CN109824582B

CN109824582B - 一种丙氨酸衍生物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109824582B
Application number: CN201910049979.4A
Authority: CN
Inventors: 张�杰; 潘晓艳; 梁丽媛; 卢闻; 王嗣岑; 贺浪冲; 司茹; 王瑾
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2039-01-18
Also published as: CN109824582A

Abstract

一种丙氨酸衍生物及其制备方法和应用，以联苯吡啶为铰链区结合片段，并采用片段药物的设计策略，引入L‑丙氨酸为柔性Linker，以构建具有激酶抑制活性的化合物库，并通过ADP‑Glo的激酶活性筛选发现具有Bcr‑Abl激酶抑制活性的酪氨酸激酶抑制剂。该化合物能够用于制备抗肿瘤(慢性粒细胞白血病)药物中，具有抑制Bcr‑Abl、Bcr‑Abl^T315I激酶活性，并且对K562细胞具有细胞增值抑制活性。引入丙氨酸结构对化合物的抑制活性具有重要的作用，可扩展激酶抑制剂结构多样性，活性结果显示该结构可以作为Bcr‑Abl酪氨酸激酶抑制剂的Linker药效片段。

Description

一种丙氨酸衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种丙氨酸衍生物及其制备方法和应用

背景技术

慢性粒细胞白血病(CML)是一种发生于骨髓造血干细胞的恶性克隆增生性疾病，在成年白血病患者中所占比例高达15％～20％，其特征是CML患者体内能检测出Ph染色体。Ph染色体是由人体正常的22号染色体和9号染色体相互易位形成的断裂点聚集簇-艾尔贝逊(BCR-ABL)融合基因，此融合基因编码产生酪氨酸激酶活性持续激活的Bcr-Abl融合蛋白。目前市场上上市了针对Bcr-Abl为靶标的小分子酪氨酸激酶抑制剂，但都存在耐药性以及其他临床不良反应等问题。随之，研究与开发新型的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂已成为药学领域的热点之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丙氨酸衍生物及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种丙氨酸衍生物，该丙氨酸衍生物的结构式如下：

其中，R为

一种丙氨酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1)5-溴-2-氨基吡啶与酰氯化合物发生酰化反应制备被酰化的5-溴-2-氨基吡啶；

2)N₂保护下，5-溴烟酸、氯化亚砜以及胺类化合物发生反应制备氨化的5-溴烟酸；

3)在四三苯基膦钯催化下，酰化的5-溴-2-氨基吡啶或氨化的5-溴烟酸与间羧基苯硼酸发生Suzuki偶联反应得到吡啶-苯化合物；

4)Boc-L-丙氨酸与3-三氟甲基-4-氯苯胺缩合生成叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯；

5)叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯脱掉Boc保护基生成(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺；

6)吡啶-苯化合物与(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺缩合生成丙氨酸衍生物。

本发明进一步的改进在于，所述的步骤1)的具体过程为：将5-溴-2-氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺，在冰浴条件下，滴加酰氯化合物，待滴加完毕后，升至室温反应12h，反应结束后，进行后处理，得到白色固体。

本发明进一步的改进在于，所述的步骤2)的具体过程为：在N₂保护下，将氯化亚砜滴加入到5-溴烟酸中，滴加完后，加热回流2-3h至溶液澄清，减压旋除氯化亚砜，得淡黄色固体；将该固体溶入到无水二氯甲烷中，然后滴加到胺类化合物的二氯甲烷溶液中，滴加完后，升至室温反应12h，反应结束后，进行后处理，得到白色固体，即为氨化的5-溴烟酸。

本发明进一步的改进在于，所述的步骤3)的具体过程为：将酰化的5-溴-2-氨基吡啶与间羧基苯硼酸加入到反应容器中，或将氨化的5-溴烟酸与间羧基苯硼酸加入到反应容器中，再依次加入碳酸铯与四三苯基膦钯，然后再加入乙腈/水的混合溶液，N₂保护下，在90℃反应48h，反应结束后，进行后处理，得到吡啶-苯化合物。

本发明进一步的改进在于，所述步骤4)的具体过程为：Boc-L-丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，降温至-20℃，搅拌5-10min，加入三乙胺，然后滴加氯甲酸异丁酯的二氯甲烷溶液，滴毕后反应10-20min后，滴加3-三氟甲基-4-氯苯胺的二氯甲烷溶液，反应2h后，进行后处理，得到叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯。

