CN110231429A - 一种高效薄层色谱联用生物发光法筛检硝苯地平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效薄层色谱联用生物发光法筛检硝苯地平的方法,属于食品检测技术领域。本发明采用高效薄层色谱与生物发光法进行联用;先将待测样品在薄层板上展开,之后与发光细菌耦合,再经过发光成像,最后用薄层色谱扫描。本发明方法可检测多个样品,一次最多可检测20个样品,单次实验时长为30min,而采用HPLC法一次只能检测一个样品,单次实验时长为20min;与现有的高效液相法相比,本发明方法可实现快速筛检,且单次实验同时检测多种样品,实现高通量筛检;本发明方法的回收率96.8%‑98.7%,检测限可达到0.5~1μg/kg,检测方法可实现重复性RSD<2.3%,具有经济、快速、简便的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效薄层色谱联用生物发光法筛检硝苯地平的方法,属于食品检测技术领域。
背景技术
硝苯地平(Nifedipine,NDP)属于二氢吡啶类的抗高血压化学药,其药效原理是其为钙拮抗剂,可选择性抑制钙离子进入心肌细胞和平滑肌细胞的跨膜转运,并抑制钙离子从细胞内释放,而不改变血浆钙离子浓度,从而达到降低血压的效果。硝苯地平类降血压化学药功效良好且副作用较小,极易被用于保健茶的掺伪。在保健品市场中,源于药食两用材料的降血压保健品占据很大的份额。根据媒体和食药监部门披露的案例,一些不法分子为实现产品广告宣传中所声称的降血压降糖效果,在降血压保健品中非法添加西药硝苯地平,在降糖保健品中非法掺入西药苯乙双胍。这些行为不仅涉嫌商业欺诈,而且由于化学药物的添加具有大剂量和随意性的特点,消费者在不知情的前提下,往往会因为暂时的显著效果而长期服用,引起严重的毒害及其副作用,严重时甚至会危及生命。目前国内还没有针对这些药物中非法化学药掺伪的专门检测项目,因此建立针对降血压保健品中西药非法掺伪的筛查检测方法具有重要的意义。
目前,食品药品中硝苯地平常用检测方法为高效液相色谱法,此方法样品的前处理复杂,需要将样品中大多数杂质去除,且检测时间较长,一般一个样品需要20min,而且实验前需要进行长时间的系统平衡,测定过程只能逐一进行样品检测。
发光细菌是一类正常生理条件下能够发射可见光的微生物。其发光原理是在荧光素酶催化和分子氧的作用下,长链脂肪醛和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)被氧化为长链脂肪酸和氧化型黄素单核苷酸(FMN),同时释放出450-490nm波长的蓝绿光。基于发光细菌这一特性,常被用来作为生物检测器的光学感应元件。较之常见的理化检测手段,发光细菌最大的优势在于检测能力的非靶向性:其传感原理并非基于对特定化学结构的识别,而是通过生物发光抑制程度表征目标物毒性高低,即当外界环境中存在毒性物质的干扰时,发光细菌的生理过程或细胞呼吸受到影响,导致发光反应受到抑制,而且有毒物质的含量与菌体发光强度变弱的程度呈相关性。
相对于准备工作复杂、周期冗长的斑马鱼、线虫等模式生物的毒性测试方法,发光细菌法的优点在于操作简单(菌体冻干粉复苏后直接使用)和快速高效(最快数分钟之内出结果),因此具有更广阔的应用前景。目前,基于发光细菌的分析方法已经在欧盟饮用水安全和预警体系中扮演重要的角色。在我国,发光细菌检测技术在“5.12汶川地震”灾区水质应急保障和太湖水质监控等工作中起到了重要作用。
通常,光密度计或酶标仪是发光细菌法应用的仪器载体。分析人员只需要将菌液与样品混合,经过一段时间的反应后定量检测发光强度变化。这一模式虽简单高效,但不适合茶叶中西药非法添加检测,因为其存在以下缺陷:①背景干扰严重。②缺乏对多元目标物的选择性。
目前HPTLC是唯一能与细胞基生物传感器直接联用的色谱工具。和传统的试管法不同,与HPTLC的联用可以从根本上解决发光细菌法样品背景干扰强和选择性差的问题。HPTLC分离可使原本混在一起的目标物按分子结构的差异展开到薄层板上不同的位置形成物理隔离;随后,通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光细菌可以方便地实现对样品中多元目标的同时检测。因此,建立在二者联用基础上的分析方法具有选择性高和通用性好的优点,已经成为分析化学的一个新兴热点前沿,在环境监测和天然产物分析等多个领域扮演重要的角色。
发明内容
针对上述问题,本发明直接通过HPTLC分离使原本混在一起的目标物按分子结构的差异在薄层板上展开到不同的位置形成物理隔离;随后,通过浸渍方式使与薄层板耦合的发光细菌可以快速地实现对样品中多元目标的同时检测。
