CN109837276A - 一种长链非编码RNA lncRNA-3608及其抗体与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学和抗体制备技术领域，具体公开了一种长链非编码RNA lncRNA‑3608及其抗体与应用。根据长链非编码RNA lncRNA‑3608中包含的RNA lncRNA‑3608P区域，能够编码表达多肽，且参与调控肿瘤细胞迁移和侵袭过程。lncRNA‑3608P或者过表达质粒pHAGE‑lncRNA‑3608P编码的多肽在宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的发病过程中发挥重要作用，该多肽及其通过免疫反应产生的抗体可以作为诊疗临床肿瘤疾病的新的分子标记和药物靶点。

Description

一种长链非编码RNA lncRNA-3608及其抗体与应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学和抗体制备技术领域，具体涉及一种长链非编码RNAlncRNA-3608及其抗体与应用。

背景技术

近年来，非编码RNA在肿瘤细胞增殖、分化、转移和凋亡等生物学过程中发挥的调节作用是研究者们关心的焦点问题。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200 nt（nucleotide），最初被认为是不翻译成蛋白质的功能性RNA分子（Science，2005，309(5740)：1559-1563．）。近年来研究表明，lncRNA与许多癌症的发生和发展密切相关，如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等（Urology，2010，77(2)：510.e1-510.e5．．Nature，2010，464(7291)：1071-1076.），也相继鉴定出一些具有编码多肽能力的lncRNA（Cell. 2015 Feb 12;160(4):595-606；Mol Cell. 2017 Oct 5;68(1):171-184.e6；Nature. 2017 Jan 12;541(7636):228-232.）。因此，本发明通过生物信息学在线软件分析，寻找具有编码多肽能力的lncRNA并针对其编码的多肽制备抗体，以期为临床肿瘤疾病的诊断、预后判断发掘新的生物标志物，为治疗提供突破点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA lncRNA-3608及其抗体与应用，本发明的长链非编码RNA lncRNA-3608与人类肿瘤发生密切相关的长链非编码RNA。

一种长链非编码RNA lncRNA-3608（基因LOCUS：NR_003608），其核酸序列如SEQ IDNo：1所示，所述核苷酸序列中编码多肽的核苷酸序列如SEQ ID No：2，所述编码多肽的核苷酸序列的命名为lncRNA-3608P 。

作为改进的是，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：3。

含有权利要求1所述的编码多肽的核苷酸序列lncRNA-3608P的过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P。

一种过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P的构建方法，包括如下步骤：

步骤1，合成获得SEQ ID No：2序列的目的基因，首部添加一个HA标签，便于检测；

步骤2，用限制性内切酶XhoI和BamH I对目的基因和pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P。

基于过表达质粒pHAGE-lncRNA-6585P编码的多肽通过免疫反应产生的抗体。

上述抗体在制备预防或治疗治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。

上述lncRNA-3608P在制备预防或治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。

有益效果：

与现有技术相比，本发明提供的长链非编码RNA lncRNA-3608能够编码表达多肽，且参与调控肿瘤细胞迁移侵袭过程，因此，lncRNA-3608及其编码的多肽在肿瘤发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗临床肿瘤疾病的新的分子标记和药物靶点。

附图说明

图1为lncRNA芯片结果火山示意图，显示3对宫颈癌及癌旁组织中差异表达达2倍以上的lncRNA的分布；

图2为Western blot验证在宫颈癌HeLa细胞系中lncRNA-3608P编码多肽的情况；

图3为Western blot检测抗lncRNA-3608P抗体；（A）E8051抗体检测结果；（B）E8052抗体检测结果；（C）E8053抗体检测结果；

图4 过表达lncRNA-3608P的HeLa细胞接种12 h后Transwell迁移和侵袭实验结果；（A）迁移实验结果统计；（B）侵袭实验结果统计（**P <0.01），其中横线条填充的pHAGE组，无填充的为lncRNA-3608P组。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。