本发明进一步的改进在于，所述步骤5)的具体过程为：在0℃下，将叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯溶于无水二氯甲烷中，滴加三氟乙酸的二氯甲烷溶液，滴加完后，升至室温反应12h，反应完后，进行后处理，得到(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺。

本发明进一步的改进在于，所述步骤6)的具体过程为：将吡啶-苯化合物溶于无水四氢呋喃中，加入4-甲基吗啉，冰浴条件下，滴加氯甲酸异丁酯的无水四氢呋喃溶液，滴加完后，冰浴反应30-40min后，滴加(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺和4-甲基吗啉的四氢呋喃溶液，滴加完后，升至室温反应12h，反应完后进行后处理，得到丙氨酸衍生物。

一种丙氨酸衍生物在制备Abl激酶、T315I突变Abl激酶抑制剂中的应用。

一种丙氨酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明利用酰化、Suzuki偶联、缩合等反应合成目标化合物，并构建了化合物库，该类化合物是具有新型分子结构的Bcr-Abl小分子酪氨酸激酶抑制剂，并通过MS、NMR等手段表征了目标化合物的结构。本发明基于对前期的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂以及Bcr-Abl蛋白与配体的相互作用分析研究发现，以联苯吡啶为铰链区结合片段，采用片段药物的设计策略，引入L-丙氨酸为柔性Linker，以构建具有激酶抑制活性的化合物库，并通过ADP-Glo的激酶活性筛选发现具有Bcr-Abl激酶抑制活性的酪氨酸激酶抑制剂。激酶筛选试验表明此类化合物对Abl激酶、T315I突变Abl激酶具有一定的抑制活性，其中R为

时对Abl激酶的活性最佳。细胞增殖试验表明大部分化合物对K562细胞具有一定的抑制活性，其中当R为甲磺酰胺时抗细胞增殖活性最佳。构效关系分析发现：引入L-丙氨酸的衍生物与Abl激酶的ATP位点的空间匹配良好，且对接模式和参照小分子伊马替尼一致，说明L-丙氨酸的引入对化合物的抑制活性具有重要作用。同时，在吡啶环上引入酰胺侧链以提高小分子与受体的亲和力，可以作为以Bcr-Abl为靶标的酪氨酸激酶抑制的新型药效片段。

附图说明

图1为本发明的合成路线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明。

本发明的丙氨酸衍生物的结构式为：

其中，R具体如下：

参见图1，如上述结构的丙氨酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：

2)N₂保护下，5-溴烟酸、氯化亚砜以及胺类化合物发生反应制备被氨化的5-溴烟酸；

6)吡啶-苯化合物与(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺缩合生成一种含有丙氨酸的类肽类化合物。

所述的步骤1)具体操作为：将5-溴-2-氨基吡啶溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺。在冰浴条件下，将相应的酰氯化合物缓慢滴加到上述溶液中，待滴加完毕后，撤去冰浴升至室温反应12h。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，水洗，饱和碳酸氢钠水洗，饱和氯化钠水洗。无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，柱色谱分离，得到白色固体，即为酰化的5-溴-2-氨基吡啶。

所述的步骤2)具体操作为：在N₂保护下，将氯化亚砜滴加入到5-溴烟酸中，滴加完后，加热回流2-3h至溶液澄清，减压旋除氯化亚砜，得淡黄色固体。将该固体溶入到无水二氯甲烷中，并将此活性中间体溶液在冰浴条件下缓慢滴加到相应胺类化合物的二氯甲烷溶液中。滴加完后，升至室温反应过夜(本发明中反应过夜即反应12h)。反应结束后，向反应体系中加入K₂CO₃溶液。分液取二氯甲烷相，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离纯化得到白色固体，即为氨化的5-溴烟酸。

所述的步骤3)具体操作为：将酰化的5-溴-2-氨基吡啶与间羧基苯硼酸加入到梨形瓶中，或将氨化的5-溴烟酸与间羧基苯硼酸加入到梨形瓶中，再依次加入碳酸铯与四三苯基膦钯，再向上述混合物中加入乙腈/水的混合溶液。N₂保护，油浴升温至90℃反应48h。反应结束后，将反应液降至室温，抽滤。滤液用盐酸调至pH为4，析出白色固体，抽滤，滤饼真空干燥得产物，即为吡啶-苯化合物。