本发明的第一个目的是提供一种高效薄层色谱检测方法,所述方法是将高效薄层色谱与生物发光法进行联用。
在本发明一种实施方式中,具体步骤为:先将待测样品在薄层板上展开,之后与发光细菌耦合,再经过发光成像,最后用薄层色谱扫描。
在本发明一种实施方式中,所述薄层板包括硅胶板、纤维素板、酸性氧化铝板和碱性氧化铝板。
在本发明一种实施方式中,所述发光细菌包括:(1)嗜冷发光杆菌,CGMCC 1.8932;(2)印度发光杆菌CGMCC 1.8728;(3)水发光杆菌,CGMCC 1.12159。
在本发明一种实施方式中,成像曝光时间分别为20~50s。
本发明的第二个目的是提供一种上述方法在化合物检测领域的应用。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述的方法检测含有硝苯地平的样品。
在本发明一种实施方式中,所述展开剂为甲苯和乙酸乙酯混合溶液,甲苯和乙酸乙酯体积比为4:6。
在本发明一种实施方式中,所述薄层板包括硅胶板、纤维素板、酸性氧化铝板和碱性氧化铝板,优选地,薄层板为硅胶板和纤维素板。
在本发明一种实施方式中,所述发光细菌包括:所述发光细菌包括:(1)嗜冷发光杆菌CGMCC 1.8932;(2)印度发光杆菌CGMCC 1.8728;(3)水发光杆菌,CGMCC 1.12159,优选地,发光细菌为嗜冷发光杆菌CGMCC 1.8932。
在本发明一种实施方式中,耦合条件为:发光细菌在24~26℃环境中80~150r/min摇瓶培养10~16h,得到细菌悬浮液,用量为80~120mL,耦合时间为1~3s,温度为24~26℃,pH为6.5~7.5。
在本发明一种实施方式中,发光成像条件为:成像曝光时间分别为20~50s,间隔1~3min,拍摄照片至少10张,优选地,成像曝光时间为20~40s。
在本发明一种实施方式中,所述薄层色谱扫描条件为:通过videoscan软件对获得的数字化图像进行模拟扫描,可以实现检测结果的准确定量分析。
在本发明一种实施方式中,待测样品为保健品、食品或药品。
本发明的有益效果:
本发明建立了一种高效薄层色谱联用生物发光法筛检硝苯地平的方法,本发明方法可检测多个样品,一次最多可检测20个样品,单次实验时长为30min,而采用HPLC法一次只能检测一个样品,单次实验时长为20min。因此,与现有的高效液相法相比,本发明方法可实现快速筛检,且单次实验同时检测多种样品,实现高通量筛检;本发明方法的回收率96.8%-98.7%,检测限可达到0.5~1μg/kg,检测方法可实现重复性RSD<2.3%,具有经济、快速、简便的优点。
附图说明
图1为不同剂量硝苯地平对生物发光抑制的线性关系。
图2为不同材料的薄层板和发光细菌的耦合效果,其中,点样轨道:1,硅胶板;2,纤维素板;3,酸性氧化铝板;4,碱性氧化铝板。
图3为不同发光细菌和薄层板的耦合效果,其中,点样轨道:1,嗜冷发光杆菌CGMCC1.8932;2,印度发光杆菌CGMCC 1.8728;3,水发光杆菌,CGMCC 1.12159。
图4为不同曝光时间的拍摄效果图。
图5为显影后的样品和标品生物发光图像,其中,点样轨道:1,保健品一,2,保健品一+硝苯地平标准溶液,3~4硝苯地平标准溶液,5,保健品二,6,保健品二+硝苯地平标准溶液。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解实施例是为了更好地解释本发明,不用于限制本发明。
实施例1:高效薄层色谱联用生物发光法的工作发光悬浮液的制备
工作发光悬浮液的制备过程如下:
(1)模拟海水液体配制:
按照以下配方配置模拟海水液体培养基:30g/L NaCl,5g/L Na2HPO4,5g/LKH2PO4,3mL/L甘油,5g/L蛋白胨和5g/L酵母提取物;加入1L超纯水搅拌溶解后,用1mol/L的氢氧化钠水溶液将配好的液体培养基pH值调节至7,再使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌处理15min,配制好的液体培养基封装置于冰箱中冷藏备用,不用时在4℃环境下可保存7天;
(2)发光细菌的培养和保藏:
将用甘油冷冻保藏的发光细菌接种到装有步骤(1)制备的100mL液体培养基的三角瓶中;瓶口用灭菌的四层折叠锡箔纸包裹瓶口,确保培养过程中外界氧气能够进入瓶中,在25℃环境中100r/min摇瓶培养,得到细菌母液;然后在成熟的细菌母液中加入等体积的新鲜液体培养基,制得工作发光悬浮液;工作发光悬浮液不用时,可在4℃环境中保存3天。
实施例2:基于高效薄层色谱联用生物发光法的标准曲线的绘制
(1)标准溶液配制:用电子天平精确称量50mg的硝苯地平标准品,置于10mL容量瓶,甲醇定容,得到浓度为5mg/mL的标准储备液;将标准储备液平时避光静置在4℃环境,待临近分析工作开始,取出1mL置于10mL容量瓶,甲醇定容稀释,得到浓度为0.5mg/mL的标准工作溶液;标准工作溶液每次检测之前都要重新配置;
