内基本稳定。在该实施方案的其他方面，凝聚层HA水凝胶组合物在室温下例如约3个月至约12个月、约3个月至约18个月、约3个月至约24个月、约3个月至约30个月、约3个月至约36个月、约6个月至约12个月、约6个月至约18个月、约6个月至约24个月、约6个月至约30个月、约6个月至约36个月、约9个月至约12个月、约9个月至约18个月、约9个月至约24个月、约9个月至约30个月、约9个月至约36个月、约12个月至约18个月、约12个月至约24个月、约12个月至约30个月、约12个月至约36个月、约18个月至约24个月、约18个月至约30个月、或约18个月至约36个月内基本稳定。

本说明书的一些方面部分地提供了本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物，即药学上可接受的组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指在施用给个体时不产生副反应、过敏反应或其他不利反应或不需要的反应的任何分子实体或组合物。药学上可接受的凝聚层HA水凝胶组合物可用于医学和兽医应用。药学上可接受的凝聚层HA水凝胶组合物可单独或与其他补充活性成分、试剂、药物或激素联合施用给个体。如本文所用，“药学上可接受的”和“生理上可接受的”可互换使用。

本说明书的方面部分地提供了包含药理学上可接受的赋形剂的如本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物。如本文所用，术语“药理学上可接受的赋形剂”与“药理学赋形剂”或“赋形剂”同义，并且是指当施用于哺乳动物时大体上不具有长期或永久有害效应的任何赋形剂，并且涵盖化合物诸如例如稳定剂、膨松剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、添加剂、载体、溶媒、稀释剂或辅助剂。赋形剂通常与活性成分混合，或允许稀释或包封活性成分，并且可以是固体、半固体或液体剂。还设想如本文所公开的药物组合物可包含有利于将活性成分加工成药学上可接受的组合物的一种或多种药学上可接受的赋形剂。只要任何药理学上可接受的赋形剂与活性成分不相容，就可设想其在药学上可接受的组合物中的用途。药理学上可接受的赋形剂(包括载体)的非限制性示例可见于：例如，Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(Howard C.Ansel等人合编，Lippincott Williams&Wilkins Publishers，第7版，1999年)；Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Alfonso R.Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版，2000年)；Goodman&Gilman，The Pharmacological Basis of Therapeutics(Joel G.Hardman等人合编，McGraw-Hill Professional，第10版，2001年)；以及Handbook of PharmaceuticalExcipients(Raymond C.Rowe等人，APhA Publications，第4版，2003年)，这些文献中的每一者均据此全文以引用方式并入。

如本文所用，“载体”和“可接受的载体”可互换使用并且指能与当前公开的水凝胶组合的载体，从而提供期望的组合物。本领域的普通技术人员将认识到公知用于制备特定化妆品组合物的多种载体。生理上和/或药学上可接受的载体包括但不限于盐水溶液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、甘油和非交联HA。

还设想本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物可任选地包含但不限于其他药学上可接受的组分，包括但不限于缓冲剂、载体、防腐剂、张力调节剂、盐、抗氧化剂、渗透度调节剂、乳化剂、润湿剂等。

药学上可接受的缓冲液是可用于制备本文所公开的水凝胶组合物的缓冲液，前提条件是所得的制剂是药学上可接受的。药学上可接受的缓冲液的非限制性示例包括醋酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、以及磷酸盐缓冲盐水。生理上可接受的缓冲液的浓度的非限制性示例出现在约0.1mM至约900mM范围内。可对药学上可接受的缓冲液的pH进行调节，前提条件是所得的制剂是药学上可接受的。应当理解，酸或碱可用于根据需要调节药物组合物的pH。生理上可接受的pH的非限制性示例出现在约pH5.0至约pH8.5范围内。例如，本文所公开的水凝胶组合物的pH可为约5.0至约8.0，或约6.5至约7.5、约7.0至约7.4，或约7.1至约7.3。

药学上可接受的防腐剂包括但不限于焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。药学上可接受的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯代丁醇、乙基汞硫代水杨酸钠、乙酸苯汞、硝酸苯汞、稳定化氧氯组合物，诸如例如(Allergan，Inc.Irvine，CA)以及螯合剂，诸如例如DTPA或DTPA-双酰胺、钙DTPA和CaNaDTPA-双酰胺。

可用于本文所公开的凝聚层HA水凝胶组合物的药学上可接受的张力调节剂包括但不限于盐诸如，例如氯化钠和氯化钾；以及甘油。组合物可提供为盐，并且可采用多种酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。相比于对应的游离碱形式，盐趋于更溶于水性或其他质子性溶剂。应当理解，药理学领域已知的这些及其他物质可包括在本文所公开的药物组合物中。药理学上可接受的组分的其他非限制性示例可见于例如Ansel，同上，(1999年)；Gennaro，同上，(2000年)；Hardman，同上，(2001年)；以及Rowe，同上，(2003年)，这些专利中的每一个均据此全文以引用方式并入本文。

本发明还提供了制备凝聚层HA水凝胶的一般方法。在一些实施方案中，该方法包括形成复合物，该复合物在阴离子HA离子与阳离子多糖离子之间包括离子键相互作用。

本发明还提供了制备具有不同流变学特性的凝聚层HA水凝胶的方法，其可基于阴离子HA和阳离子多糖各自相应的阴离子和/或阳离子的数量、种类和/或pKa值形成。

在一些实施方案中，水凝胶通过非交联阴离子HA与阳离子多糖之间的离子相互作用形成，阴离子HA具有阴离子，包括但不限于羧酸根、磺酸根和/或膦酸根；阳离子多糖具有阳离子，包括但不限于伯铵、季铵和/或胍鎓。

在其他实施方案中，水凝胶通过交联阴离子HA与阳离子多糖之间的离子相互作用形成，阴离子HA具有阴离子，包括但不限于羧酸根、磺酸根和/或膦酸根；阳离子多糖具有阳离子，包括但不限于伯铵、季铵和/或胍鎓。在一些实施方案中，阳离子多糖充当粘结剂以改善交联阴离子HA凝胶的粘结性。

在一些实施方案中，水凝胶通过在同阴离子HA与同阳离子多糖之间形成离子复合物而制备。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA。在一些实施方案中，同阳离子多糖是阳离子HA。在一些实施方案中，同阳离子多糖是壳聚糖。在另一个实施方案中，同阳离子多糖是三甲基壳聚糖。

在一些实施方案中，水凝胶通过在同阴离子HA与杂阳离子多糖之间形成离子复合物而制备。在一些实施方案中，同阴离子HA是HA。

在一些实施方案中，水凝胶通过在杂阴离子HA与同阳离子多糖之间形成离子复合物而制备。在一些实施方案中，同阳离子HA是阳离子HA。在其他实施方案中，同阳离子多糖是壳聚糖。在另一个实施方案中，同阳离子多糖是三甲基壳聚糖。