所述步骤4)的具体操作为：Boc-L-丙氨酸溶于无水二氯甲烷中，降温至-20℃，搅拌5-10min，加入三乙胺，然后将氯甲酸异丁酯的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，反应10-20min。反应完后，将3-三氟甲基-4-氯苯胺的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，反应2h，TLC检测。反应结束后，加入5％NaHCO₃溶液(100ml/50mmol)，升温至室温30min，分液，水相用二氯甲烷萃取。合并有机相，5％NaHCO₃溶液(100ml/50mmol)洗，5％(体积浓度)盐酸洗，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离，得产品，即为叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯。

所述步骤5)的具体步骤为：在0℃下，将叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯溶于无水二氯甲烷中，滴加三氟乙酸的二氯甲烷溶液，滴加完后，撤去冰浴，升至室温反应过夜。反应完后，加入适量水，分液，弃去二氯甲烷相。水相用饱和Na₂CO₃溶液调pH至8，乙酸乙酯提取，合并有机相，水洗，饱和NaCl溶液洗，无水Na₂SO₄干燥，抽滤，减压旋除溶剂，剩余物即为(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺留待下一步反应。

所述步骤6)的具体操作为：吡啶-苯化合物溶于无水四氢呋喃中，加入4-甲基吗啉，冰浴条件下，滴加氯甲酸异丁酯的无水四氢呋喃溶液，滴加完后，冰浴反应30-40min，TLC监测。反应完后，滴加(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺和4-甲基吗啉的四氢呋喃溶液，滴加完后，升至室温反应过夜。反应完后，减压旋除四氢呋喃，剩余物中加入乙酸乙酯溶解，水洗，饱和NaCl溶液洗，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离，得到丙氨酸衍生物。

本发明的丙氨酸衍生物具有抑制Abl激酶、T315I突变Abl激酶活性的作用，可用于制备Abl激酶、T315I突变Abl激酶抑制剂。

本发明的丙氨酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

实施例1

一种丙氨酸衍生物，其特征在于，R为

时，制备方法如下：

1)N-(5-溴吡啶-2-基)乙酰胺的合成：5-溴-2-氨基吡啶(5.19g，30mmol)溶于100ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺20ml。在冰浴条件下，将乙酰氯(2.54ml)缓慢滴加到上述溶液中，待滴加完后，撤去冰浴，升至室温反应过夜。反应结束后，加入二氯甲烷稀释，水洗(30ml×3)，饱和NaHCO₃溶液洗(30ml×3)，饱和NaCl洗(30ml)，有机相无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离得白色固体5.65g，产率88％。Mp 78-81℃；EI-MS(m/z):214[M]⁺。

2)3-(6-(乙酰氨基)吡啶-3-基)苯甲酸的合成：N-(5-溴吡啶-2-基)乙酰胺(4.30g,20mmol)、间羧基苯硼酸(3.66g，22mmol)加入到250ml梨形瓶中，再依次加入碳酸铯(13.0g，40mmol)，四三苯基膦钯(1.2g，1mmol)。向上述混合物中加入乙腈/水(V:V＝3:2)200ml。N₂保护，油浴升温至90℃反应48h。反应结束后，将反应液降至室温，抽滤。滤液用6mol/L盐酸调至pH4，析出白色固体，抽滤，滤饼真空干燥得产物3.53g，产率69％。EI-MS(m/z):256[M]⁺。

3)Boc-L-丙氨酸的合成：将7.14g的L-丙氨酸溶于40mol/L的NaOH(80ml)溶液中，加入80ml四氢呋喃，于冰水浴中冷却。搅拌下滴加(Boc)₂O 19.2g的四氢呋喃溶液，待滴加完后，撤去冰浴升至室温反应，TLC监测(茚三酮显色)。反应结束后，减压旋除四氢呋喃，在冰浴条件下用柠檬酸溶液调反应液pH至2-3，之后加入乙酸乙酯进行萃取(60ml×3)。合并有机相，饱和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，乙酸乙酯和石油醚重结晶，得产品13.6g，产率90％。Mp 81-83℃。

