CN109868229A - 一种保持酵母活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种保持酵母活力的方法，属于发酵工程微生物技术领域。本发明通过海藻糖溶液储存酵母，保持酵母活力。通过使用浓度为50mmol/l的海藻糖溶液在25℃下储存啤酒酵母泥4天，使酵母胞内ATP含量提升2倍以上，并提高啤酒酵母在渗透压胁迫和氧化胁迫下耐受性，有助于酵母储存过程中细胞活力的维持。与对照组相比，经过50mmol/l、100mmol/l海藻糖溶液储存的酵母在渗透压胁迫平板培养基和过氧化氢胁迫平板培养基上有更好的生长能力，50mmol/l海藻糖溶液的保护下即可以达到效果。该方法简单、有效，对啤酒生产中啤酒酵母的储存具有重要意义。

Description

一种保持酵母活力的方法

技术领域

本发明涉及一种保持酵母活力的方法，属于发酵工程微生物技术领域。

背景技术

啤酒酵母是啤酒发酵过程中的重要微生物。根据啤酒酵母的絮凝性，啤酒酵母分为两大类：上面啤酒酵母和下面啤酒酵母。啤酒酵母的质量直接影响成品啤酒的质量。

啤酒发酵中酵母是回收利用的。在发酵过程中，啤酒酵母利用营养物质，产生乙醇、二氧化碳等代谢物。因此，啤酒酵母面临着二氧化碳、pH、乙醇、渗透压等胁迫作用，这些作用对酵母的活力造成威胁，进而造成细胞衰老或死亡。发酵结束后，罐底的啤酒酵母泥经过泵回收，回收酵母经过储存直到下一次发酵使用。如果回收酵母活力未能满足所需标准，则不能被继续使用。啤酒酵母需接受良好的管理，以保证较高的活性和活力。

酵母细胞活性指活细胞数占总细胞的比例，酵母活力表示酵母生长、抗胁迫、发酵等能力。胞内ATP含量是反应酵母细胞活力变化的灵敏指标。对胁迫条件的耐受性也是酵母的活力体现之一。目前关于酵母活性和活力的研究主要针对机理的研究，通过筛选或者基因工程手段构造的酵母菌株，已达到提高酵母抵抗饥饿、干燥、脱水、渗透压、氧化胁迫、极端温度等环境的能力，但是筛选的手段方法繁杂，结果稳定性差，通过基因工程手段构造的酵母菌株因存在安全问题，无法应用于啤酒的工业化生产。

在啤酒工厂中，一轮发酵结束后，酵母要经过一段储存时间，直至下一次使用。酵母活力随储存时间的延长下降。能保持或提高啤酒酵母在储存过程中的活性和活力有利于提高酵母使用代数、提高啤酒生产效率进而降低啤酒生产成本。本研究使用海藻糖溶液储存酵母泥，旨在提高啤酒酵母生理性能，起到保持啤酒酵母活力的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种保持酵母活力的方法，所述方法是以海藻糖溶液储存酵母细胞；所述海藻糖溶液的浓度为50～100mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母细胞在海藻糖溶液中的浓度为1～9×10⁷CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母为啤酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母为酿酒酵母G-03或酿酒酵母Pilsner。

本发明的第二个目的是提供一种提高酵母抗胁迫能力的方法，所述方法是以海藻糖溶液储存酵母细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述胁迫包括渗透压胁迫、氧化胁迫、乙醇胁迫中的至少一种。

本发明的第三个目的是提供所述方法在啤酒酵母储存方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述储存是在25～30℃下进行。

本发明的第四个目的是提供一种微生物制剂，含有酵母细胞及浓度为50～100mmol/L的海藻糖溶液。

本发明还要求保护所述方法在发酵领域制备发酵食品方面的应用。

本发明的有益效果：该方法操作简单，效果显著，与无菌水储存酵母泥4天相比，在储存过程中添加海藻糖可以使酵母胞内ATP含量提升2倍以上，且可提高酵母对氧化胁迫和渗透压胁迫的抗性，对啤酒酵母起到良好的保护作用。

附图说明

图1啤酒酵母G-03和Pilsner在渗透压胁迫下的生长情况。

图2啤酒酵母G-03和Pilsner在氧化胁迫下的生长情况。

图3啤酒酵母Pilsner在乙醇胁迫下的生长情况。

图4不同储存溶液对啤酒酵母胞内ATP含量的影响；(a)G-03 (b)Pilsner。

图5不同储存溶液对啤酒酵母细胞活性的影响。

具体实施方式

(1)酵母细胞活性测量方法：酵母细胞活性采用亚甲基紫染色法。亚甲基紫染液的浓度为0.01％(w/v)，pH为10.6。取相同体积的亚甲基紫染色液和菌液，震荡混匀，25℃染色15min。在显微镜下计数，放大倍数为40倍，每个计数室至少数300个细胞。未被染色的细胞则为活细胞。细胞活性＝活细胞数×100/细胞总数。