在一些实施方案中，水凝胶通过在杂阴离子HA与杂阳离子多糖之间形成离子复合物而制备。

形成本发明的水凝胶的方法的非限制性实施方案包括在阴离子多糖与阳离子多糖之间形成离子复合物，其中阴离子多糖选自表1的阴离子多糖实施方案，并且阳离子多糖选自表1的阳离子多糖实施方案，而关于阴离子多糖与阳离子多糖的组合不受限制。

在一个实施方案中，提供了制备包含非交联HA和非交联阳离子HA的水凝胶的方法，其中该方法包括使每种多糖单独地水合，例如通过使各自溶解于磷酸盐缓冲盐水中；然后使水合HA与水合阳离子HA以不同电荷比(例如约1∶20至约20∶1)混合，直至实现凝聚层凝胶。任选地，应用离心来去除过量的水。

在另一个实施方案中，提供了制备包含交联HA和非交联阳离子多糖(诸如含有胍鎓阳离子基团的非交联阳离子HA)的水凝胶的方法，该方法包括使交联HA与1重量％的含有胍鎓阳离子基团的非交联阳离子HA在缓冲液(例如pH7.5PBS缓冲液)中以约1∶10至约50∶1的不同电荷比(-COOH/胍鎓)混合，直至实现凝聚层凝胶。

在另一个实施方案中，提供了制备包含交联HA和壳聚糖的水凝胶的方法，该方法包括提供水合交联HA(即HA凝胶，诸如JUP)；提供高纯度壳聚糖(HPC)；使HPC溶解于酸性水溶液中；对含有HPC的酸性水溶液任选地进行蒸汽灭菌；用水稀释所得的溶液(例如，以实现0.4mg/ml至1.9mg/ml范围内的HPC浓度)；以及使经稀释HPC溶液与水合交联HA进行混合，以实现包含交联HA和壳聚糖的凝聚层水凝胶。

在其他方面，本发明的水凝胶通过使约0.01摩尔当量至约1摩尔当量的阳离子多糖与约1摩尔当量的阴离子多糖混合来制备。在另一些方面，使约0.02摩尔当量至约0.5摩尔当量的阳离子多糖与1摩尔当量的阴离子多糖混合。在另一些方面，使约0.04摩尔当量至约0.2摩尔当量的阳离子多糖与约1摩尔当量的阴离子多糖混合。优选地，阴离子多糖是HA。更优选地，阴离子多糖是交联HA，且阳离子多糖是壳聚糖。

本说明书的一些方面部分地提供了通过施用本文所公开的真皮填充剂组合物来处理个体的软组织状况的方法。

如本文所用，“软组织”是指围绕、支持、或连接身体的其他结构或器官的组织。软组织的非限制性示例包括结缔组织，诸如皮肤、纤维组织、脂肪、筋膜、肌腱、韧带和滑膜。软组织也可包括非结缔组织，诸如神经、肌肉和血管。

如本文所用，术语“处理”是指加强软组织强度，改善软组织质量，或减少软组织缺陷；或者减少或消除个体中以软组织瑕疵和/或缺陷为特征的软组织状况的美容症状；或者延迟或防止个体中以软组织瑕疵和/或缺陷为特征的状况的美容症状的发作。例如，术语“处理”可意指以软组织缺陷为特征的状况的症状减少例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。本文所公开的真皮填充剂组合物在处理以软组织质量和/或缺陷为特征的状况中的效果可通过观察与该状况相关的一种或多种美容和/或生理指标进行测定。软组织质量和/或缺陷障碍中软组织加强或改善的效果还可通过对协同治疗需要的减少来指示。本领域的技术人员将知道与特定软组织缺陷相关的适当症状或指标，并且将知道如何确定个体是否为用本文所公开的组合物处理的候选。

在特定方面，该方法包括将包含凝聚层HA水凝胶的本发明真皮填充剂施用到受试者的软组织或皮肤内不大于约1mm的深度处。在一些实施方案中，将组合物浅表地注射，即深度不大于约0.8mm、不大于约0.6mm、或不大于约0.4mm的深度处。

在另一种方面，本发明提供了改善受试者的美学外观，包括受试者的面部的方法。本发明的方法通常包括将包含凝聚层HA水凝胶的真皮填充剂施用到受试者的软组织或皮肤(诸如受试者的面部)中的步骤。在特定方面，该方法通常包括将包含凝聚层HA水凝胶的本发明真皮填充剂施用到受试者的皮肤区域诸如真皮区域，诸如受试者的面部内不大于约1mm的深度处。在一些实施方案中，将组合物浅表地注射，即深度不大于约0.8mm、不大于约0.6mm、或不大于约0.4mm的深度处。

将水凝胶组合物施用于个体。个体在本文也称为受试者或患者，通常为任何年龄、性别或种族的人类。通常，作为处理软组织状况的常规规程的候选的任何个体是用于本文所公开方法的候选。虽然经历皮肤老化迹象的受试者是成人，但经历过早老化或适于处理的其他皮肤状况(例如疤痕)的受试者也可用本文所公开的水凝胶组合物进行处理。此外，当前所公开的水凝胶组合物和方法可应用于个体，以探索身体部分或区域的较小/中度增大、形状改变或轮廓变化，这可能对现有软组织植入技术在技术上不可行或者美学上不可接受。除公开所有相关风险和手术效果的全面知情同意之外，术前评估通常还包括常规病史和体格检查。

本文所公开的水凝胶组合物和方法可用于处理软组织状况。软组织状况包括但不限于软组织瑕疵和/或缺陷。软组织状况的非限制性示例包括面部瑕疵和/或缺陷，诸如例如面部充填、面容重建、美索疗法、帕罗综合征、深在性红斑狼疮、皮肤凹陷、疤痕、双颊凹陷、薄唇、鼻部瑕疵或缺陷、眶后瑕疵或缺陷、面部皱褶、细纹和/或皱纹如唇瓣纹、鼻唇纹、口周纹和/或木偶纹和/或其他面部轮廓畸形或瑕疵；颈部瑕疵和/或缺陷；皮肤瑕疵和/或缺陷；其他软组织瑕疵和/或缺陷，诸如例如上臂、下臂、手、肩部、背部、躯干(包括腹腔、臀部、上腿、下腿，包括小腿、足部(包括足底脂肪垫))、眼部、生殖器、或其他身体部分、区域或区的充填或重建。如本文所用，术语“美索疗法”是指皮肤的非外科美容护理技术，涉及将所施用的试剂作为多个小滴经表皮内、真皮内和/或皮下注射到表皮、真皮-表皮交界和/或真皮中。

与本文所公开的任何方法一起使用的水凝胶组合物的量将通常基于所期望的改变和/或改善、所期望的软组织状况症状的减少和/或消除、个体和/或医师所期望的效果、以及待处理的身体部分或区域来确定。组合物施用的效果可通过以下度量中的一者或多者显现：改变和/或改善的软组织形状、改变和/或改善的软组织尺寸、改变和/或改善的软组织轮廓、改变和/或改善的组织功能、改善的患者满意度和/或生活质量，以及减少可植入外来材料的使用。

