CN109828076A - 一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法 - Google Patents

一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法 Download PDF

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Abstract

一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，属于食品检测技术领域。本发明首先配置苯扎贝特和环丙贝特标准品溶液和制备茶叶样品；对薄层板进行预洗，随后进行HPTLC点样；通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式与薄层板耦合的发光菌株可以方便地实现对样品中多元目标的同时检测。本发明建立了一种快速定量茶叶中降血脂化学药的高效薄层色谱和生物发光法联用的检测方法，具有经济、快速、简便的优点。

Description

一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化 学药掺伪的方法
技术领域
本发明涉及一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，具体涉及一种将HPTLC高通量分离与生物发光抑制成像检测有机融合，应用于不同茶叶产品中非法化学药添加掺伪的高通量筛检的方法，属于食品检测技术领域。
背景技术
日常膳食不科学引发的“富贵病”已经取代致病微生物感染成为人类健康最重要的威胁。其中高血脂是最常见的“富贵病”之一，高血脂不仅直接对人体健康产生严重负面影响，还容易导致例如冠心病、高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等并发症，已成为现代社会人类健康的“隐形杀手”。
茶是世界三大传统饮料之一。除了其被广泛接受的口感，茶的保健功效日益受到食品科技研究者的重视。越来越多的研究证明，茶中含有丰富的多糖、黄酮和多酚等生物活性物质，对调控血脂代谢，缓解高血脂症有良好的效果。
在此背景下，具有良好降血脂功效的保健茶产品的市场空间快速扩张。特别是一些源于药食两用原料的保健茶甚至成为“网红产品”，但是随之而来的食品药品安全问题也井喷式发生。根据媒体和食药监部门披露的案例，一些不法分子为实现产品广告宣传中所声称的降血脂效果，在茶叶中非法添加类似功效且价格低廉的化学药物。苯扎贝特(Benzafibrate, BZF)和环丙贝特(Ciprofibrate, CPF)属于苯氧芳酸类降血脂化学药，其药效原理是通过增强脂蛋白脂酶的活性加速脂蛋白的分解，同时减少肝脏中脂蛋白的合成，从而达到降低血脂的效果。贝特类降血脂化学药功效良好且副作用较小，极易被用于保健茶的掺伪。这些行为不仅涉嫌商业欺诈，而且由于化学药物的添加具有大剂量和随意性的特点，消费者在不知情的前提下，往往会因为暂时的显著效果而长期服用，引起严重的毒害和副作用，甚至危及生命。目前国内还没有针对茶叶中非法化学药掺伪的专门检测项目，因此建立针对茶叶降脂化学药物掺伪的筛查检测方法具有重要的意义。
发光细菌是指在正常生理条件下能够发射可见光的一类微生物。该类细菌的发光原理是在荧光素酶催化和分子氧的作用下，长链脂肪醛和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)被氧化为长链脂肪酸和氧化型黄素单核苷酸(FMN)，同时释放出450-490 nm波长的蓝绿光。基于这一特性，发光细菌常被用来作为生物检测器的光学感应元件。较之常见的理化检测手段，发光细菌生物传感最大的优势在于检测能力的非靶向性：其传感原理并非基于对特定化学结构的识别，而是通过生物发光抑制程度表征目标物毒性高低。更确切地说，当外界环境中存在毒性物质的干扰时，发光细菌的生理过程或细胞呼吸受到影响，导致发光反应受到抑制，而且有毒物质的含量与菌体发光强度变弱的程度呈相关性。
相对于准备工作复杂、周期冗长的斑马鱼、线虫等模式生物的毒性测试方法，发光细菌法的优点在于操作简单(菌体冻干粉复苏后直接使用)和快速高效(最快数分钟之内出结果)，因此具有更广阔的应用前景。目前，基于发光细菌的分析方法已经在欧盟饮用水安全和预警体系中扮演重要的角色。在我国，发光细菌检测技术在“5.12汶川地震”灾区水质应急保障和太湖水质监控等工作中起到了重要作用。
通常，光密度计或者具有发光分析功能的酶标仪是发光细菌法应用的仪器载体。分析人员只需要将菌液与样品混合，经过一段时间的反应后定量检测发光强度变化。这一模式虽然简单高效，但不适合茶叶中西药非法添加检测，因为其存在以下两个严重的缺陷：背景干扰严重。 缺乏对多元目标物的选择性。
HPTLC是目前唯一能与细胞基生物传感器直接联用的色谱工具。和传统的试管法测试不同，与HPTLC的联用可以从根本上解决发光细菌法样品背景干扰强和选择性差的问题。HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光细菌可以方便地实现对样品中多元目标的同时检测。因此，建立在二者联用基础上的分析方法兼备选择性高和通用性好的优点，已经成为分析化学的一个新兴热点前沿，在环境监测和天然产物分析等多个领域扮演重要的角色。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法。
本发明的技术方案，一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，步骤为：配置苯扎贝特和环丙贝特标准品溶液，制备茶叶样品；对薄层板进行预洗，随后进行HPTLC点样；其直接通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光细菌可以方便地实现对样品中多元目标的同时检测。
具体步骤如下：
（1）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10mg的苯扎贝特和10mg的环丙贝特标准品，分别置于10mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1mg/mL的标准储备液；将标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液；标准工作溶液随用随配；