(2)基于ATP含量的细胞活力测量方法：破碎细胞。将收集的样品菌浓调整至10⁶CFU/mL，将样品用预冷的无菌水洗涤三次，离心(5000r/min，3min)，去除上清收集菌体，用无菌水将菌体重悬至原体积，取1mL样品加入至破壁管中里，并加入750±10mg直径为0.5mm的玻璃珠，震荡破碎仪上震荡1min，震荡结束后将样品置于冰上30s，以此进行5个循环。震荡结束后8000r/min离心5min沉淀细胞碎片，取上清。破碎后的样品保持在冰浴中。

使用BactTiter-GloTM Microbial Cell Vitality Assay试剂盒检测上清中的ATP含量，参考试剂盒说明书。取100μL上清进行检测，检测条件为化学发光-发光光纤检测，读取化学发光值。ATP含量变化用相对变化表示，储存初始时的ATP发光值的记作100％。

实施例1

以啤酒酵母G-03和Pilsner为例，将YPD培养基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)中培养24h的啤酒酵母G-03离心收集，4℃无菌水洗涤3遍后称取3份质量为2g的酵母泥，分别浸泡于100ml无菌水、50mmol/l海藻糖溶液(称取1.89g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)、100mmol/l海藻糖溶液(称取3.78g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)中。浸泡温度为25℃，浸泡时间为4天。

制作渗透压胁迫抗性平板：向100mL YPD培养基中加入2g琼脂粉和5.84g氯化钠固体，115℃，灭菌15min后趁热在无菌培养皿中制成含1mol/1氯化钠的平板培养基。向100mLYPD培养基中加入2g琼脂粉和7.13g氯化钠固体，115℃，灭菌15min后，趁热在无菌培养皿中制成含1.2mol/l氯化钠的平板培养基。

取浸泡在水和海藻糖溶液中的菌悬液，分别将样品稀释10²、10³、10⁴、10⁵倍,取10μl点在渗透压抗性平板上，放置于28℃恒温培养箱静置培养72～94h后观察细胞生长情况，结果如图1。

从图1可以看出，在渗透压平板上，海藻糖溶液储存的啤酒酵母在渗透压胁迫下的生长能力明显优于无菌水储存的酵母。例如，在1mol/l氯化钠平板上，当菌液稀释10³和10⁴倍时，海藻糖溶液中储存的酵母菌数明显多于无菌水中储存的酵母。当渗透压胁迫增大至1.2mol/l氯化钠时，菌液稀释10²、10³倍后，无菌水储存的Pilsner的生长较少，而海藻糖溶液储存的Pilsner酵母大量生长。当菌液稀释10³倍后，无菌水储存的G-03无法在1.2mol/l氯化钠胁迫平板上生长，而依然可以观察到相对较多的在海藻糖溶液中储存的G-03在平板上生长。综上表明，海藻糖溶液储存的酵母比无菌水储存的酵母在氯化钠平板上具有更好的生长能力，前者渗透压耐受性更强。50mmol/l海藻糖溶液足以起到对啤酒酵母的保护作用。

实施例2

以啤酒酵母G-03和Pilsner为例，将YPD培养基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)中培养24h的啤酒酵母G-03离心收集，4℃无菌水洗涤3遍后称取3份质量为2g的酵母泥，分别浸泡于100ml无菌水、50mmol/l海藻糖溶液(称取1.89g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)、100mmol/l海藻糖溶液(称取3.78g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)中。浸泡温度为25℃，浸泡时间为4天。

制作氧化胁迫抗性平板：向100mLYPD培养基中加入2g琼脂粉，115℃，灭菌15min，冷却至40℃左右后无菌操作加入51.07μl 30％的过氧化氢溶液，混匀，趁热在无菌培养皿中制成含5mmol/l过氧化氢的平板培养基。向100mL YPD培养基中加入2g琼脂粉，115℃，灭菌15min，冷却至40℃左右后无菌操作加入61.28μl 30％的过氧化氢溶液，混匀，趁热在无菌培养皿中制成含6mmol/l过氧化氢的平板培养基。取储存在水和海藻糖溶液中的菌悬液，分别将样品稀释10²、10³、10⁴、10⁵倍，取10μl点在氧化胁迫抗性平板上，放置于28℃恒温培养箱静置培养72～94h后观察细胞生长情况，结果如图2。

由图2可以看出，海藻糖溶液储存的酵母在过氧化氢平板下的生长能力明显优于无菌水中储存的酵母。例如，在5mmol/l的过氧化氢平板上，当Pilsner菌液稀释10⁴倍后，无菌水浸泡的Pilsner无法生长，而海藻糖溶液浸泡的酵母相对生长较多。在6mmol/l的过氧化氢胁迫平板上，G-03菌液稀释10²倍后，只能观察到极少无菌水浸泡的酵母的生长现象，而海藻糖溶液浸泡的酵母大量生长。这表明，海藻糖溶液储存的酵母泥比无菌水储存的酵母在过氧化氢平板上具有更好的生长能力，前者氧化胁迫耐受性更强。50mmol/l海藻糖溶液足以起到氧化胁迫下对啤酒酵母的保护作用。