又如，组合物和方法在处理面部软组织中的效果可通过以下度量中的一者或多者显现：面部特征增大的尺寸、形状和/或轮廓，如唇、颊或眼部区域的增大的尺寸、形状和/或轮廓；面部特征的改变的尺寸、形状和/或轮廓，如唇、颊或眼部区域形状的改变的尺寸、形状和/或轮廓；皮肤的皱纹、皱褶或细纹的减少或消除；对皮肤的皱纹、皱褶或细纹的抵抗；皮肤的再水化；皮肤弹性的提高；皮肤粗糙度的减少或消除；皮肤绷紧度的提高和/或改善；萎缩纹或妊娠纹的减少或消除；皮肤色调、光泽、亮度和/或光亮度的增大和/或改善；皮肤颜色的增大和/或改善，皮肤苍白的减少或消除；患者满意度和/或生活质量的改善。

在该实施方案的一些方面，所施用的水凝胶组合物的量为例如约0.01g、约0.05g、约0.1g、约0.5g、约1g、约5g、约10g、约20g、约30g、约40g、约50g、约60g、约70g、约80g、约90g、约100g、约150g、或约200g。在该实施方案的其他方面，所施用的水凝胶组合物的量为例如约0.01g至约0.1g、约0.1g至约1g、约1g至约10g、约10g至约100g、或约50g至约200g。在该实施方案的另一些方面，所施用的水凝胶组合物的量为例如约0.01mL、约0.05mL、约0.1mL、约0.5mL、约1mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL、约30mL、约40mL、约50mL、约60mL、约70g、约80mL、约90mL、约100mL、约150mL、或约200mL。在该实施方案的其他方面，所施用的水凝胶组合物的量为例如约0.01mL至约0.1mL、约0.1mL至约1mL、约1mL至约10mL、约1mL至约20mL、约10mL至约100mL、或约50mL至约200mL。

处理持续时间通常将基于个体和/或医师所期望的效果以及待处理的身体部分或区域来确定。在该实施方案的一些方面，所施用的本文所公开的水凝胶组合物可处理软组织状况例如约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约18个月、或约24个月。在该实施方案的其他方面，所施用的本文所公开的水凝胶组合物可处理软组织状况例如至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少18个月、或至少24个月。在该实施方案的另一些方面，所施用的本文所公开的水凝胶组合物可处理软组织状况例如约6个月至约12个月、约6个月至约15个月、约6个月至约18个月、约6个月至约21个月、约6个月至约24个月、约9个月至约12个月、约9个月至约15个月、约9个月至约18个月、约9个月至约21个月、约6个月至约24个月、约12个月至约15个月、约12个月至约18个月、约12个月至约21个月、约12个月至约24个月、约15个月至约18个月、约15个月至约21个月、约15个月至约24个月、约18个月至约21个月、约18个月至约24个月、或约21个月至约24个月。

本说明书的一些方面部分地提供施用本文所公开的水凝胶组合物。如本文所用，术语“施用”意指向个体提供潜在导致有利结果的本文所公开的组合物的任何递送机构。用于向个体施用组合物的实际递送机构可由本领域普通技术人员考虑以下因素来确定：包括但不限于状况类型、状况位置、状况的原因、状况严重程度、所期望的有益程度、所期望有益效果的持续时间、所用具体组合物、所用具体组合物的生物降解率、所用具体组合物中所含其他试剂的性质、具体施用途径、具体特征、个体的病史和危险因素诸如例如年龄、体重、总体健康状况等、或它们的任何组合。在该实施方案的一个方面，将本文所公开的组合物通过注射施用于个体的软组织或皮肤。

向个体患者施用水凝胶组合物的途径通常将基于个体和/或医师所期望的美容效果以及待处理的身体部分或区域来确定。本文所公开的组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何方式施用，包括但不限于带针头注射器、喷枪(例如液压气动压缩喷枪)，或通过直接外科手术植入施用。可将本文所公开的水凝胶组合物施用到软组织或皮肤，诸如例如真皮区域、皮下区域、或甚至较深区域中。例如，本文所公开的水凝胶组合物可利用直径为约0.26mm至约0.4mm且长度为约4mm至约14mm范围的针或插管注射。另选地，针或插管可为21号至32号并且长度为约4mm至约70mm。其他合适的针规格在本文有所公开。优选地，针是一次性使用的针。针可与注射器、导管和/或喷枪组合。插管可为各种尺寸并且包括刚性或柔性形式。

此外，本文所公开的组合物可一次或多次施用。最终，所用时间将遵循质量护理标准。例如，本文所公开的真皮填充剂组合物可施用一次或数次，每次被数天或数周间隔开。例如，可每1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天或每1周、2周、3周、或4周向个体施用本文所公开的真皮填充剂组合物。向个体施用本文所公开的真皮填充剂组合物可在每月一次或每月两次的基础上或者每3个月、6个月、9个月、或12个月施用。

本说明书的一些方面部分地涉及皮肤。皮肤由三个原生层组成：表皮，其提供防水并且用作阻挡感染的屏障；真皮，其用作皮肤的附着物的位置；以及下皮(皮下脂肪层)。表皮不包含血管，并且由真皮的扩散滋养。构成表皮的主要类型的细胞为角质细胞、黑色素细胞、朗格汉斯细胞和梅克尔细胞。皮肤包括“真皮区域”。

本说明书的一些方面部分地提供了真皮区域。如本文所用，术语“真皮区域”是指包括真皮-表皮交界和真皮的皮肤区域。真皮-表皮交界为表皮提供真皮-表皮附着性、机械支持，以及跨界面交换细胞和一些大分子的屏障。真皮包括浅表真皮(乳头区)和深层真皮(网状区)。

真皮是由结缔组织组成的表皮之下的皮肤层，并且为身体缓和应力和张力。真皮经由基底膜紧紧地连接到表皮。其还停驻着许多机械性感受器/神经末梢，提供触觉和热感觉。其包含毛囊、汗腺、皮脂腺、顶泌汗腺、淋巴管和血管。真皮中的血管提供养分并清除来自其自身细胞以及表皮基底层的垃圾。真皮在结构上划分为两个区域：靠近表皮的浅表区域，称为乳头区；以及深的较厚区域，称为网状区。

乳头区由松散的网形结缔组织构成。它因其指状凸出物(称为朝表皮延伸的乳突)而命名。乳突为真皮提供与表皮交错的“凸起”表面，从而强化两个皮肤层之间的连接。网状区位于乳头区深处并且通常较厚。其由致密不规则结缔组织构成，并且因贯穿其交织的密集浓度的胶原纤维、弹性纤维和网状纤维而接受其名称。这些蛋白纤维赋予真皮其强度、延展性和弹性特性。还位于网状区内的是毛发的根部、皮脂腺、汗腺、接受器、指/趾甲以及血管。文身墨水就保留在真皮中。妊娠的妊娠纹也位于真皮中。

下皮位于真皮下方。其目的在于将皮肤的真皮区域附着到下面的骨骼和肌肉并且为其供应血管和神经。其由松散的结缔组织和弹性蛋白组成。主要细胞类型是成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞(下皮包含50％的体脂)。脂肪充当身体的垫料和绝缘物。