（2）分别制备茶叶样品溶液：取荷叶、罗布麻、银杏叶样品先分别用电动粉碎机均匀粉碎，再称取1.0g粉碎样品加入10 mL甲醇，25℃超声水浴萃取30min，取出后5000r/min离心5min；离心后取上层5mL清液装入注射器，压缩压杆使之通过0.45μm尼龙滤膜，由此制得的样品清液可以直接用于HPTLC点样；
（3）HPTLC点样和色谱条件：首先用100μL点样针手动吸取样品溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5MPa氮气流的协助下吹扫到距离薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100μL/s，预排体积0.2μL，条带宽度6mm，距离两侧边缘至少15mm；对由步骤（1）、（2）制备的每个样品进行点样，一个样品点样结束后，手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，进行下一个样品点样；全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发；
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行，流动相配比乙酸乙酯/甲醇 体积比为9/1，展开距离60 mm；色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3 min，调节相对湿度至35%，薄层板预平衡10 min；待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80℃烘烤5min，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景；
（4）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1mm/s，停留时间2s，随后将浸有工作发光悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40s，间距2min，连续拍摄15张；
（5）分析：将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
进一步的，工作发光悬浮液的制备过程如下：
（1）模拟海水液体配制：
按照以下配方配制模拟海水液体培养基：30g/L NaCl，5g/L Na2HPO4，5g/L KH2PO4，3mL/L甘油，5g/L蛋白胨和5g/L酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解；用1mol/L的氢氧化钠溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.3-7.7，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min，配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天；
（2）发光菌株的培养和保藏：将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100mL液体培养基的三角瓶中；瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中，在25℃环境中100r/min摇瓶培养，得到细菌母液；然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液；工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。
进一步的，步骤（2）所述发光细菌菌种使用琼脂平板法进行保藏，具体如下：
a、发光细菌培养液的制备：取10g琼脂，30g NaCl，5g Na2HPO4，5g KH2PO4, 3mL甘油,5g蛋白胨和5g酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min；待灭菌后的培养基冷却到60℃，趁热在直径10cm的培养皿中倒平板；
b、接种：首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光细菌培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次；接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48 h，待出观察到明显菌落后，得到细菌母液，转移到-4℃环境避光保藏。
进一步的，步骤（2）中，将所用培养基对600nm入射光的吸收度作为测定菌体密度的指标；以新鲜模拟海水液体培养基清液为参比，培养过程中用分光光度计监测培养液对600 nm入射光的吸光度OD600，选取OD600数值达到0.7时培养液作为细菌母液。
进一步的，步骤（3）所述薄层板需要进行预洗；具体步骤如下：首先将10mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5min，取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂，烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。
进一步的，所述薄层板的薄层材料是普通硅胶。
进一步的，步骤（5）具体过程如下：通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF，Black/white linear格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
进一步的，所述发光菌株具体为在正常生理条件下能够发射可见光的一类微生物。该类细菌的发光原理是在荧光素酶催化和分子氧的作用下，长链脂肪醛和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)被氧化为长链脂肪酸和氧化型黄素单核苷酸(FMN)，同时释放出450-490nm波长的蓝绿光。基于这一特性，发光细菌常被用来作为生物检测器的光学感应元件。较之常见的理化检测手段，发光细菌生物传感最大的优势在于检测能力的非靶向性：其传感原理并非基于对特定化学结构的识别，而是通过生物发光抑制程度表征目标物毒性高低。
本发明的有益效果：本发明建立了一种快速定量茶叶中降血脂化学药的高效薄层色谱联用生物发光法的检测方法，具有经济、快速、简便的优点。
附图说明