4)叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯的合成：Boc-L-丙氨酸(7)(1.9g，10mmol)溶于50ml无水二氯甲烷中，降温至-20℃，搅拌5-10min，加入三乙胺(2.77ml，20mmol)，然后将氯甲酸异丁酯(1.95ml，15mmol)的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，反应10-20min。反应完后，将3-三氟甲基-4-氯苯胺(1.95g，10mmol)的二氯甲烷溶液滴加到上述溶液中，反应2h，TLC检测。反应结束后，加入5％NaHCO₃溶液(100ml/50mmol)，升温至室温30min，分液，水相用二氯甲烷萃取。合并有机相，5％NaHCO₃溶液洗，5％(体积浓度)盐酸洗，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)，得产品3.23g，产率88％。EI-MS(m/z):351[M-CH₃]⁺。

5)(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺的合成：在0℃下，将化合物叔丁基-(R)-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基甲酸酯(3.23g，8.8mmol)溶于100ml无水二氯甲烷中，滴加三氟乙酸(6.5ml，88mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完后，撤去冰浴，升至室温反应过夜。反应完后，加入适量水，分液，弃去二氯甲烷相。水相用饱和Na₂CO₃溶液调pH至8，乙酸乙酯提取(60ml×3)，合并有机相，水洗，饱和NaCl溶液洗，无水Na₂SO₄干燥，抽滤，减压旋除溶剂，剩余物留待下一步反应。

6)(R)-3-(6-乙酰胺基吡啶-3-基)-N-(1-((4-氯-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)苯甲酰胺(L1)的合成：3-(6-(乙酰氨基)吡啶-3-基)苯甲酸(2.5mmol)溶于无水四氢呋喃中，加入4-甲基吗啉(0.85ml，7.5mmol)，冰浴条件下，滴加氯甲酸异丁酯(0.55ml，3.75mmol)的无水四氢呋喃溶液，滴加完后，冰浴反应30-40min，TLC监测。反应完后，滴加(R)-2-氨基-N-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)丙酰胺(0.8g，3mmol)和4-甲基吗啉(0.85ml)的四氢呋喃溶液，滴加完后，升至室温反应过夜。反应完后，减压旋除四氢呋喃，剩余物中加入乙酸乙酯溶解，水洗，饱和NaCl溶液洗，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离。(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体0.30g，产率24％。Mp 128-131℃；EI-MS(m/z):505[M+H]⁺,503[M-H]^-；¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.66(s,1H),10.57(s,1H),8.89(d,J＝6.6Hz,1H),8.74(s,1H),8.29–8.23(m,2H),8.23–8.16(m,2H),7.92–7.89(m,3H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.62–7.58(m,1H),4.65–4.58(m,1H),2.13(s,3H),1.48(d,J＝7.1Hz,3H)；¹³CNMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.68,169.84,166.63,152.16,146.41,139.01,137.30,136.77,134.95,132.58,130.81,129.73,129.59,127.46,127.33,127.02,125.69,124.55,124.45,124.34,121.83,118.35,118.28,113.62,50.68,24.40,17.92。

实施例2

一种丙氨酸衍生物，其特征在于，R为

时，制备方法如下：

1)5-溴-N-环丙基烟酰胺的合成：在N₂保护下，将氯化亚砜(36ml，494mmol)滴加入到5-溴烟酸(5.00g，24.7mmol)中，滴加完后，加热回流2-3h至溶液澄清，减压旋除氯化亚砜，得淡黄色固体。将该固体溶入到30ml无水二氯甲烷中，并将此活性中间体溶液在冰浴条件下缓慢滴加到环丙基胺(3.77ml)二氯甲烷(30ml)溶液中。滴加完后，升至室温反应过夜。反应结束后，向反应体系中加入2mol/L K₂CO₃溶液20ml。分液取二氯甲烷相，水相用二氯甲烷萃取(15ml×3)，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥。柱色谱分离纯化。(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体5.27g，产率89％。Mp 140-142℃；EI-MS(m/z):240[M]⁺。