在该实施方案的一个方面，本文所公开的水凝胶组合物通过注射到真皮区域或皮下区域中施用至个体的皮肤。在该实施方案的一些方面，将本文所公开的水凝胶组合物通过注射到例如真皮-表皮界面区、乳头区、网状区、或它们的任何组合中施用至个体的真皮区域。

本说明书的其他方面部分地公开了处理皮肤状况的方法，包括向对其有需要的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物改善皮肤状况，从而处理皮肤状况。在该实施方案的一个方面，皮肤状况是处理皮肤脱水的方法，包括向遭受皮肤脱水的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤再水合，从而处理皮肤脱水。在该实施方案的另一方面，处理皮肤弹性缺乏的方法包括向遭受皮肤弹性缺乏的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物提高皮肤的弹性，从而处理皮肤弹性缺乏。在该实施方案的另一方面，处理皮肤粗糙的方法包括向遭受皮肤粗糙的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤粗糙度减小，从而处理皮肤粗糙。在该实施方案的另一方面，处理皮肤绷紧度缺乏的方法包括向遭受皮肤绷紧度缺乏的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤绷紧，从而处理皮肤绷紧度缺乏。

在该实施方案的另一方面，处理皮肤萎缩纹或妊娠纹的方法包括向遭受皮肤萎缩纹或妊娠纹的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤萎缩纹或妊娠纹减少或消除，从而处理皮肤萎缩纹或妊娠纹。在该实施方案的另一方面，处理皮肤苍白的方法包括向遭受皮肤苍白的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤色调或光亮度提高，从而处理皮肤苍白。在该实施方案的另一方面，处理皮肤皱纹的方法包括向遭受皮肤皱纹的个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤皱纹减少或消除，从而处理皮肤皱纹。在该实施方案的另一方面，处理皮肤皱纹的方法包括向个体施用本文所公开的水凝胶组合物的步骤，其中所施用的组合物使皮肤抵抗皮肤皱纹，从而处理皮肤皱纹。本发明还提供了处理状况的方法，该方法包括施用本发明的凝聚层HA水凝胶。在一个实施方案中，提供了减少皱纹出现的方法。在另一个实施方案中，提供了整修软组织特征，包括软组织面部特征的方法。在另一个实施方案中，提供了对靠近水凝胶的组织施加机械压力的方法。在其他实施方案中，提供了对靠近施用的水凝胶的组织提供提升能力的方法。

本发明还提供了凝聚层HA水凝胶的用途。本发明的凝聚层HA水凝胶的非限制性用途包括用作皮肤的微整形填充针剂，或填充皮肤内或皮肤下空隙的占位剂，以减少皱纹出现，或整修特定软组织特征诸如软组织面部特征。在一些实施方案中，本发明的凝聚层HA水凝胶用于对靠近水凝胶的组织施加机械压力。在其他实施方案中，本发明的凝聚层HA水凝胶对靠近施用的水凝胶的组织提供提升能力。在其他实施方案中，凝聚层HA水凝胶用于向受试者的组织递送美容剂或其他试剂。用凝聚层HA水凝胶所递送的试剂的非限制性示例包括抗氧化剂、止痒剂、抗蜂窝炎剂、抗瘢痕剂、抗炎剂、麻醉剂、抗刺激剂、脱皮剂、张紧剂、抗痤疮剂、亮肤剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、保湿剂和/或维生素。

下文描述了本发明的附加非限制性实施方案。

1.在实施方案1中，提供了一种包含水凝胶的真皮填充剂，其中水凝胶包含：

(a)阴离子透明质酸(HA)多糖；以及

(b)阳离子多糖。

2.在实施方案2中，提供了根据实施方案1所述的真皮填充剂，其中水凝胶是凝聚层水凝胶。

3.在实施方案3中，提供了根据实施方案1或2所述的真皮填充剂，其中水凝胶在阴离子多糖与阳离子多糖之间包含非共价离子复合物。

4.在实施方案4中，提供了根据实施方案1、2或3所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖选自非交联阴离子HA、交联阴离子HA、以及它们的混合物。

5.在实施方案5中，提供了根据实施方案1、2、3或4所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖选自非交联HA、交联HA、以及它们的混合物。

6.在实施方案6中，提供了根据实施方案5所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖选自非交联阳离子多糖、交联阳离子多糖、以及它们的混合物；优选地，阳离子多糖是非交联的。

7.在实施方案7中，提供了根据实施方案1-6中任一项所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖选自阳离子HA、非交联壳聚糖以及非交联三甲基壳聚糖。

8.在实施方案8中，提供了根据实施方案1-7中任一项所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖是非交联壳聚糖。

9.在实施方案9中，提供了根据实施方案1-8中任一项所述的真皮填充剂，其中阴离子多糖是交联透明质酸。

10.在实施方案10中，提供了根据实施方案1所述的真皮填充剂，其中阴离子HA是交联透明质酸，并且阳离子多糖是非交联壳聚糖。

11.在实施方案11中，提供了根据实施方案1-10中任一项所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖和阳离子多糖以约1至1000、约1至100、约1至10、约1至9、约1至8、约1至7、约1至6、约1至5、约1至4、约1至3、约1至2、约1至1、约1至0.04、约1至0.1、约1至0.01，或约1至0.001的摩尔比存在；优选地，真皮填充剂包含约1摩尔当量的阴离子多糖与约0.04至约0.20摩尔当量的阳离子多糖。

12.在实施方案12中，提供了根据实施方案1-11中任一项所述的真皮填充剂，其还包含美容剂。

13.在实施方案13中，提供了根据实施方案1-11中任一项所述的真皮填充剂，其还包含选自以下的试剂：抗氧化剂、止痒剂、抗蜂窝炎剂、抗瘢痕剂、麻醉剂、抗刺激剂、脱皮剂、张紧剂、抗痤疮剂、亮-肤剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、保湿剂、维生素、以及前述物质中的一种或多种的任意组合。

14.在实施方案14中，提供了根据实施方案12或13所述的真皮填充剂，其中在真皮填充剂施用至软组织之后，所述试剂在施用部位处和/或周围的软组织中释放至少约3周。

15.在实施方案15中，提供了根据实施方案1至14中任一项所述的真皮填充剂，其还包含生理上可接受的载体。

16.在实施方案16中，提供了根据实施方案15所述的真皮填充剂，其中载体是磷酸盐缓冲盐水或非交联HA。

17.在实施方案17中，提供了根据实施方案1至16中任一项所述的真皮填充剂，其中水凝胶具有约50Pa至约5,000Pa、约50Pa至约3，000Pa、约50Pa至约1000Pa、约50Pa至约500Pa、约50Pa至约400Pa、约50Pa至约300Pa、或约100Pa至约300Pa；优选地，约30Pa至约500Pa的储能模量(G′)。

18.在实施方案18中，提供了根据实施方案1至17中任一项所述的真皮填充剂，其可通过针注入，其中针规格为至少18号、至少21号、至少23号、至少25号、至少27号、或至少30号；优选地至少27号。