图1是实施例1-3菌液浸渍-生物发光抑制(伪色彩模式) 条件下的分离结果成像图。
点样轨道：1、BZF，2、CPF，3、荷叶，4、荷叶+标准品，5、银杏叶，6、银杏叶+标准品。
图2 BZF的标准曲线。
图3 CPF的标准曲线。
表1是方法定量检测能力评估。
表2是方法定量准确性评估。
具体实施方式
以下实例中，环丙贝特 (≥ 99%, HPLC)和苯扎贝特 (≥ 96.0%, HPLC)的分析标准品购自Aladdin (上海，中国)。分析纯NaCl, Na2SO4, NaNO3和其他化学试剂购自Sigma-Aldrich。玻璃基板的高效薄层硅胶板(分析型，规格10 × 20 cm，批次号1.05729.0001)购自Merck (Darmstadt, Germany)。薄层板在使用之前用甲醇清洗一次。空白茶叶样品购自当地超市。
以下实施例所述发光细菌为费氏弧菌(Aliivibrio fischeri，菌种保藏编号DSM507)，菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC中国普通微生物菌种中心。
实施例1
（1）模拟海水液体和固体培养基配制：按照以下配方配制模拟海水液体培养基：30 g/LNaCl, 5 g/L Na2HPO4，5 g /L KH2PO4, 3 ml/L 甘油, 5 g/L 蛋白胨,和5 g/L 酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天。
（2）发光菌株的培养和保藏： 将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100 mL液体培养基的三角瓶中。瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中。按照Chen等描述的方法在25℃环境中100r/min摇瓶培养。然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液。工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。
发光细菌菌种使用琼脂平板法进行保藏，其营养琼脂平板制备方法：10 g琼脂，30g NaCl，5 g Na2HPO4，5 g KH2PO4, 3 mL 甘油, 5 g 蛋白胨和5 g酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。待灭菌后的培养基冷却到60℃左右，趁热在直径10 cm的培养皿中倒平板。接种时，首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光细菌培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次。接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48h，待观察到明显菌落后，转移到-4℃环境避光保藏。
（3）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10±0.1 mg的苯扎贝特(Benzafibrate, BZF)和环丙贝特(Ciprofibrate, CPF)标准品，置于10 mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1 mg/mL的标准储备液。标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液。标准工作溶液随用随配。
BZF的标准曲线如图2所示，CPF的标准曲线如图3所示。
（4）薄层板预洗：薄层板固定相中微量的有机物残留会对细菌的生物发光产生显著的负面影响，因此在薄层板使用前需要用甲醇对其进行预清洗。首先将10 mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5 min。取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂。烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。
（5）HPTLC点样和色谱条件：首先用100 μL点样针手动吸取样品适量溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5 MPa氮气流的协助下吹扫到距离由步骤（4）制备的薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100 μL/s，预排体积0.2 μL，条带宽度6 mm，距离两侧边缘至少15mm，条带间距软件自动计算。由步骤（3）制备的每个样品依次进行点样，一个样品点样结束后，手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，再进行下一个样品点样。全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发。
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行。流动相配比乙酸乙酯/甲醇 (9/1, v/v)，展开距离60 mm。色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3min (饱和氯化镁溶液鼓泡调节RH至35%左右)，薄层板预平衡10 min，整个展开过程耗时约25 min。待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80℃烘烤5 min，以挥发残留的有机溶剂，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景。
（6）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1 mm/s，停留时间2 s。随后将浸有工作发光细菌悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40 s，间距2 min，连续拍摄15张。
（7）将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF(Black/white linear)格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
