CN103962112A - 用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤如下：取聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）和β-环糊精，溶于溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下，加热反应，去除溶剂；将聚乙二醇20000和的琼脂糖的混合物水溶液，加入上述反应物中，震荡至溶解，制备得到水相溶液，备用；将水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加热搅拌反应，静置，弃去上清液，清洗沉积在容器底部的微球，真空干燥，得到凝胶微球；将凝胶微球放入Azo-RGD的甲烷水溶液，室温震荡24小时，用去离子水反复漂洗，N2干燥，得到的微球能模拟细胞在体内的生长环境，实现细胞在微球上吸附、分离可控。

Description

用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法
技术领域
本发明涉及聚合物微球的制备技术，特别涉及一种用反向悬浮聚合法制备光响应智能凝胶微球的方法，所得微球可以用作细胞培养微载体。
背景技术
三维细胞培养技术介于单层细胞培养与动物实验之间，与传统的二维细胞培养(2D)培养相比，其以常见支架三维培养模型为主，更接近体内细胞生长微环境，能更好地模拟细胞在体的生长自然环境，因而在研究细胞生长、分化、迁移等方面更真实可靠。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，体内多种制约因素以及体内和外界环境的相互影响使细胞培养变得复杂化，难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养系统以多种包被表面(Amino、Collagen(TypeIorIV)、Elastin、ProNectin(RGD)、Laminin(YIGSR))的胶原水凝胶为细胞外基质支架，与传统的纳米纤维支架和多孔支架相比，水凝胶支架交联网络中含有大量水分，可以很好地供给细胞养分，同时还可以交联生物活性因子调节细胞的生长和分化，因此可以更好地模拟细胞生长所需的类组织样物理和空间结构，并且可塑性高、制作工艺相对简单、临床应用方便。因此，三维细胞培养技术既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
微凝胶颗粒制备简单，内部可包裹生长因子或其他生物活性分子，可作为三维培养基质应用于细胞培养。南开大学张拥军教授制备了轻度交联的热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺-alt-丙烯酸)(PNIPAM-AA)微凝胶，可以用来作为三维培养支架获得人肝癌细胞HepG2微球，直径在100μm左右。在细胞的分离方面，这些微凝胶也显示了其特有的优势,如浓度为6wt％微凝胶在37℃固化成胶，待温度降至室温时，又逐渐液化，将多细胞微球释放出来。
聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)(PMVE-alt-MAH)和聚乙二醇(PEG)是一类人工合成化合物中少数几种的对人体和动物无毒无害的聚合物，二者相互交联制备的聚合物具有良好的化学稳定性和生物相容性，也可实现化学成分可控，便于进一步的应用和研究。
发明内容
本发明的目的在于为了提供一种用于细胞培养的光可控智能凝胶微球的制备方法，在该微球上培养细胞，可实现吸附和分离可控，工艺简单，周期短，没有任何环境污染，适用于大规模生产。
本发明提供的技术方案如下：
一种用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征包括以下步骤：
(1)水相溶液的制备：取聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)和β-环糊精，溶于溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下，于60-100℃下加热反应8-10小时，旋转蒸发，除去N,N-二甲基甲酰胺；将聚乙二醇20000和琼脂糖的混合物水溶液(水溶液经超声获得)，加入上述反应物中，通过震荡至溶解，聚乙二醇20000的浓度为0.0667-0.2000g/mL，琼脂糖的浓度为0.0031-0.0102g/mL，制备得到水相溶液，以上四种固体混合物的水溶液的浓度为0.1591-0.3450g/mL，备用；
步骤(1)中聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)与β-环糊精按照10:1-50:1的摩尔比混合；聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)与PEG按照50:1-150：1的摩尔比混合；聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)与琼脂糖按15：1:50：1的摩尔比混合；
(2)微球的形成：将步骤(1)得到的水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加热搅拌反应12h～72h，静置，弃去上清液，微球沉积在容器的底部，清洗微球表面的油相，真空干燥，得到凝胶微球，该微球能模拟细胞在体内的生长环境，实现细胞在微球上吸附、分离可控。
水相与油相的体积比为1:10-1:25；搅拌速率为500rpm-2000rpm。油相温度控制在60℃-100℃，这是由于聚乙二醇、琼脂糖和酸进行酯化反应需要在加热环境下进行，由于在两相溶液中，水相的小液滴内发生酯化反应，而机械搅拌促使他们悬浮于油相中，随着水相的挥发，形成O/W相，逐步形成酸和PEG、AG酯化反应后的微球。
偶氮苯羧基化改性的制备(参考文献：Yu-HuiG.,CaoL.,Juan Y.Photoresponsive“SmartTemplate”via HostGuestInteraction for Reversible Cell Adhesion.Macromolecules,2011,44,7499-7502):取4-氨基偶氮苯和丁二酸酐溶于丙酮中，4-氨基偶氮苯：丁二酸酐＝5:6(摩尔比)，再向该溶液中加入无水吡啶，4-氨基偶氮苯：无水吡啶＝1:1(摩尔比)，在60℃下搅拌6小时，过滤，反复洗涤去除溶剂，在50℃下真空干燥48小时，得到改性4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)。