19.在实施方案19中，提供了根据实施方案1-18中任一项所述的真皮填充剂，其具有至少约500Pa的G′，其中真皮填充剂可通过针注入而无需在注射之前筛分或匀化真皮填充剂；其中针为至少27号。

20.在实施方案20中，提供了根据实施方案1-3中任一项所述的真皮填充剂，其包含约1摩尔当量的阴离子多糖与约0.01摩尔当量至约1摩尔当量的阳离子多糖(例如，约1∶0.01、1∶0.02、1∶0.04、1∶0.06、1∶0.08、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20、1∶0.40、1∶0.60、1∶0.80、或1∶1当量的阴离子与阳离子多糖，或其间的任意比率)。

21.在实施方案21中，提供了根据实施方案1-3中任一项所述的真皮填充剂，其包含约1摩尔当量的阴离子多糖与约0.02摩尔当量至约0.5摩尔当量的阳离子多糖。

22.在实施方案22中，提供了根据实施方案1-3中任一项所述的真皮填充剂，其包含约1摩尔当量的阴离子多糖与约0.04摩尔当量至约0.2摩尔当量的阳离子多糖(例如，约1∶0.04、约1∶0.06、约1∶0.08、约1∶0.1、约1∶0.15、约1∶0.20，或其间的任意比率)。

23.在实施方案23中，提供了根据实施方案20、21或22所述的真皮填充剂，其中阴离子多糖是交联透明质酸，并且阳离子多糖是非交联壳聚糖。

24.在实施方案24中，提供了一种处理受试者的软组织(诸如皮肤)的方法，所述方法包括将根据实施方案1至23中任一项所述的真皮填充剂注射到受试者的软组织中。

25.在实施方案25中，提供了根据实施方案24所述的方法，其中软组织是皮肤，所述方法包括将根据实施方案1-23中任一项所述的真皮填充剂注射到受试者的皮肤的真皮区域中。

26.在实施方案26中，提供了根据实施方案24或25所述的方法，其中处理包括加强软组织的强度，改善软组织的质量，或减少受试者的软组织的缺陷。

27.在实施方案27中，提供了根据实施方案24-26中任一项所述的方法，其中处理包括成形、填充、盈容或整修受试者的软组织。

28.在实施方案28中，提供了根据实施方案24-27中任一项所述的方法，其中处理包括改善真皮体内稳态，改善皮肤厚度，创伤愈合，或减少受试者的疤痕。

29.在实施方案29中，提供了根据实施方案26所述的方法，其中缺陷是皱纹、疤痕、或真皮组织损失。

30.在实施方案30中，提供了根据实施方案24-29中任一项所述的方法，其中在填充剂注射到受试者的软组织中之后，真皮填充剂在受试者的软组织(诸如皮肤)内持续至少约：3个月、4个月、5个月、或6个月。

31.在实施方案31中，提供了根据实施方案24-29中任一项所述的方法，其中在填充剂注射到受试者的真皮区域中之后，真皮填充剂在受试者的真皮区域内持续至少约：3个月、4个月、5个月、或6个月。

32.在实施方案32中，提供了根据实施方案24-31中任一项所述的方法，其中处理在至少约3个月的时段内有效。

33.在实施方案33中，提供了根据实施方案24至32中任一项所述的方法，其中软组织是皮肤。

1a.在实施方案1a中，提供了一种包含透明质酸(HA)水凝胶的真皮填充剂，所述水凝胶包含：

(a)阴离子HA多糖；以及

(b)阳离子多糖；

其中水凝胶在阴离子HA多糖与阳离子多糖之间包含非共价离子复合物，并且其中阴离子HA多糖和阳离子多糖各自独立地为交联或非交联的。

2a.在实施方案2a中，提供了根据实施方案1a所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖是透明质酸。

3a.在实施方案3a中，提供了根据实施方案1a所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖选自非交联阴离子HA、交联阴离子HA、以及它们的混合物。

4a.在实施方案4a中，提供了根据实施方案2a所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖选自非交联HA、交联HA、以及它们的混合物。

6a.在实施方案6a中，提供了根据实施方案5a所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖选自非交联阳离子多糖、交联阳离子多糖、以及它们的混合物；优选地，阳离子多糖是非交联的。

7a.在实施方案7a中，提供了根据实施方案1a-4a中任一项所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖选自阳离子HA、非交联壳聚糖以及非交联三甲基壳聚糖。

8a.在实施方案8a中，提供了根据实施方案7a所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖选自壳聚糖和三甲基壳聚糖，其各自是非交联的。

9a.在实施方案9a中，提供了根据实施方案1a-4a中任一项所述的真皮填充剂，其中阳离子多糖是非交联壳聚糖。

10a.在实施方案10a中，提供了根据实施方案1a所述的真皮填充剂，其中阴离子HA是交联透明质酸，并且阳离子多糖是非交联壳聚糖。

11a.在实施方案11a中，提供了根据实施方案1a-10a中任一项所述的真皮填充剂，其中阴离子HA多糖和阳离子多糖以约1至1000、约1至100、约1至10、约1至9、约1至8、约1至7、约1至6、约1至5、约1至4、约1至3、约1至2、约1至1、约1至0.1、约1至0.01、或约1至0.001的摩尔比存在；优选地，真皮填充剂包含约1摩尔当量的阴离子多糖与约0.04摩尔当量至约0.20摩尔当量的阳离子多糖。

12a.在实施方案12a中，提供了根据实施方案1a-11a中任一项所述的真皮填充剂，其还包含美容剂。

13a.在实施方案13a中，提供了根据实施方案1a-11a中任一项所述的真皮填充剂，其还包含选自以下的试剂：抗氧化剂、止痒剂、抗蜂窝炎剂、抗瘢痕剂、麻醉剂、抗刺激剂、脱皮剂、张紧剂、抗痤疮剂、亮-肤剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、保湿剂、维生素、以及前述物质中的一种或多种的任意组合。

14a.在实施方案14a中，提供了根据实施方案12a或13a所述的真皮填充剂，其中在真皮填充剂施用至软组织之后，所述试剂在施用部位处或周围的软组织中释放至少约3周。

15a.在实施方案15a中，提供了根据实施方案1a-14a中任一项所述的真皮填充剂，其还包含生理上可接受的载体。

16a.在实施方案16a中，提供了根据实施方案15a所述的真皮填充剂，其中载体是磷酸盐缓冲盐水或非交联HA。

17a.在实施方案17a中，提供了根据实施方案1a-16a中任一项所述的真皮填充剂，其中HA水凝胶具有约50Pa至约5,000Pa、约50Pa至约3,000Pa、约50Pa至约1000Pa、约50Pa至约500Pa、约50Pa至约400Pa、约50Pa至约300Pa、或约100Pa至约300Pa；优选地，约30Pa至约500Pa的储能模量(G′)。

18a.在实施方案18a中，提供了根据实施方案1a-17a中任一项所述的真皮填充剂，其可通过针注入，其中针规格为至少18号、至少21号、至少23号、至少25号、至少27号、或至少30号；优选地至少27号。