菌液浸渍-生物发光抑制(伪色彩模式) 条件下的分离结果成像图如图1所示。
实施例2
（1）模拟海水液体和固体培养基配制：按照以下配方配制模拟海水液体培养基：30 g/LNaCl, 5 g/L Na2HPO4，5 g /L KH2PO4, 3 ml/L 甘油, 5 g/L 蛋白胨,和5 g/L 酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天。
（2）发光菌株的培养和保藏： 将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100 mL液体培养基的三角瓶中。瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中。按照Chen等描述的方法在25℃环境中100 r/min摇瓶培养。然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液。工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。
发光细菌菌种使用琼脂平板法进行保藏，其营养琼脂平板制备方法：10 g琼脂，30g NaCl，5 g Na2HPO4，5 g KH2PO4, 3 mL 甘油, 5 g 蛋白胨和5 g酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。待灭菌后的培养基冷却到60℃左右，趁热在直径10 cm的培养皿中倒平板。接种时，首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光细菌培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次。接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48h，待出观察到明显菌落后，转移到-4℃环境避光保藏。
（3）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10±0.1 mg的苯扎贝特(Benzafibrate, BZF)和环丙贝特(Ciprofibrate, CPF)标准品，置于10 mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1 mg/mL的标准储备液。标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液。标准工作溶液随用随配。
BZF的标准曲线如图2所示，CPF的标准曲线如图3所示。
（4）样品制备：荷叶样品先用电动粉碎机均匀粉碎，再称取1.0 g粉碎样品加入10mL甲醇，25℃超声水浴萃取30 min，取出后5000r/min离心5 min。离心后取上层约5 mL清液装入注射器，压缩压杆使之通过0.45 μm尼龙滤膜，由此制得的样品清液可以直接用于HPTLC点样。
（5）薄层板预洗：薄层板固定相中微量的有机物残留会对细菌的生物发光产生显著的负面影响，因此在薄层板使用前需要用甲醇对其进行预清洗。首先将10 mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5 min。取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂。烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。
（6）HPTLC点样和色谱条件：首先用100 μL点样针手动吸取样品适量溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5 MPa氮气流的协助下吹扫到距离由步骤（5）制备的薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100 μL/s，预排体积0.2 μL，条带宽度6 mm，距离两侧边缘至少15mm，条带间距软件自动计算。由步骤（3）、（4）制备的每个样品依次进行点样，一个样品点样结束后，手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，进行下一个样品点样。全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发。
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行。流动相配比乙酸乙酯/甲醇 (9/1, v/v)，展开距离60 mm。色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3min，调节相对湿度至35%，薄层板预平衡10 min，整个展开过程耗时约25 min。待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80℃烘烤5 min，以挥发残留的有机溶剂，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景。
（7）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1 mm/s，停留时间2 s。随后将浸有发光细菌悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40 s，间距2 min，连续拍摄15张。
（8）将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF(Black/white linear)格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
菌液浸渍-生物发光抑制(伪色彩模式) 条件下的分离结果成像图如图1所示。
实施例3
（1）模拟海水液体和固体培养基配制：按照以下配方配置模拟海水液体培养基：30 g/LNaCl, 5 g/L Na2HPO4，5 g /L KH2PO4, 3 ml/L 甘油, 5 g/L 蛋白胨,和5 g/L 酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天。