步骤2)～步骤6)与实施例1中步骤2)～步骤6)相同。所得化合物(L5)为白色固体0.79g，产率60％。Mp 191-192℃；EI-MS(m/z):531[M+H]⁺,529[M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.58(s,1H),9.12(d,J＝2.1Hz,1H),8.99(d,J＝1.9Hz,1H),8.94(d,J＝6.7Hz,1H),8.78(d,J＝4.0Hz,1H),8.50–8.49(m,1H),8.34(s,1H),8.25(d,J＝2.4Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,2H),7.90(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.70–7.64(m,2H),4.70–4.56(m,1H),2.94–2.85(m,1H),1.49(d,J＝7.2Hz,3H),0.78–0.73(m,2H),0.64–0.62(m,2H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.65,166.50,166.35,150.38,148.08,139.01,136.92,135.08,135.03,133.29,132.61,130.50,130.43,129.72,128.30,127.33,127.02,126.49,124.55,124.46,124.36,121.83,118.34,118.29,50.71,23.55,17.93,6.22。

化合物L2-L4合成步骤同L1。

化合物L2：柱色谱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)，得白色固体0.45g，产率33％。Mp 115-116℃；EI-MS(m/z):547[M+H]⁺,545[M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.57(s,1H),9.97(s,1H),8.90(d,J＝6.6Hz,1H),8.75(s,1H),8.25(d,J＝2.5Hz,2H),8.20(d,J＝1.3Hz,2H),7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.64–7.59(m,2H),4.65–4.58(m,1H),1.49(d,J＝7.2Hz,3H),1.27(s,9H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ177.75,172.68,166.65,152.40,146.10,139.02,137.25,136.65,134.98,132.00,130.90,129.59,129.27,127.48,127.33,127.03,125.71,124.55,124.45,124.36,121.83,118.34,118.25,114.41,50.69,39.89,27.35,17.92。

化合物L3：柱色谱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体0.33g，产率24％。Mp 246-247℃；EI-MS(m/z):541[M+H]⁺,539[M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.81(s,1H),10.57(s,1H),8.87(d,J＝6.7Hz,1H),8.69(s,1H),8.28–8.22(m,2H),8.17–8.14(m,1H),7.92–7.87(m,3H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.11(d,J＝8.6Hz,1H),4.67–4.55(m,1H),1.48(d,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.67,166.57,152.39,139.01,137.59,137.11,134.93,132.61,129.69,129.62,127.46,127.32,127.01,125.73,124.55,124.46,124.34,121.84,118.33,118.29,112.75,50.66,42.28,17.93。

化合物L4：柱色谱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：2)，得白色固体0.43g，产率37％。Mp 215-216℃；EI-MS(m/z):464[M+H]⁺,462[M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.56(s,1H),8.84(d,J＝6.2Hz,1H),8.70(s,2H),8.25(s,1H),8.19(s,1H),7.91–7.81(m,3H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.56–7.52(m,1H),6.88(s,2H),4.68–4.57(m,1H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.69,166.65,163.57,156.61,139.01,135.76,134.86,132.57,129.53,128.57,127.33,127.02,126.78,124.51,124.45,124.36,121.93,121.83,118.35,118.30,50.67,17.93。

化合物L6、L7的合成步骤同L5。

化合物L6：柱色谱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)，得白色固体1.05g，产率77％。Mp 114-116℃；EI-MS(m/z):547[M+H]⁺,545[M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.57(s,1H),9.08(d,J＝2.2Hz,1H),8.94(d,J＝6.7Hz,1H),8.61(d,J＝1.9Hz,1H),8.32(s,1H),8.25(d,J＝2.4Hz,1H),8.20–8.19(m,1H),8.01–7.96(m,2H),7.90(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.68(d,J＝8.8Hz,1H),7.66–7.62(m,1H),4.67–4.60(m,1H),3.50(d,J＝6.8Hz,2H),3.25(d,J＝6.6Hz,2H),1.49(d,J＝7.2Hz,3H),1.19(d,J＝7.1Hz,3H),1.10(d,J＝6.6Hz,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.63,167.93,166.48,148.67,146.24,139.01,136.71,135.18,135.06,133.66,132.57,132.37,130.45,129.74,128.38,127.33,127.03,126.43,124.54,124.45,124.37,121.83,118.35,118.30,60.20,50.67,43.50,17.94,14.52。