19a.在实施方案19a中，提供了根据实施方案1a-18a中任一项所述的真皮填充剂，其具有至少约500Pa的G′，其中真皮填充剂可通过针注入而无需在注射之前筛分或匀化真皮填充剂；其中针为至少27号。

20a.在实施方案20a中，提供了一种处理受试者的软组织(诸如皮肤)的方法，所述方法包括将根据实施方案1a-19a中任一项所述的真皮填充剂注射到受试者的软组织中。

21a.在实施方案21a中，提供了根据实施方案20a所述的方法，其中软组织是皮肤，所述方法包括将根据实施方案1a-19a中任一项所述的真皮填充剂注射到受试者的真皮区域中。

22a.在实施方案22a中，提供了根据实施方案20a或21a所述的方法，其中处理包括加强软组织的强度，改善软组织的质量，或减少受试者的软组织的缺陷。

23a.在实施方案23a中，提供了根据实施方案20a-22a中任一项所述的方法，其中处理包括成形、填充、盈容或整修受试者的软组织。

24a.在实施方案24a中，提供了根据实施方案20a-22a中任一项所述的方法，其中处理包括改善真皮体内稳态，改善皮肤厚度，创伤愈合，或减少受试者的疤痕。

25a.在实施方案25a中，提供了根据实施方案22a所述的方法，其中缺陷是皱纹、疤痕、或真皮组织损失。

26a.在实施方案26a中，提供了根据实施方案20a-25a中任一项所述的方法，其中在填充剂注射到受试者的软组织中之后，真皮填充剂在受试者的软组织(诸如皮肤)内持续至少约：3个月、4个月、5个月、或6个月。

27a.在实施方案27a中，提供了根据实施方案21a-25a中任一项所述的方法，其中在填充剂注射到受试者的真皮区域中之后，真皮填充剂在受试者的真皮区域内持续至少约：3个月、4个月、5个月、或6个月。

28a.在实施方案28a中，提供了根据实施方案20a-27a中任一项所述的方法，其中处理在至少约3个月的时段内有效。

29a.在实施方案29a中，提供了根据实施方案20a至28a中任一项所述的方法，其中软组织是皮肤。

在实施方案(I)中，提供了根据实施方案1至23中任一项所述的真皮填充剂，所述水凝胶包含由阴离子HA多糖(a)和阳离子多糖(b)组成的聚合组分。

在实施方案(Ia)中，提供了根据实施方案(I)所述的真皮填充剂，其中聚合组分由交联透明质酸和非交联阳离子多糖组成。

在实施方案(Ib)中，提供了根据实施方案(Ia)所述的真皮填充剂，其中非交联阳离子多糖是壳聚糖。

在实施方案(II)中，提供了根据实施方案1a-19a中任一项所述的真皮填充剂，所述水凝胶包含由阴离子HA多糖(a)和阳离子多糖(b)组成的聚合组分。

在实施方案(IIa)中，提供了根据实施方案(II)所述的真皮填充剂，其中聚合组分由交联透明质酸和非交联阳离子多糖组成。

在实施方案(IIb)中，提供了根据实施方案(IIa)所述的真皮填充剂，其中非交联阳离子多糖是壳聚糖。

实施例

实施例1：用于制备可用作真皮填充剂的本发明水凝胶的材料

A.非交联HA：分子量为约50K至约3百万道尔顿的非交联HA购自HTLBiotechnology(France)。

B.交联HA：交联HA的来源包括市售的HA水凝胶，诸如牌真皮填充剂(Allergan，Inc.)，例如 Ultra Plus真皮填充剂或 Voluma真皮填充剂。还可使用储能模量(G′)为约500Pa至约1,000Pa的研究级交联HA。制备交联HA的方法由Lebreton(US 2010/0226988、US 2008/0089918、US 2010/0028438和US 2006/0194758；出处同上)，以及Njikang等人(US2013/0096081；出处同上)描述。

C.阳离子HA：阳离子HA可根据本文所述的工程(例如，如下文所示)进行制备。

方案3：在HA中引入铵阳离子：在EDC存在下使HA与HMDA偶联，以提供具有伯铵离子的阳离子HA。

方案4：在HA中引入铵阳离子：在EDC存在下使HA与Nε-BOC-赖氨酸甲酯偶联，随后去除BOC保护基团，以提供具有伯铵离子的阳离子HA。

方案5：在HA中引入胍鎓阳离子：使根据方案3制备的阳离子HA与1H-吡唑-1-甲脒反应，以提供具有胍鎓离子的阳离子HA。

方案6：在HA中引入胍鎓阳离子：使根据方案4制备的阳离子HA与1H-吡唑-1-甲脒反应，以提供具有胍鎓离子的阳离子HA。

(i)包含伯铵离子的非交联阳离子HA：简而言之，在15ml注射器中，使约50mg的非交联HA(MW：300～800K道尔顿)和14.4mg六亚甲基二胺(HMDA)溶解于pH5.0 MES缓冲液中。随后，向包含5ml的pH5.0 MES缓冲液的独立15mL注射器中加入23.9mg的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和14.3mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。使两个注射器通过连接器彼此连接，并通过重复插入/抽回注射器柱塞混合20次。将所得的混合物转移至小瓶中并允许静置约6小时，然后使用分子量截断为20,000道尔顿的透析管通过对PBS透析而进一步纯化。最终溶液将冻干为干粉。所得的非交联HA(HA-HMDA)将具有伯胺官能团，即非交联HA-HMDA在生理pH下包含伯铵基团。

(ii)包含胍鎓离子的非交联阳离子HA：非交联HA-HMDA(如上所制备)将与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在pH10 PBS缓冲液下反应。简而言之，10mg的非交联HA-HMDA将溶解于5ml的pH10 PBS缓冲液中，随后加入20mg的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐。允许反应静置约5小时。使用分子量截断为20,000道尔顿的透析管对pH7PBS缓冲液透析所得的溶液。最终溶液将冻干为干粉。所得的非交联阳离子HA将带有胍鎓基团。

(iii)包含伯铵离子的交联HA：约50mg的交联HA(如实施例1B所提供)和14.4mg的HMDA将溶解于pH5.0 MES缓冲液中。随后，向包含5ml的pH5.0 MES缓冲液的独立15mL注射器中加入23.9mg的EDC和14.3mg的NHS。使两个注射器通过连接器彼此连接，并通过重复插入/抽回注射器柱塞混合20次。将所得的混合物转移至小瓶中并允许静置约6小时，然后使用分子量截断为20,000道尔顿的透析管通过透析而进一步纯化。最终溶液将冻干为干粉。所得的交联HA-HMDA将具有伯胺官能团，即交联HA-HMDA在生理pH下具有伯铵基团。

(iv)包含胍鎓离子的交联HA：交联HA-HMDA(如上所制备)将与1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐在pH10 PBS缓冲液下反应。简而言之，10mg的交联HA-HMDA将溶解于5ml的pH10 PBS缓冲液中，随后加入20mg的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐。允许反应静置约5小时。对pH7PBS缓冲液透析所得的溶液。最终溶液将冻干为干粉。所得的交联阳离子HA将带有胍鎓基团。