实施例1

在宫颈癌中高表达的长链非编码RNA lncRNA-3608P能够编码多肽

1、材料

1.1组织

本发明的临床组织标本均来自2013年11月至2017年6月于南京医科大学附属南京妇幼保健院妇产科治疗的Ib1期宫颈癌患者，每对标本包含手术切除的宫颈癌组织和配对的癌旁组织。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批准。

1.2材料和细胞

慢病毒三质粒包装系统包括慢病毒表达载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green、包膜质粒pMD2.G和包装质粒，均为本实验室保存。实验所需的293T细胞以及人宫颈癌HeLa细胞均购自中国科学院细胞库，培养于含有10%灭活胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、庆大霉素（100 U/mL）、链霉素（100μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM培养基中。细胞培养条件均为37℃、5% CO₂。

1.3 试剂

Trizol试剂购自美国Thermo Scientific公司；荧光实时定量PCR（real-timequantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）所用2×ChamQ SYBR qPCR MasterMix试剂为南京诺唯赞生物有限公司产品；RT-qPCR的引物为苏州金唯智科技有限公司合成；抗Flag的单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）购自美国Thermo Scientific公司产品；Elite ABC液以及DAB显色试剂盒购自VECTOR公司；ArrayStar公司的基因芯片产品（Human LncRNA Microarray V3.0Service）由上海康成生物工程有限公司代理。PCR所用的高保真酶（Phanta酶）购自南京诺唯赞科技有限公司；凝胶纯化试剂盒购自美国Omega公司；限制性内切酶为日本TaKaRa公司产品；T4 DNA连接酶、核酸标准分子量Marker、质粒转染试剂Lipofectamine^TM 2000、Trizol及蛋白标准分子量Marker为美国Thermo Scientific公司产品；感受态大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司；RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）为上海康成生物公司产品；抗内参基因α-tubulin MAb购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG与羊抗鼠IgG为中国碧云天公司产品。

2. 方法

2.1 宫颈癌组织及癌旁组织的lncRNA芯片技术

以3例不同年龄（39岁、54岁、65岁）的宫颈癌患者的手术切除样本为对象，委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStar Human LncRNA Microarray V3.0Service”服务，进行差异lncRNA筛选。

2.2 分析差异表达lncRNA编码多肽的能力

利用在线软件RegRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection_output.php） 和LncATLAS （http://lncatlas.crg.eu/）分析差异表达的lncRNA。其中转录区域位于22号染色体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，全长1974 nt的lncRNA具有潜在编码多肽的能力，命名为lncRNA-3608。预测获得的可能编码多肽区域核苷酸序列如SEQ IDNo：2所示，该片段命名为lncRNA-3608P。

2.3 过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P的构建

在2.2中预测的SEQ ID No：2序列首部添加一个HA标签，送公司合成。用限制性内切酶XhoI和BamH I对合成基因和pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green载体进行37℃水浴酶切2 h、纯化、T4连接酶16℃水浴连接4 h，转化至大肠杆菌，获得pCDH-lncRNA-3608P的质粒。

2.4 重组病毒的包装

取对数生长期的293T细胞，按1.5×10⁶个/板细胞数接种在直径10 cm细胞培养板内，加入10 ml不含抗生素的DMEM培养基，于37℃、5% CO₂培养箱内培养。次日当细胞汇合度达70%～80%时，利用脂质体Lipofectamine^TM 2000将携带lncRNA-3608编码区域的质粒pHAGE-lncRNA-3608P、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G按照质量比为4：3：1的混合共转染293T细胞，同时以pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green、psPAX2、pMD2.G质粒共转染293T细胞作为空载体对照。于转染后10 h更换新鲜的含抗生素的完全培养基。转染48 h后利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达情况。转染48 h和72 h后分别收集细胞培养上清，将两次收集的上清混合后加入PB至终浓度为8 μg/ml，然后经0.45 μm滤器过滤后分装，于-70℃保存备用。将所获得的慢病毒分别命名为pHAGE（慢病毒空载体）和lncRNA-3608P（表达lncRNA-3608P的重组慢病毒）。

