CN109836492B - 重组肌红蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组肌红蛋白的制备方法。所述方法先通过在pH＝2.0的酸性条件下，蛋白质变性导致卟啉分离制备脱辅基肌红蛋白，再通过pH＝9.5的碱性条件下，脱辅基肌红蛋白复性与锌卟啉的结合制备重组蛋白。本发明制备方法工艺简单、易于控制，制得的重组肌红蛋白对于肌红蛋白能够发出稳定的较强的荧光，其荧光强度要远远强于原肌红蛋白。利用重组肌红蛋白可以制备荧光生物传感器，具有灵敏度高、选择性好等优点，可应用于生物医学研究、环境监测等领域。

Description

重组肌红蛋白的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白质重组技术领域，涉及一种重组肌红蛋白的制备方法。

背景技术

作为生物体的重要成分，蛋白质与多糖、DNA等生物大分子参与了生命活动的每一个过程。在众多类型的蛋白质中，既有结构性(或机械性)蛋白质，如肌肉中的肌动蛋白，细胞骨架中参与形成细胞内支撑网络以维持细胞外形的微管蛋白；也有参与细胞信号传导、免疫反应、细胞黏附和细胞周期调控等的功能蛋白。

作为蛋白质的一类重要辅基，卟啉与蛋白质之间的非共价键相互作用对于在分子和细胞水平上理解卟啉的功能至为重要。卟啉与蛋白以单位点或多位点的结合作用可影响卟啉分子的存在形式，反过来也会使蛋白质的构象发生变化，影响蛋白质的生理功能。

卟啉(Porphyrin)是在母体环卟吩(Porphine)上拥有取代基的一类大环化合物的总称，卟啉分子表面较大且具刚性，是自组装领域中分子砌块的重要类型之一，拥有电子缓冲性、光电磁性、光敏性和高度的化学稳定性以及光谱响应宽等特点。卟啉作为生物分子具有良好的生物亲和性，对身体没有毒害作用，而且生物体中广泛存在卟啉，因此广泛应用于医学方面。无论是将卟啉掺杂还是引入蛋白质中，都可以利用能量转移来获得卟啉单元所发出的饱和红光进行医学分析。

发明内容

本发明为了解决肌红蛋白在荧光条件下发光强度弱的问题，提供一种重组肌红蛋白的制备方法，将肌红蛋白进行脱辅基以及重组，提高肌红蛋白发光强度。

本发明的技术方案如下：

重组肌红蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1、制备脱辅基肌红蛋白：

4℃条件下，取肌红蛋白溶于水中，用HCl溶液调节pH至2.0，静置，然后将溶液用等量丁酮萃取，直至上层丁酮无色为止，取下层浅红色脱辅基肌红蛋白溶液进行透析，低温高速离心取上清液，得到脱辅基肌红蛋白溶液；

步骤2、制备重组肌红蛋白：

取锌卟啉Zn(II)(Deuteroporphyrin IX，C₃₀H₂₈N₄O₄Zn)溶于NaOH溶液中，缓慢搅拌下滴入脱辅基蛋白溶液中，并在冰浴中静置，然后用NaOH溶液将pH调至9.5，再用G25脱盐柱洗脱，得到重组肌红蛋白。

步骤1中，所述的离心速度为8000r/min，离心时间为10min，离心温度为4℃。

步骤1中，所述的透析步骤为先用4℃的5mmol/L NaHCO₃透析两次，每次透析0.5h，透析两次，再用4℃的H₂O透析两次，每次透析1h，最后用4℃的0.1mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析1h。

步骤2中，所述的洗脱溶液为0.1mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液。

本发明制备方法工艺简单、易于控制；制备过程对环境无毒无害；制得的重组肌红蛋白对于肌红蛋白能够发出稳定的较强的荧光，利用重组肌红蛋白可以制备荧光生物传感器，具有灵敏度高、选择性好等优点，广泛地应用到生物医学研究、环境监测等领域，具有实际应用价值。

附图说明

图1为肌红蛋白与脱辅基蛋白的紫外吸收光谱对比图。

图2为pH＝9.0与pH＝9.5的重组肌红蛋白的紫外吸收光谱对比图。

图3为肌红蛋白、脱辅基蛋白与重组肌红蛋白的紫外吸收光谱对比图。

图4是卟啉、肌红蛋白、脱辅基肌红蛋白和重组肌红蛋白的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行清楚、完整的描述，使本专业技术人员更全面地理解本发明。