(2)将制得的标准溶液直接用于HPTLC点样;
(3)色谱分离:首先用100μL点样针手动吸取待检溶液,在0.5MPa氮气流的协助下通过半自动薄层点样仪定量吹扫到距离薄层板底端10mm的位置,液流吹扫速度100nL/s,预排体积0.2μL,条带宽度6mm,距离两侧边缘至少15mm;对由步骤(1)、(2)制备的每个样品进行点样,一个样品点样结束后手动取出点样针,用甲醇清洗三次后,进行下一个样品点样;全部样品点样结束后,取出薄层板,用电吹风烘干1min,目的是使点样原点里残留甲醇挥发,使之不影响后续步骤;
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行,流动相为甲苯/乙酸乙酯混合物,体积比为4/6,v/v,展开距离60mm;色谱条件:通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度,持续3min,调节相对湿度至35%,薄层板预平衡10min;待流动相前沿到达预定高度,系统自动结束,将薄层板取出,放在薄层加热器上80℃烘烤5min,以便挥发去除薄层上残留的有机溶剂;
(4)生物发光成像检测:使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液,浸渍速度1mm/s,停留时间2s,随后将浸有工作发光悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测,成像曝光时间40s,每次拍照间距2min,连续拍摄15张;
(5)分析:将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存,然后用Videoscan软件打开,对图片中的像素极性数字化解析得到可处理的色谱图,然后设定积分参数和条件进行定量分析。
不同剂量硝苯地平对生物发光抑制的线性关系如图1所示,当硝苯地平浓度为0.05~0.30mg/g时,硝苯地平浓度与色谱峰面积呈线性关系,线性方程为y=39.127x-479.432,R2=0.99752,检测限为0.5~1μg/kg。
实施例3:高效薄层色谱联用生物发光法的条件优化
1、不同硅胶板对检测结果的影响
该方法检测原理是:所述发光菌株具体为在正常生理条件下能够发射可见光的一类微生物。该类细菌的发光原理是在荧光素酶催化和分子氧的作用下,长链脂肪醛和还原型黄素单核苷酸(FMNH2)被氧化为长链脂肪酸和氧化型黄素单核苷酸(FMN),同时释放出450-490nm波长的蓝绿光。基于这一特性,发光细菌常被用来作为生物检测器的光学感应元件。较之常见的理化检测手段,发光细菌生物传感最大的优势在于检测能力的非靶向性:其传感原理并非基于对特定化学结构的识别,而是通过生物发光抑制程度表征目标物毒性高低。
实验过程如下:
(1)分别制备降血压保健品萃取液:称取降血压保健品粉末1.0g加入10mL甲醇,25℃超声水浴萃取30min,取出后5000转/min离心10min,离心后取上层5mL清液通过0.45μm尼龙滤膜过滤,由此制得的样品清液直接用于HPTLC点样;
(2)色谱分离:首先用100μL点样针手动吸取待检溶液,在0.5MPa氮气流的协助下通过半自动薄层点样仪定量吹扫到距离薄层板底端10mm的位置,液流吹扫速度100nL/s,预排体积0.2μL,条带宽度6mm,距离两侧边缘至少15mm;对由步骤(1)、(2)制备的每个样品进行点样,一个样品点样结束后手动取出点样针,用甲醇清洗三次后,进行下一个样品点样;全部样品点样结束后,取出薄层板,用电吹风烘干1min,目的是使点样原点里残留甲醇挥发,使之不影响后续步骤;所述薄层板材料,包括(1)硅胶板;(2)纤维素板;(3)酸性氧化铝板;(4)碱性氧化铝板;
色谱分离在全自动薄层展开仪中进行,流动相为甲苯/乙酸乙酯混合物,体积比为4/6,v/v,展开距离60mm;色谱条件:通过饱和氯化镁溶液鼓泡控制展开缸内相对湿度,持续3min,调节相对湿度至35%,薄层板预平衡10min;待流动相前沿到达预定高度,系统自动结束,将薄层板取出,放在薄层加热器上80℃烘烤5min,以便挥发去除薄层上残留的有机溶剂;
(3)生物发光成像检测:使用自动浸渍装置将展开、干燥后的薄层板浸入工作发光悬浮液,浸渍速度1mm/s,停留时间2s,随后将浸有工作发光悬浮液的薄层板放入生物发光成像仪中成像检测,成像曝光时间40s,每次拍照间距2min,连续拍摄15张;发光细菌选用嗜冷发光杆菌CGMCC 1.8932;