2.5 lncRNA-3608P在HeLa细胞中的表达

将HeLa细胞以0.5×10⁶/孔接种于6孔板中，用无血清DMEM培养基培养。当细胞汇合度达到70%~80%时去除培养基，用pHAGE或lncRNA-3608感染HeLa细胞，8 h后吸弃上清加入新鲜的完全培养基。于48 h后经荧光显微镜观察GFP的表达情况；当GFP达90%以上时，说明稳定表达pHAGE-lncRNA-3608P及对照细胞构建成功。

2.6 Western blot验证蛋白表达

2.6.1提取细胞总蛋白

配置细胞裂解液每100 μL RIPA加入1 μL蛋白酶抑制剂、1 μL磷酸酶抑制剂、1μLPMSF、25 μL 4×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sμlphate，SDS）缓冲液。按每1×10⁴个细胞加入100 μL细胞裂解液裂解细胞，涡旋震荡15 s，冰浴8 min，重复震荡三次。然后100°C沸水浴5 min，再次冰浴5 min，即为细胞总蛋白，蛋白分装后置于-70°C冰柜保存备用。

2.6.2 Western blot

配置10% SDS-PAGE电泳凝胶，将2.5.1制备的蛋白样品以每孔20 μL加入泳道。恒压60V电泳，待条带置于分离胶后，调整电压110 V继续电泳至结束。后用恒流100 mA100 min将蛋白转移至聚偏（二）氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，转膜结束后将膜置于5%脱脂牛奶中37°C封闭1h。分别加入抗HA PAb、抗GAPDH MAb在4°C摇床孵育过夜。次日回收一抗，并用TBS-T洗涤条带（10 min×3次）；然后分别加入辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗，于37°C恒温箱中作用1 h，TBS-T洗涤条带（10 min×3次）；最后利用化学发光法检测。

3、结果

3.1 基因芯片结果

通过Arraystar human lncRNA expression microarray V3.0技术，获得3例不同年龄的宫颈癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中差异表达的基因（图1）。

3.2 lncRNA-3608具有编码多肽能力

Western blot结果如图2所示，从图中可以看出，lncRNA-3608能够编码表达多肽。

实施例2

人长链非编码RNA lncRNA-3608编码多肽的抗体制备

1.抗体制备具体实施方式

1.1 多肽序列的分析和设计

利用 DNAstar 软件对 lncRNA-3608P编码多肽的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要按照常规方法评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定选择1-92aa（SEQ ID No：3）区段（即全长）同时构建到pET-28a-sumo 和 pET-32a 表达载体。

1.2 抗原制备

1-92 aa 区域成功分别克隆至 pET-32a 载体和pET-28a-SUMO 载体上，培养到 OD600nm 0.5-0.6 加入 0.8 mM IPTG 37℃诱导 4 小时。随后小规模表达测试，目的蛋白有表达，大小在 30 kD。破菌纯化后鉴定，上清蛋白浓度为 6 mg/mL，纯度达到免疫要求，转交免疫。

1.3免疫流程

1.4 抗血清纯化

亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。获得抗体，抗体编号分别为E8051、E8052和E8053。浓度如下：

E8051：浓度 2.51 mg/ml； E8052：浓度 2.24 mg/ml ；E8053：浓度 2.57 mg/ml。

1.5 Western blot检测抗原

Western blot检测条件，E8051、E8052、E8053 抗体检测抗原条带大小在 35 KD 左右。

1.6免疫印迹分析

通过实例1中的2.6所述方法以Western blot鉴定抗lncRNA-3608P抗体。

2.结果

Western blot结果如图3所示，从图中可以看出制备获得的抗体可用于检测lncRNA-3608P编码多肽的表达。

实施例3

长链非编码RNA lncRNA-3608P在抗肿瘤中的应用

1、材料

1.1细胞

实验所用到的HeLa细胞培养方法同实施例2。

1.2试剂

慢病毒pHAGE和lncRNA-3608P包装同实施例2。Transwell小室（8 μm）购于Millipore公司。

2、方法

2.1 Transwell迁移实验

向24孔板每孔中加入500 μL含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基，将Transwell小室置于孔内，放入细胞培养箱平衡30 min。将pHAGE HeLa和lncRNA-3608P HeLa细胞分别消化计数，并用纯DMEM培养基将细胞密度调整为5×10⁴个/mL。每个小室加入200 μL细胞悬液，即每孔为1×10⁴个细胞，每组设置3个复孔。置于培养箱中继续培养，并于培养12 h后取出小室，甲醛固定15 min，结晶紫染色15 min。晾干后在显微镜下拍照，对穿过小室的细胞数量进行计数分析。