实施例1

以肌红蛋白为原料，制备重组肌红蛋白，其中脱辅基过程中溶液的pH为2.0：

4℃条件下，称取0.05g肌红蛋白溶于10mL去离子水中，蛋白溶液用1.0mol/L的HCl粗调，再用0.1mol/L的HCl细调，将溶液的pH调整为2.0。静置一小时，将溶液置入分液漏斗中，加入等体积冷丁酮，手摇激烈振荡萃取，静置分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃取几次，直至上层丁酮无色为止。取下层浅红色脱辅基肌红蛋白溶液装入煮好的透析袋中。4℃条件下将脱辅基肌红蛋白放入1L 5mmol/L NaHCO₃透析0.5h两次以除HCl，再用H₂O透析1h两次，以除丁酮，再对4℃200mL 0.1mol/L的pH＝7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析1h，因为在透析过程中会有少量蛋白质沉淀，所以需要取出透析袋倒置两次。取出袋内溶液，将溶液置于离心试管内，置于离心机中离心10min，离心参数为转速8000r/min，温度为4℃。离心后取出上层清液，测量体积，立即存于冰浴中，取样，进行紫外扫描，以0.1mol/L pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液做参比，扫描范围为250-700nm，同时检测卟啉是否完全脱去。

取5mg Zn(II)Deuteroporphyrin IX卟啉(C₃₀H₂₈N₄O₄Zn)溶于1mL 0.01mol/L NaOH溶液中，超声震荡，缓慢搅拌下将卟啉溶液慢慢滴入3mL脱辅基蛋白溶液中，用时30-40min，并在冰浴中静置1h，用1mol/L NaOH粗调溶液和0.1mol/L NaOH细调溶液，将PH调至9.5，溶液变为深红色，再用G25脱盐柱洗脱过量的卟啉以及未重组的脱辅基肌红蛋白，用试管收集重组的蛋白，测量其紫外吸收情况。

对比例1

本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是脱辅基过程中HCl溶液调节肌红蛋白溶液的pH为2.5。

对比例2

本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是脱辅基过程中HCl溶液调节肌红蛋白溶液的pH为1.5。此时由于pH过低，导致蛋白变性，无脱辅基蛋白生成。

对比例3

本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是重组过程中，NaOH调节脱辅基蛋白溶液的pH至10。此时由于pH过高，导致蛋白变性，无脱辅基蛋白生成。

对比例4

本对比例与实施例1基本相同，唯一不同的是重组过程中，NaOH调节脱辅基蛋白溶液的pH至9.0。

图1是肌红蛋白与脱辅基蛋白的紫外吸收光谱对比图，其中脱辅基蛋白的制备条件为pH＝2.0与pH＝2.5。可以发现肌红蛋白在波长为408nm处有很强的卟啉吸收峰，而制备条件为pH＝2.0制备的脱辅基蛋白在408nm处没有吸收峰，制备条件为pH＝2.5制备的脱辅基蛋白在408nm处有弱吸收峰，证明酸性条件下可以脱掉肌红蛋白中的卟啉，而pH＝2.0的条件下脱辅基效果最好，达到完全脱除的效果。

图2是pH＝9.0与pH＝9.5的重组肌红蛋白的紫外吸收光谱对比图。可以发现pH＝9.5的重组肌红蛋白的峰强比pH＝9.0的重组肌红蛋白的峰强弱，说明pH＝9.0的条件下，重组肌红蛋白的产量比较低，证明pH＝9.5的的重组肌红蛋白产量最高。

图3是肌红蛋白、脱辅基蛋白与重组肌红蛋白的紫外吸收光谱对比图。其中脱辅基的条件为pH＝2.0。可以发现重组肌红蛋白在408nm处有很强的吸收峰，肌红蛋白有弱吸收峰，而脱辅基蛋白没有吸收峰，证明肌红蛋白的脱辅基以及重构过程成功。

图4是卟啉、肌红蛋白、脱辅基肌红蛋白和重组肌红蛋白的荧光光谱图。其中脱辅基的条件为pH＝2.0，重组条件为pH＝9.5，在波长为584nm光的激发下，三种蛋白在波长292nm处，均发出一定强度的荧光，可以推测其为蛋白峰。而在波长为406nm处，卟啉、肌红蛋白和重组肌红蛋白具有很强的发光强度，而脱辅基蛋白没有峰，推测其为卟啉的发射光，证明重组成功。

Claims (1)

1.重组肌红蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1、制备脱辅基肌红蛋白：

4℃条件下，取肌红蛋白溶于水中，用HCl溶液调节pH至2.0，静置，然后将溶液用等量丁酮萃取，直至上层丁酮无色为止，取下层浅红色脱辅基肌红蛋白溶液进行透析，低温高速离心取上清液，得到脱辅基肌红蛋白溶液，所述的离心速度为8000 r/min，离心时间为10min，离心温度为4℃；所述的透析步骤为先用4℃的5mmol/L NaHCO₃透析两次，每次透析0.5h，透析两次，再用4℃的 H₂O透析两次，每次透析1h，最后用4℃ 的0.1 mol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液透析1h；

步骤2、制备重组肌红蛋白：

取锌卟啉Zn（II）溶于NaOH溶液中，缓慢搅拌下滴入脱辅基蛋白溶液中，并在冰浴中静置，然后用NaOH溶液将pH调至9.5，再用G25脱盐柱洗脱，得到重组肌红蛋白，所述的洗脱溶液为0.1 mol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液。

Images