改性4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)与精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)的聚合(Azo-RGD)(参考文献：Z.Zhanget al.Effects of immobilizing sites of RGDpeptides inamphiphilic block copolymers onof cell adhesion.Biomaterials,2010,7873-7882)：将改性4-氨基偶氮苯(Azo-COOH)溶于二氯甲烷(CH2Cl2)，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入溶液中，室温下搅拌24小时，将二氯甲烷旋转蒸发后，加入乙腈(ACN)，溶解聚合物，然后加入精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)搅拌24小时，得到改性4-氨基偶氮苯与精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(Azo-RGD)。
改性4-氨基偶氮苯与精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(Azo-RGD)与本申请制备的凝胶微球的组装(参考文献：Yu-HuiG.,CaoL.,JuanY.Photoresponsive“SmartTemplate”via HostGuest Interaction for Reversible Cell Adhesion.Macromolecules,2011,44,7499-7502):将Azo-RGD溶于甲烷(CH3OH)中，再将溶液滴入去离子水中，形成混合溶液，溶液浓度为1mg/mL(甲烷与水的比例是有无特殊要求，其实是将Azo-RGD溶于甲烷与水的混合溶剂中)，将含β-环糊精的凝胶微球放入混合溶液中，室温震荡24小时，用去离子水反复漂洗，用氮气干燥微球。
偶氮苯有顺(Z)-反(E)-异构体，反式为橙红色棱形晶体，溶于乙醇、乙醚和醋酸，不溶于水。顺式为橙红色片状晶体，不稳定，所以在常温下偶氮苯以反式结构存在。但在365nm波长的紫外光照射下，反式构型的偶氮苯会转变为顺式构型，在可见光或热作用下，顺式构型可回复到反式构型。两种构型的偶氮苯分子具有明显不同的紫外可见吸收光谱。此外，两者的立体结构、偶极矩等一些物理和化学性质亦存在明显差异。
β-环糊精的分子结构为略呈锥形的圆环，外缘亲水而内腔疏水，使其可依据范德华力、疏水相互作用力、主客体分子间的匹配作用等与许多有机和无机分子形成包合物及分子组装体系，这种选择性的包络作用即通常所说的分子识别。因而它与聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)形成的聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精能够提供一个疏水的结合部位，在常温下，Azo-RGD可进入聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精中的疏水内腔，形成主客体包络物，在365nm紫外光照射下，偶氮苯结构由反式转为顺式，可从β-环糊精内腔脱落。实现聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精与Azo-RGD组装与分离光可控。
本申请采用改性4-氨基偶氮苯与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的聚合物Azo-RGD组装微球，是利用RGD更易于被细胞表层整合蛋白所识别和贴附的性质进而促进细胞在微球上粘附，即在常温下，当Azo-RGD与聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精形成主客体包络物时，RGD就可促进细胞在微球上的粘附，当紫外光照射后，Azo-RGD的顺反式结构改变，Azo-RGD从聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精上脱离，即RGD从微球上脱离，这样细胞容易从微球上脱离，通过这种方式实现细胞在微球上的粘附和分离可控。
附图说明
图1是实施例1获得的凝胶微球的光学电子显微镜图，由图可知，所获得的凝胶微球直径在20-100um之间，形貌结构统一。
图2是实施例1获得的凝胶微球放大1000倍的扫描电镜图，由图可得，所获得的凝胶微球直径在20-100um之间，形貌结构统一，表面相对光滑。
图3是实施例1获得的凝胶微球放大300倍的扫描电镜图，由图可得，所获得的凝胶微球直径在20-100um之间，形貌结构统一，表面相对光滑。
图4是实施例1获得的的凝胶微球培养细胞，细胞在微球上培养3天的生长情况的光学电子显微镜图。用二乙酸荧光素(FDA)对微球上的活细胞进行染色，图中微球上绿色亮点即为活细胞。由图可知，细胞在微球上生长良好，即细胞在微球上存活率高。
图5是实施例1获得的凝胶微球培养细胞，细胞在微球上培养3天，经365nm的紫外光照射后，细胞在微球上的生长情况的光学电子显微镜图。用二乙酸荧光素(FDA)对微球上的活细胞进行染色，图中微球上绿色亮点即为活细胞。与图4相比，只有少数细胞吸附于微球上，即大部分细胞从微球上脱离，说明本发明制备的微球可实现细胞吸附和分离可控。
具体实施方式
以下实例所采用的原料来源说明：聚乙二醇20000、β-CD购自国药集团化学试剂有限公司；聚甲基乙烯基醚共聚马来酸酐(PVME-alt-MAH)，琼脂糖，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，对氨基偶氮苯均购自阿拉丁；二甲基硅油，正己烷，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，丁二酸酐，丙酮，二氯甲烷，乙腈均购自国药集团，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自北京伊诺凯科技有限公司。
以下实施例在滴加水相进入油相时，采用“滴”为单位，此处，一滴约为0.3mL。