（2）发光菌株的培养和保藏： 将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100 mL液体培养基的三角瓶中。瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中。按照Chen等描述的方法在25℃环境中100 r/min摇瓶培养。然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液。工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。
发光细菌菌种使用琼脂平板法进行保藏，其营养琼脂平板制备方法：10 g琼脂，30g NaCl，5 g Na2HPO4，5 g KH2PO4, 3 ml 甘油, 5 g 蛋白胨和5 g酵母提取物。加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1 mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min。待灭菌后的培养基冷却到60℃左右，趁热在直径10 cm的培养皿中倒平板。接种时，首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光细菌培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次。接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48h，待出观察到明显菌落后，转移到-4℃环境避光保藏。
（3）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10±0.1 mg的苯扎贝特(Benzafibrate, BZF)和环丙贝特(Ciprofibrate, CPF)标准品，置于10 mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1 mg/mL的标准储备液。标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液。标准工作溶液随用随配。
BZF的标准曲线如图2所示，CPF的标准曲线如图3所示。
（4）样品制备：银杏叶样品先用电动粉碎机均匀粉碎，再称取1.0 g粉碎样品加入10 mL甲醇，25℃超声水浴萃取30 min，取出后5000r/min离心5 min。离心后取上层约5 mL清液装入注射器，压缩压杆使之通过0.45 μm尼龙滤膜，由此制得的样品清液可以直接用于HPTLC点样。
（5）薄层板预洗：薄层板固定相中微量的有机物残留会对细菌的生物发光产生显著的负面影响，因此在薄层板使用前需要用甲醇对其进行预清洗。首先将10 mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5 min。取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂。烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。
（6）HPTLC点样和色谱条件：首先用100 μL点样针手动吸取样品适量溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5 MPa氮气流的协助下吹扫到距离由步骤（5）制备的薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100 μL/s，预排体积0.2 μL，条带宽度6 mm，距离两侧边缘至少15mm，条带间距软件自动计算。由步骤（3）、（4）制备的每个样品依次点样，一个样品点样结束后，手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，进行下一个样品点样。全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发。
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行。流动相配比乙酸乙酯/甲醇 (9/1, v/v)，展开距离60 mm。色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3min，调节相对湿度至35% (饱和氯化镁溶液鼓泡调节，薄层板预平衡10 min，整个展开过程耗时约25 min。待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80 ℃烘烤5 min，以挥发残留的有机溶剂，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景。
（7）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1 mm/s，停留时间2 s。随后将浸有发光细菌悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40 s，间距2 min，连续拍摄15张。
（8）将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF(Black/white linear)格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
菌液浸渍-生物发光抑制(伪色彩模式) 条件下的分离结果成像图如图1所示。
实施例4
步骤（4）中所述样品选用罗布麻，其余步骤同实施例3。
实施例5
对实施例1-4所述方法检测能力进行评估，定量检测能力评估具体结果如表1所示，定量准确性评估如表2所示。
表1 方法定量检测能力评估
表2 方法定量准确性评估
。

Claims (9)

1.一种高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于步骤为：配置苯扎贝特和环丙贝特标准品溶液，制备茶叶样品；对薄层板进行预洗，随后进行HPTLC点样；通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异移动到薄层板上不同的位置形成物理隔离；随后，通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光菌株方便地实现对样品中多元目标的同时检测。
2.根据权利要求1所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）标准溶液配制：用电子天平分别精确称量10mg的苯扎贝特和10mg的环丙贝特标准品，分别置于10mL容量瓶，甲醇定容，得到浓度为1mg/mL的标准储备液；将标准储备液平时避光静置在4℃环境，待临近分析工作开始，取出0.2 mL置于10 mL容量瓶，甲醇定容稀释，得到浓度为0.02 mg/mL的标准工作溶液；标准工作溶液随用随配；