D.改性阴离子HA：

(i)用膦酸官能团改性非交联HA：该材料将使用EDC化学法通过使非交联HA与氨基膦酸反应进行制备。简而言之，在15ml注射器中，使约50mg的非交联HA(MW：300～800道尔顿)和27.8mg的氨基甲基膦酸溶解于pH5.0 MES缓冲液中。随后，向包含5ml的pH5.0 MES缓冲液的独立15mL注射器中加入23.9mg的EDC和14.3mg的NHS。使两个注射器通过连接器彼此连接，并通过重复插入/抽回注射器柱塞混合约20次。将所得的混合物转移至小瓶中并允许静置约6小时，然后使用分子量截断为20,000道尔顿的透析管通过透析而进一步纯化。最终溶液将冻干为干粉，以提供包含膦酸根基团的非交联阴离子HA。

(ii)用磺酸官能团改性的非交联HA：该材料将使用如实施例1D(i)中所述的类似过程进行制备，用氨基氨磺酸取代氨基膦酸来官能化HA，从而提供包含磺酸根基团的非交联阴离子HA。

(iii)用膦酸官能团改性的交联HA：将交联HA(如实施例B中所提供)用膦酸官能团在基本上如实施例1D(i)中所述的条件下进行改性，以提供包含膦酸基团的交联HA。另选地，如实施例D(i)中所述的用膦酸基团改性的非交联HA使用如Lebreton(US 2010/0226988，US 2008/0089918，US 2010/0028438和US 2006/0194758；出处同上)，以及Njikang等人(出处同上)所述的HA交联过程进行交联，以提供包含膦酸基团的交联HA。

(iv)用磺酸官能团改性的交联HA：交联HA(如实施例1B中所提供)用磺酸官能团在基本上如实施例1D(ii)中所述的条件下进行改性，以提供包含磺酸基团的交联HA。另选地，如实施例D(ii)中所述的用磺酸基团改性的非交联HA使用如Lebreton(US2010/0226988，US2008/0089918，US 2010/0028438和US2006/0194758；出处同上)，以及Njikang等人(出处同上)所述的HA交联过程进行交联，以提供包含磺酸基团的交联HA。

E.壳聚糖：

(i)具有M_w 60,000-120,000的高纯度壳聚糖(HPC)购自Sigma-Aldrich。分子量为约10,000Da至约1,000,000Da的HPC可获自商业来源。

(ii)三甲基壳聚糖可得自商业来源，或者可通过已建立的烷基化壳聚糖(诸如HPC)的方法进行制备。

实施例2：使用非交联HA和阳离子HA制备水凝胶：

在10ml注射器中，将约25mg的分子量为约1百万道尔顿至约3百万道尔顿的非交联HA用5ml的1×PBS水合。使非交联阳离子HA(实施例1C)以约1重量％的浓度独立溶解于1×PBS中。使水合HA与非交联阳离子HA以1∶20至20∶1的可变电荷比(-COOH/胍鎓)混合，直至实现凝聚层凝胶。可应用附加的离心来去除过量的水。

实施例3：使用高G’的交联HA以及阳离子HA制备水凝胶：

在10ml注射器中，使约2ml的储能模量(G′)为约500Pa至约1000Pa的交联HA与1重量％的包含胍鎓阳离子基团的非交联阳离子HA(如实施例1C(ii)所述制备)在pH7.5PBS缓冲液中以1∶10至50∶1的可变电荷比(-COOH/胍鎓)混合，直至实现凝聚层凝胶。

实施例4：使用 Ultra Plus和壳聚糖制备水凝胶：

壳聚糖溶液制备：将高纯度壳聚糖(HPC；参见实施例1E；M_w 85kDa，乙酰化度24.4MOL％)溶解于酸性水(4.904mL milliQ水，含有96微升浓HCI)至38.76mg/mL的最终浓度，然后对溶液进行蒸汽灭菌(128℃，5min)。随后用milliQ水将所得的HPC溶液进一步稀释至0.4mg/ml至1.9mg/ml范围内的各种浓度，并使用经稀释溶液来制备不同的水凝胶制剂。

水凝胶制剂：使 Ultra Plus(JUP；1cc)与50微升的各经稀释的HPC水溶液(0.4mg/ml至1.9mg/ml)混合，得到具有0.04∶1至0.2∶1范围内的HPC与JUP当量比率的凝胶混合物。使凝胶经受流变性试验和溶胀/解离试验。

水凝胶制剂的机械性能：在混合之后，观察水凝胶的物理外观和模量的变化(图3)。随着HPC的浓度逐渐增大，水凝胶材料似乎更不透明。

凝胶流变性的测定：振荡平行板流变仪(Anton Paar，Physica MCR 302)用于测量凝胶的流变性。所用板的直径为25mm。板之间的间隙设定为1mm。对于各测量，首先运行恒定应变下的频率扫描，然后以固定频率进行应变扫描。水凝胶的G′(储能模量)获自于1％应变和5Hz应变速率下的应变扫描曲线。储能模量(G′)随着HPC浓度增大以逐步方式下降(图3B)。在所测试范围内，对于最高浓度的壳聚糖，模量减小约9.5％。

凝胶溶胀/解离测试：将各水凝胶(约250μL)注入圆柱形模具中并离心以除去气泡。随后将水凝胶转移到PBS(20mL)中并在轨道式震荡器上于37℃和200RPM温育。在前24小时之内，水凝胶达到溶胀平衡，随后保持完整性而无需PBS中进一步解离或分散。虽然未添加壳聚糖的凝胶两天内在PBS缓冲液中解离并分散(数据未示出)，但所有包含壳聚糖的制剂在至少29天内保持稳定(图4)。

实施例5：稀释条件下的凝胶粘结测试：

将实施例4所制备的水凝胶浸泡于富PBS溶液中。使混合物经受200rpm的振荡条件。凝胶完整性的保持通过视觉观察进行测定。

实施例6：凝胶模制性能试验

评价以上实施例所制备的水凝胶的凝胶提升能力和模制性能。

对于凝胶提升能力的定量分析，使用平行板振荡流变仪(Anton Paar，MCR302)实施线性压缩测试来评价提升能力。在该测试中，将已知质量的填充剂置于板之间，并将上板以恒定速度下降，同时测量法向力(反向变形)；较高法向力值表示对变形较高的抵抗力。

凝胶模制性能通过测量所注射填料经受限定的外部力时对变形的易感性来进行评价。所施加的力319克被选择成模拟注射者的拇指用于操纵填充剂的力。利用Canfield3D成像，在Sprague Dawley大鼠模型中在九天时段内测量填充剂的模制性能。