改性偶氮苯的制备：4-氨基偶氮苯羧基化及其与精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)聚合的制备(Azo-RGD)(参考文献：Z.Zhangetal.Effects of immobilizing sites of RGDpeptides in amphiphilic block copolymers on of celladhesion.Biomaterials,2010,7873-7882)：1.97g4-氨基偶氮苯与1.20g丁二酸酐溶于25mL丙酮中，加入0.97g无水吡啶，在60℃下加热反应6h，经过滤、真空干燥24h，制备羧基化4-氨基偶氮苯Azo-COOH。
取0.137g(0.46mmoL)已制备的Azo-COOH，溶于100mL二氯甲烷中，将0.225g(1.17mmoL)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与0.135g(1.17mmoL)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入上述溶液中，室温下搅拌24h，将二氯甲烷旋转蒸发除净后，加入10mL乙腈溶解聚合物，然后加入0.138g(0.4mmoL)RGD搅拌24h，即得到Azo-RGD。
实施例1
用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法：
(1)水相溶液的制备：取0.7800g(5mmoL)聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)和0.2270g(0.2mmoL)β-环糊精，溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护下，于80℃下加热反应9小时，旋转蒸发，除去N,N-二甲基甲酰胺溶剂；将1.0000g(0.05mmoL)聚乙二醇(20000)和0.0612g(0.2mmoL)琼脂糖(AG)溶于10mL水中，加入上述反应物中，震荡至溶解，制备得到水相溶液，浓度为0.2068g/mL，备用。
(2)微球的形成：称量50ml二甲基硅油倒入100ml高型烧杯中，加热到80℃，在1000rpm的搅拌速度下，用滴管将步骤(2)制备的2.5mL水相溶液缓慢滴入二甲基硅油中，搅拌24h，静置12h，弃掉上清液，用正己烷清洗除去微球表面的油相，真空干燥，得到水凝胶微球。
(3)Azo-RGD与含β-环糊精的凝胶微球的组装(参考文献：Yu-HuiG.,CaoL.,JuanY.Photoresponsive“SmartTemplate”viaHostGuest Interaction for Reversible CellAdhesion.Macromolecules,2011,44,7499-7502)：将0.015gAzo-RGD溶于1.5mL甲烷(CH3OH)中，再将甲烷溶液滴入13.5mL去离子水中，形成混合溶液，溶液浓度为1mg/mL，将含β-环糊精的凝胶微球放入混合溶液中，室温震荡24小时，过滤除去溶液，用去离子水反复漂洗，用氮气干燥微球，常温下，Azo-RGD进入聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)-环糊精中的内腔，形成主客体包络物，细胞因RGD的存在容易粘附在微球上，在365nm紫外光照射下，Azo-RGD由反式转为顺式，从β-环糊精内腔脱落，细胞从微球分离，实现凝胶微球与Azo-RGD的组装与分离的光可控。
实施例2、5所采用的组份以及工艺条件见表1：
表1

Claims (4)

1.一种用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征包括以下步骤：
水相溶液的制备：取聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）和β-环糊精，溶于溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气保护下，于60-100℃下加热反应8-10小时，旋转蒸发，除去N,N-二甲基甲酰胺；将聚乙二醇20000和琼脂糖的混合物水溶液，加入上述反应物中，震荡至溶解，聚乙二醇20000的浓度为0.0667-0.2000g/mL，琼脂糖的浓度为0.0031-0.0102g/mL，制备得到水相溶液，浓度为0.1591-0.3450g/mL，备用；
微球的形成：将步骤（1）得到的水相溶液逐滴滴入到油相二甲基硅油中，加热搅拌反应12h～72h，静置，弃去上清液，微球沉积在容器的底部，清洗微球表面的油相，真空干燥，得到凝胶微球；
Azo-RGD与凝胶微球的组装：将Azo-RGD溶于甲烷中，再将得到的甲烷溶液滴入去离子水中，形成混合溶液，溶液浓度为1mg/mL，将凝胶微球放入混合溶液中，室温震荡24小时，用去离子水反复漂洗，用氮气干燥微球；
细胞的吸附与分离：常温下，将细胞与微球一起培养，Azo-RGD进入聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）-环糊精中的疏水内腔，形成主客体包络物，将细胞吸附在微球上；在365nm紫外光照射下，Azo-RGD由反式转为顺式，从β-环糊精内腔脱落，细胞从微球分离，实现凝胶微球与Azo-RGD的组装与分离的光可控。
2.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤（1）中聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）与β-环糊精按照10:1-50:1的摩尔比混合；聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）与PEG按照50:1-150：1的摩尔比混合；聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐）与琼脂糖按15：1:50：1的摩尔比混合。
3.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤（2）中油相温度控制在60℃-100℃；水相与油相的体积比为1:10-1:25；搅拌速率为500rpm-2000rpm。
4.根据权利要求1所述的用于细胞三维培养的光响应智能凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤（1）中聚乙二醇20000的浓度为0.0667-0.2000g/mL，琼脂糖的浓度为0.0031-0.0102g/mL，制备得到水相溶液的浓度为0.1591-0.3450g/mL。
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