实施例3

以啤酒酵母G-03和Pilsner为例，将YPD培养基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物)中培养24h的啤酒酵母G-03离心收集，4℃无菌水洗涤3遍后称取3份质量为2g的酵母泥，分别浸泡于100ml无菌水、50mmol/l海藻糖溶液(称取1.89g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)、100mmol/l海藻糖溶液(称取3.78g海藻糖溶解于100ml蒸馏水中)中。浸泡温度为25℃，浸泡时间为4天。

制作乙醇胁迫抗性平板：向100mLYPD培养基中加入2g琼脂粉，115℃，灭菌15min，冷却至40℃左右后无菌操作加入12、13ml的无水乙醇，混匀，趁热在无菌培养皿中分别制成12％、13％的乙醇胁迫平板培养基。取储存在水和海藻糖溶液中的菌悬液，分别将样品稀释10²、10³、10⁴、10⁵倍，取10μl点在氧化胁迫抗性平板上，放置于28℃恒温培养箱静置培养48h后观察细胞生长情况，结果如图3。

如图3所示，在乙醇胁迫平板上，海藻糖的添加使Pilsner在乙醇胁迫平板上的生长能力增强。这表明，与用水储存相比，海藻糖的添加可以提高Pilsner的乙醇胁迫耐受性。

实施例4

(1)称取1.89g海藻糖，蒸馏水溶解并定容到100mL，制成浓度为50mmol/L的海藻糖溶液。称取1.80g麦芽糖，蒸馏水溶解并定容到100mL，制成浓度为50mmol/L的麦芽糖溶液。

(2)按实施例1的方式培养啤酒酵母G-03和Pilsner，收集细胞，分别加入终浓度为50mmol/L的海藻糖溶液和终浓度为50mmol/L的麦芽糖溶液进行储存，以水为对照储存4天，检测储存期间细胞活力变化。结果如图4所示。在25℃下，海藻糖的添加减缓了两株酵母胞内ATP含量下降的速度。储存4天过后，水中储存的G-03胞内ATP含量由100％降低至17.43％。此时海藻糖溶液中的酵母胞内ATP含量为95.59％，麦芽糖溶液中的酵母胞内ATP含量为58.83％。与水中储存的G-03相比，添加海藻糖和麦芽糖后，酵母胞内ATP含量分别提高5.48和3.37倍。而与水中储存的Pilsner相比，添加海藻糖和麦芽糖后，Pilsner胞内ATP含量分别提高和2.09倍和1.3倍。酵母是一种敏感的生物体，在合适的环境下，酵母维持自身各项功能平衡，而环境的任何变化都会打破酵母胞内巧妙的平衡关系，使细胞活力发生改变。活力的快速下降说明细胞正在对变化的环境做出响应。在储存结束时，与用水储存相比，虽然海藻糖和麦芽糖的添加均使两株酵母胞内ATP含量上升，但海藻糖溶液储存的酵母胞内ATP含量高于麦芽糖溶液储存的酵母，这说明在长期储存条件下，海藻糖对啤酒酵母活力的提升更胜一筹。

实施例5

(1)称取1.89g海藻糖，蒸馏水溶解并定容到100mL，制成浓度为50mmol/L的海藻糖溶液。称取1.80g麦芽糖，蒸馏水溶解并定容到100mL，制成浓度为50mmol/L的麦芽糖溶液。

(2)按实施例1的方式培养啤酒酵母G-03和Pilsner，收集细胞，分别加入终浓度为50mmol/L的海藻糖溶液和终浓度为50mmol/L的麦芽糖溶液进行储存，以水为对照储存4天后，检测细胞活性变化。通过亚甲基紫染色方法，检测细胞活性。结果如图5所示，在25℃下储存4天后，与水中储存的G-03相比，海藻糖溶液储存的G-03的活性提升，而麦芽糖溶液中G-03的活性下降。对于Pilsner，在25℃下于水中储存4天后，活性变为98.7％，海藻糖中储存的Pilsner活性为98.6％，而麦芽糖溶液中储存的Pilsner活性降至76.7％。可见，海藻糖溶液可以起到维持酵母活性的作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种保持酵母活力的方法，其特征在于，以海藻糖溶液储存酵母细胞；所述海藻糖溶液的浓度为50～100mmol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母细胞在海藻糖溶液中的浓度为1～9×10⁷CFU/mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酵母为啤酒酵母。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母G-03或酿酒酵母Pilsner。

5.一种提高酵母抗胁迫能力的方法，其特征在于，以海藻糖溶液储存酵母细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胁迫包括渗透压胁迫、氧化胁迫、乙醇胁迫中的至少一种。

7.权利要求1～6任一所述方法在啤酒酵母储存方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述储存是在25～30℃下进行。

9.一种微生物制剂，其特征在于，含有酵母细胞及浓度为50～100mmol/L的海藻糖溶液。

10.权利要求1～6任一所述方法在发酵领域的应用。