测定凝胶具有良好的提升能力和模制性能。

最后，应当理解虽然已参考各种实施方案描述了本说明书的一些方面，本领域的技术人员将易于理解所公开的具体示例仅用于阐明本文所公开主题的原理。因此，应当理解所公开的主题决不限于本文所述的特定方法、方案和/或试剂等。因此，本领域的技术人员可根据本文的教导对所公开的主题作出多种和各种修改或更改或可选构造而不脱离本说明书的实质。在不脱离如所附权利要求所限定的本发明实质的情况下，可以改变细节。最终，本文所用术语仅为了描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明范围，其仅由权利要求书所限定。此外，应当指出在以上描述所包含和附图中所显示的所有内容应当仅解释为说明性而非限制性。因此，本发明不限于精确地所示和所述的。

本文描述了本发明的特定实施方案，包括发明人所知的实施本发明的最佳模式。当然，本领域的普通技术人员阅读上述描述后会明白这些所述实施方案的变化。发明人期望技术人员适当地采用此类变化，且本发明人的意图是以与本文具体描述的内容不同的方式来实践本发明。因此，本发明包括由适用的法律所允许的所附权利要求书中所列举的主题的所有修改和等同物。此外，上述要素所有可能变化的任意组合包括在本发明中，除非本文另有说明或与内容明显矛盾。

本文所公开的本发明的另选要素或实施方案的分组不应解释为限制性。各组成员可被单独提到且要求保护，或与本文发现的组的其他成员或其他要素任意组合。应当理解，由于便利和/或专利的原因，一组的一个或多个成员可以被包括到一组中或从该组删除。当任何此类包括或删除发生时，说明书被看作为含有经过改动的组，因此满足对所附权利要求书中所用的全部马库什组的书面描述。

除非另外指明，本说明书和权利要求书中所用的表示成分的量、性质诸如分子量、反应条件等的所有数字都应当被理解为在所有情况下用术语“约”加以修饰。如本文所用，术语“约”意指如此限定的项、参数或期限包括所述的项、参数或期限的值以上和以下的正或负10％的范围。因此，除非有相反的指示，说明书和权利要求书中所述的数值参数都是近似值，可根据本发明所寻求获得的所需性能而变化。在最低程度上，每个数值参数并不旨在限制等同原则在权利要求书保护范围上的应用，至少应该根据所报告数值的有效数位和通过应用惯常的四舍五入技术来解释每一个数值参数。虽然，阐述本发明广义范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体示例中所列出的数值则尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地含有某些误差，这些误差由它们各自试验测定中所见的标准偏差所不可避免地产生。

除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文(尤其是以下权利要求书的上下文)中所用的术语“一个”、“一种”、“所述”和类似指代词应理解为包括单数和复数。本文中提到数值范围仅旨在作为单独提到落入该范围的每个单独值的速记。除非本文另外指明，每个单独的值都被并入说明书，就像其被单独地并入本文一样。本文描述的所有方法可以按任何合适的顺序进行，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。除非另外声明，否则本文中所提供的任何及全部示例的使用或示例性用语(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不是形成对本发明范围的限制。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何未要求保护的本发明实施所必须的要素。

本文所公开的具体的实施方案可利用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言在权利要求书中进一步限制。当用于权利要求书时，无论在每次修改提交还是添加，过渡术语“由……组成”排除未在权利要求中指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤以及不对基本和新型特征造成实质影响的那些。本文固有或明确地描述和允许如此受权利要求书保护的本发明实施方案。

本说明书中引用和标明的所有专利、专利公布、以及其他公布被单独和明确地全文以引用方式并入本文中，以用于描述和公开例如可在本发明的相关方面使用的此类公布中所述的组合物和方法的目的。这些公布仅是为其在本申请提出日期之前公开而提供的。不应该将这一点视为承认：由于这些在先发明或任何其他原因，发明人无权占先于此类公开。所有关于这些文件的数据的声明或关于内容的表述是基于申请人可获得的信息，且不构成对这些文件的数据或内容正确性的任何承认。

Claims (25)

1.一种包含水凝胶的真皮填充剂，其中所述水凝胶包含：

(a)阴离子透明质酸(HA)；以及

(b)阳离子多糖。

2.根据权利要求1所述的真皮填充剂，其中所述水凝胶是凝聚层水凝胶。

3.根据权利要求1或2所述的真皮填充剂，其中所述水凝胶在所述阴离子HA与所述阳离子多糖之间包含离子复合物。

4.根据权利要求1、2或3所述的真皮填充剂，其中所述阴离子HA选自非交联阴离子HA、交联阴离子HA、以及它们的混合物。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的真皮填充剂，其中所述阴离子HA选自非交联HA、交联HA、以及它们的混合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的真皮填充剂，其中所述阳离子多糖是非交联的。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的真皮填充剂，其中所述阳离子多糖选自阳离子HA、非交联壳聚糖以及非交联三甲基壳聚糖。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的真皮填充剂，其中所述阳离子多糖是非交联壳聚糖。

9.根据权利要求1、2或3所述的真皮填充剂，其中所述阴离子HA是交联HA。

10.根据权利要求1、8或9所述的真皮填充剂，其包括约1∶0.01至约1∶1；优选地，约1∶0.04至约1∶0.20的所述阴离子HA与所述阳离子多糖的摩尔当量比。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的真皮填充剂，其还包含美容剂。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的真皮填充剂，其还包含选自以下的试剂：抗氧化剂、止痒剂、抗蜂窝炎剂、抗瘢痕剂、麻醉剂、抗刺激剂、脱皮剂、张紧剂、抗痤疮剂、亮肤剂、色素沉着剂、抗色素沉着剂、保湿剂、维生素、以及前述物质中的一种或多种的任意组合。

13.根据权利要求12或13所述的真皮填充剂，其中在所述真皮填充剂施用至软组织之后，所述试剂在施用部位周围的软组织中释放至少约3周。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的真皮填充剂，其还包含生理上可接受的载体。

15.根据权利要求14所述的真皮填充剂，其中所述载体是磷酸盐缓冲盐水或非交联HA。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的真皮填充剂，其中所述水凝胶具有约50Pa至约500Pa的储能模量(G′)。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的真皮填充剂，其可通过针注入，其中所述针规格为至少27号。

18.根据权利要求17所述的真皮填充剂，其可通过所述针注入而无需在注射之前筛分或匀化所述真皮填充剂。

19.一种处理受试者的软组织的方法，所述方法包括将根据权利要求1至18中任一项所述的真皮填充剂注射到所述受试者的软组织中。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述软组织是皮肤，所述方法包括将所述真皮填充剂注射到所述受试者的真皮区域中。

21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述处理包括加强软组织的强度，改善软组织的质量，或减少所述受试者的软组织的缺陷。

22.根据权利要求19、20或21所述的方法，其中所述处理包括成形、填充、盈容或整修所述受试者的软组织。

23.根据权利要求19、20或22所述的方法，其中所述处理包括改善真皮体内稳态，改善皮肤厚度，创伤愈合，或减少受试者的疤痕。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述缺陷是皱纹、疤痕、或真皮组织损失。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中在所述真皮填充剂注射到所述受试者的软组织中之后，所述真皮填充剂在所述受试者的软组织中持续至少约：3个月、4个月、5个月、或6个月。