2.2 Matrigel侵袭实验

将基质胶和DMEM培养基按体积1：7配成基质胶-DMEM混合液，置于冰上备用。将Transwell小室置于24孔板中，下室加入500μL DMEM培养基，每个小室加入60 μL基质胶-DMEM混合液，于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中凝胶1 h。分别消化pHAGE HeLa和lncRNA-3608PHeLa细胞，计数后用DMEM培养基配制成5×105个/mL的细胞悬液。向每个小室加入200 μL细胞悬液，即每孔1×105个细胞，每组设置3个复孔。将24孔板放入细胞培养箱，于12 h取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，观察进入下室的细胞数量以判断细胞侵袭情况。

3、结果

lncRNA-3608P促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭

通过Transwell小室迁移和Matrigel侵袭实验验证lncRNA-3608P在宫颈癌细胞迁移中的作用，统计结果表明，在细胞铺板12 h后，lncRNA-3608P组穿入小室底部的细胞数量均多于pHAGE组。以上结果提示，过表达lncRNA-3608P可促进宫颈癌细胞（图4A和图4B）的迁移和侵袭。

上述结果表明，lncRNA-3608P的过表达能够明显促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，说明宫颈癌中高水平表达的lncRNA-3608及其编码表达的多肽参与调控肿瘤发生，为宫颈癌及其他肿瘤的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

4、选用卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的细胞，按照各类细胞的培养方法培养，再进行Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验，所得结果均显示lncRNA-3608P的过表达能够明显促进卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌细胞的迁移和侵袭能力，说明卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌中高水平表达的lncRNA-3608及其编码表达的多肽参与调控肿瘤发生，为诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种长链非编码RNA lncRNA-3608及其抗体与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggtcgcgct ctaagtgagg cgccaagcgg tctccgcctc agggtctgag gctgcgaaag 60