(4)分析:将通过生物发光成像仪拍摄的照片保存,然后用Videoscan软件打开,对图片中的像素极性数字化解析得到可处理的色谱图,然后设定积分参数和条件进行定量分析。
采用四种不同材料的薄层板与发光细菌嗜冷发光杆菌耦合效果图见图2。由图2可知,采用纤维素、酸性氧化铝和碱性氧化铝材料的薄层板与发光细菌耦合后条带成像不清楚,硅胶板材料的薄层板显现出清晰的条带,说明最适合筛检硝苯地平的固定相为硅胶板。
2、不同发光细菌对检测结果的影响
采用上述优选的薄层板,区别在于:所述发光细菌包括:(1)嗜冷发光杆菌CGMCC1.8932;(2)印度发光杆菌CGMCC 1.8728;(3)水发光杆菌,CGMCC 1.12159,其它步骤和参数同实施例3第一部分,采用几种不同菌株的发光细菌与硅胶板耦合效果图见图3。
由图3可知,采用印度发光杆菌和水发光杆菌的发光细菌与薄层板耦合后条带成像不清楚,嗜冷发光杆菌的发光细菌显现出清晰的条带,说明最适合筛检硝苯地平的发光细菌为嗜冷发光杆菌。
3、不同曝光条件的影响
采用上述优选的薄层板和发光细菌,区别在于:成像曝光时间分别为50s,40s,30s,20s,其它步骤和参数同实施例3第一部分。通过选取不同条件的曝光时间进行成像,结果如图4所示,说明适合筛检硝苯地平最佳曝光时间为40s。
实施例5高效薄层色谱联用生物发光法的性能测试
样品测试步骤如下:
(1)重复性实验
采用上述优选的检测方法,分别检测50mg/kg、70mg/kg、90mg/kg和110mg/kg的样品,每个浓度重复10次,计算标准偏差、相对标准偏差及变异系数。结果如表1示,测定结果CV均小于2.3%,表明在线性范围内,该方法具有较好的重复性。
表1重复性实验
(2)加标回收实验
向样品中中添加不同浓度的硝苯地平标准品,采用上述优选的高效液相薄层色谱联用生物法进行检测,样品和标品展开图如图5所示,每个浓度平行测定5次,取平均值,并与HPLC方法相比较,测得的加标回收率结果如表2所示,平均回收率为98%,且检测结果整体与HPLC结果都相符,说明该试纸条具有良好的准确性。
表2加标回收率
另外,本发明方法可检测多个样品,一次最多可检测20个样品,单次实验时长为30min,而采用HPLC法一次只能检测一个样品,单次实验时长为20min。在两种方法准确性相当的情况下,本发明方法可实现快速筛检,单次实验可同时检测20个样品,实现了高通量筛检,具有经济、快速、简便的优点。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种高效薄层色谱检测方法,其特征在于,所述方法是将高效薄层色谱与生物发光法进行联用;具体方法为:先将待测样品在薄层板上展开,之后与发光细菌耦合,再经过发光成像,最后用薄层色谱扫描。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述薄层板包括硅胶板、纤维素板、酸性氧化铝板和碱性氧化铝板。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发光细菌包括:(1)嗜冷发光杆菌,CGMCC 1.8932;(2)印度发光杆菌CGMCC 1.8728;(3)水发光杆菌,CGMCC 1.12159。
4.权利要求1~3任一所述的方法在化合物检测领域的应用。
5.一种筛检硝苯地平的方法,其特征在于,采用权利要求1所述的方法检测含有硝苯地平的待测样品。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述展开是采用甲苯和乙酸乙酯混合溶液作为展开剂。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,甲苯和乙酸乙酯体积比为4:6。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,耦合条件为:发光细菌在24~26℃环境中80~150r/min摇瓶培养10~16h,得到细菌悬浮液,用量为80~120mL,耦合时间为1~3s,温度为24~26℃,pH为6.5~7.5。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,发光成像条件为:成像曝光时间分别为20~50s,间隔1~3min,拍摄照片至少10张。
10.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,待测样品为保健品、食品或药品。
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CN110231429B (zh) | 2020-06-16 |
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