（2）分别制备茶叶样品溶液：取荷叶、罗布麻、银杏叶样品先分别用电动粉碎机均匀粉碎，再称取1.0g粉碎样品加入10 mL甲醇，25℃超声水浴萃取30min，取出后5000r/min离心5min；离心后取上层5mL清液装入注射器，压缩压杆使之通过0.45μm尼龙滤膜，由此制得的样品清液直接用于HPTLC点样；
（3）HPTLC点样和色谱条件：首先用100μL点样针手动吸取样品溶液，通过半自动薄层点样仪在0.5MPa氮气流的协助下吹扫到距离薄层板底端10 cm的位置，液流吹扫速度100μL/s，预排体积0.2μL，条带宽度6mm，距离两侧边缘至少15mm；对由步骤（1）、（2）制备的每个样品进行点样，一个样品点样结束后手动取出点样针，用甲醇清洗三次后，进行下一个样品点样；全部样品点样结束后，取出薄层板，用电吹风加热1 min，目的是使附着在点样位置的残留甲醇挥发；
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行，流动相配比乙酸乙酯/甲醇 体积比为9/1，展开距离60 mm；色谱分离条件：通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度，持续3 min，调节相对湿度至35%，薄层板预平衡10 min；待流动相前沿到达预定高度，系统自动结束，将薄层板取出，放在薄层加热器上80℃烘烤5min，以便获得明亮、低噪音的生物发光成像背景；
（4）生物发光成像检测：使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液，浸渍速度1mm/s，停留时间2s，随后将浸有工作发光悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测，成像曝光时间40s，间距2min，连续拍摄15张；
（5）分析：将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
3.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于工作发光悬浮液的制备过程如下：
（1）模拟海水液体配制：
按照以下配方配制模拟海水液体培养基：30g/L NaCl，5g/L Na2HPO4，5g/L KH2PO4，3mL/L甘油，5g/L蛋白胨和5g/L酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解；用1mol/L的氢氧化钠溶液将配好的液体培养基pH值调节至7.3-7.7，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min，配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用，不用时在4℃环境下可保存7天；
（2）发光菌株的培养和保藏：将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到盛有步骤（1）制备的100mL液体培养基的三角瓶中；瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口，确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中，在25℃环境中100r/min摇瓶培养，得到细菌母液；然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基，制得工作发光悬浮液；工作发光悬浮液不用时，可在4℃环境中保存3天。
4.根据权利要求3所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（2）所述发光菌株使用琼脂平板法进行保藏，具体如下：
a、发光菌株培养液的制备：取10g琼脂，30g NaCl，5g Na2HPO4，5g KH2PO4, 3mL甘油, 5g蛋白胨和5g酵母提取物，加入1 L超纯水搅拌溶解后，用1mol/L氢氧化钠水溶液将配好的液体培养液pH值调节至7.5±0.2，再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min；待灭菌后的培养液冷却到60℃，趁热在直径10cm的培养皿中倒平板；
b、接种：首先将灭菌后的接种环浸入成熟的发光菌株培养液中，然后在营养琼脂表面划斜线，反复多次；接种后的营养琼脂置于25℃环境避光培养48 h，待观察到明显菌落后，得到细菌母液，转移到-4℃环境避光保藏。
5.根据权利要求3所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（2）中，将所用培养基对600nm入射光的吸收度作为测定菌体密度的指标；以新鲜模拟海水液体培养基清液为参比，培养过程中用分光光度计监测培养液对600 nm入射光的吸光度OD600，选取OD600数值达到0.7时培养液作为细菌母液。
6.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（3）所述薄层板需要进行预洗；具体步骤如下：首先将10mL甲醇倒入洁净展开缸中，放入空白薄层板，使其展开到顶端，为使杂质尽可能被清洗干净，薄层板展开至顶端后需保持5min，取出后将薄层板放在薄层板加热器上100℃烘干5min，挥发残留有机溶剂，烘干后的薄层板用铝箔纸包裹备用。
7.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：所述薄层板的薄层材料是普通硅胶。
8.根据权利要求2所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：步骤（5）具体过程如下：通过生物发光成像仪拍摄的照片保存为CPF，Black/white linear格式，然后用Videoscan软件打开，对图片中的像素灰度进行数字化，然后设定积分参数和条件进行定量分析。
9.根据权利要求1所述高效薄层色谱联用生物发光法筛查茶叶中贝特类降脂化学药掺伪的方法，其特征在于：所述发光菌株具体为在正常生理条件下能够发射可见光的一类微生物。
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