gggcgtaacg atgagcggtt cctgccagag gtctggggag gataaaaagc aggaggaaga 120

ggcgacggcg gcctgtggac gtcttgcagg ggtccccgaa gccaagcagg gtcccaaggc 180

cgattcagac tccgacctag agacggaagg tgctcggggc aggggccagg cccgtctcct 240

ccccttgggg gcttctcccg caggggttgt gggaggtggg ctggcgccgc cgaggaggca 300

ggagacctct gtccagcagg gcacgtagcc ctctgcgggg cgtctccagc cccctgccct 360

ctcctcggcg ctcctggcgg catcaggaac tttaccatga gaaggcgctt ctagaaggag 420

gttaaaatgg aaaatcccgc cagacagtgc accaaaggct gtcccgccct gaaatgcaat 480

cagagctggg ttttcccaat ccacagatgt ggacctgttg gagaaccagc tgggagtggc 540

aggagcccag gccctctgtg ccgccctcac agtgaaccag gccatgcgga agatgcagct 600

gtcagggaat ggcctggagg agcaggcggc ccagcacctt gccgaactcc tgctggccca 660

cacagacctg aagtccctgg acctgagcta caaccagctg aatgaccaag caggcagatc 720

tgtgcatggg actgcagggc ttcctcatct tccacagctt tgggggcggc actggctctg 780

ggttcgtgtc tctgctcatg aagcggctct cggtggacta cgggaagaag tccaagctgg 840

agtttgccat ttgcccagcc ccccaggtct ccatggccat gacggagccc tacaactcca 900

tcctgaccac ctacacgacc ctggaacatt ctgactgtgc cttcatagtc gacagcaaag 960

ccacctatga catgtcagca caacctggac atcgagtgtc ccatgtacac caacctcagt 1020

cgtctgggca gatcgtgtcc tccatcacgg cctccctgtg attcgatggg gccctgaatg 1080

tgtacttgac agaattccaa accaacttgg tgccataccc ccacatccac ctccccctgg 1140

ccacctacgc cctggtcatc tcagccaaga aggcctacca tgagcagctg tccgtggcca 1200

agatcgccag tgcccgcttc gagccagcca atcagatggt caagtgtgac cctcaccatg 1260

gcaagtacat ggcctgctgc atgttgtaca gaggggatgt ggtcctgaaa gatgtcagtg 1320

cggctgtcgc caccatcaag agcaagcaca ccaaccagtt tgtggactgg tgtccgattg 1380

gatttaaggt aggactgggt gatgtggagt ccttgtgcca tcaggaagca ggagacctgc 1440

agaataatgc tgcccctgaa ggcccgcatc ctttatggag acaacccctt ttcacgtcag 1500

ctaggttgca aggataataa ttttagtaat ttatttccta ccgccttata ctttaccaaa 1560

tactttatgt tccctcatac cttaaccact accctttaaa gttcatgggg caatattacc 1620

agtatcttac actttagaaa acagaggctg aggctgggca cggtggctca tgcctgtaat 1680

cccagcactt tgggaggcca aggcaggcag atcacgaggt caggagattg agaccatcct 1740

ggctaacacg gtgaaacccc ggctctacta aaaaatacaa aaaattagcc gggtgtggtg 1800

gcagacacct gtggtcccag ctattcggga ggctgaggca ggaggatggc gtgaacccgg 1860

gaggcagagc ttgcagtgag tcgagattgc accactgcac tccagcctgg gcaacagagc 1920

gagactacat ctcaaaaaaa aaaaaaagaa agaaaaagaa aaaagaaaag aaaa 1974

<210> 2

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaaaatc ccgccagaca gtgcaccaaa ggctgtcccg ccctgaaatg caatcagagc 60

tgggttttcc caatccacag atgtggacct gttggagaac cagctgggag tggcaggagc 120

ccaggccctc tgtgccgccc tcacagtgaa ccaggccatg cggaagatgc agctgtcagg 180

gaatggcctg gaggagcagg cggcccagca ccttgccgaa ctcctgctgg cccacacaga 240

cctgaagtcc ctggacctga gctacaacca gctgaatga 279

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> 多肽(Polypeptide)

<400> 3

Met Glu Asn Pro Ala Arg Gln Cys Thr Lys Gly Cys Pro Ala Leu Lys

1 5 10 15

Cys Asn Gln Ser Trp Val Phe Pro Ile His Arg Cys Gly Pro Val Gly

20 25 30

Glu Pro Ala Gly Ser Gly Arg Ser Pro Gly Pro Leu Cys Arg Pro His

35 40 45

Ser Glu Pro Gly His Ala Glu Asp Ala Ala Val Arg Glu Trp Pro Gly

50 55 60

Gly Ala Gly Gly Pro Ala Pro Cys Arg Thr Pro Ala Gly Pro His Arg

65 70 75 80

Pro Glu Val Pro Gly Pro Glu Leu Gln Pro Ala Glu

85 90

Claims (7)

1.一种长链非编码RNA lncRNA-3608，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID No：1所示，所述核苷酸序列中编码多肽的核苷酸序列如SEQ ID No：2，所述编码多肽的核苷酸序列的命名为lncRNA-3608P。

2.根据权利要求1所述的一种长链非编码RNA lncRNA-3608，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：3。

3.含有权利要求1所述的编码多肽的核苷酸序列lncRNA-3608P的过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P。

4.基于权利要求3所述的过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：合成获得SEQ ID No：2序列的目的基因，首部添加一个HA标签；步骤2，用限制性内切酶XhoI和BamH I对目的基因和pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得过表达质粒pHAGE-lncRNA-3608P。

5.基于权利要求3所述的过表达质粒pHAGE-lncRNA-6585P编码的多肽通过免疫反应产生的抗体。

6.权利要求5所述的抗体在制备预防或治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。

7.基于权利要求1所述的lncRNA-3608P在制备预防或治疗宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、胶质瘤、肺癌、胰腺癌或胃癌的产品中的应用。