化合物L7：柱色谱分离纯化(乙酸乙酯：甲醇＝7：1)，得白色固体0.43g，产率30％。Mp 114-117℃；EI-MS(m/z):562[M+H]⁺,560M-H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.62(s,1H),9.13(d,J＝1.9Hz,1H),9.02(d,J＝1.7Hz,1H),8.97(d,J＝6.6Hz,1H),8.85–8.82(m,1H),8.56(s,1H),8.37(s,1H),8.26(d,J＝2.3Hz,1H),8.00(d,J＝7.6Hz,2H),7.91(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),7.71–7.63(m,2H),4.68–4.57(m,1H),3.45–3.41(m,2H),2.49(s,2H),2.24(s,6H),1.50(d,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ172.68,166.49,165.08,150.37,148.15,139.04,136.91,135.09,135.03,133.33,132.55,130.45,129.70,128.31,127.32,127.02,126.52,124.54,124.45,124.33,121.83,118.35,118.29,58.42,50.79,45.48,37.74,17.93。

下面对本发明制得的具有抗肿瘤活性的丙氨酸衍生物进行Bcr-Abl激酶抑制活性筛选。

测定方法具体如下：

激酶ABL1、ABL(T315I)和底物Abltide购自Signal-Chem公司，选用Promega公司的ADP-Glo^TM Kinase Assays检测试剂盒检测目标化合物的抑酶活性，操作方法按照试剂盒说明进行。

Abl实验中，将ATP(1mM)用buffer(2×)(Tris 80mM,MgCl₂ 20mM,BSA 0.2mg/ml,DTT 2mM)稀释80倍配制成ATP(125μM)的buffer(2×)溶液；将125μM的ATP溶液和Abltide溶液体积1:1混合配制成ATP(62.5μM)-Abltide(0.5μg/μl)的混合溶液备用；ABL1激酶溶液用buffer(1×)(Tris 40mM,MgCl₂ 10mM,BSA 0.1mg/ml,DTT 1mM)稀释100倍配制成ABL1(1ng/μl)的buffer(1×)溶液备用。

Abl(T315I)实验中的ATP-Abltide以及ABL1(T315I)的配制步骤同上，不同的是ATP浓度为12.5μM，ABL1(T315I)的浓度是2ng/μl

将目标化合物和阳性对照药(Imatinib)用buffer(1×)分别配制成1.5×10^-5，1.5×10^-6，1.5×10^-7，1.5×10^-8，1.5×10^-9，1.5×10^-10mol/L浓度梯度的样品溶液，于384孔板上每孔依次加入2μl ATP-Abltide的混合溶液，1μl样品溶液，2μl酶溶液；空白孔加3μl缓冲液和2μl ATP-Abltide的混合溶液；对照孔加2μl ATP-Abltide的混合溶液，1μl缓冲液，2μl酶溶液，加毕，30℃下孵育60min；加入ADP-Glo试剂5μl，在25℃下孵育40min；加入Kinasedetection试剂，再在25℃下孵育30min。采用PerkinElmer多功能酶标仪的化学发光模块测定每孔的发光值，计算化合物对Abl的抑制率和IC₅₀。

本发明的含有丙氨酸的类肽类化合物的结构式为：

本发明的丙氨酸的衍生物的激酶抑制活性如表1所示

表1丙氨酸衍生物对Bcr-Abl/Bcr-Abl^T315I抑制活性IC₅₀(μM)

由表1中可以看出，大部分的化合物对Bcr-Abl激酶具有较好的抑制活性，化合物IC₅₀值在0.29μM到4.48μM范围内，其中活性最好的是化合物L1、L6和L7，其IC₅₀值分别为0.60μM、0.29μM和0.64μM。对Bcr-Abl^T315激酶，大部分化合物都有一定的抑制活性，IC₅₀值在2.41μM到243.91μM范围内，其中部分化合物(L5，L7)对T315I突变Abl激酶的半数抑制浓度在微摩尔水平，活性较好。活性结果表明，取代基的不同会直接影响到化合物对激酶的抑制活性。

下面测定丙氨酸的衍生物对肿瘤细胞的生长抑制活性。采用MTT法检验含有丙氨酸的类肽类化合物对肿瘤细胞的生长抑制活性作用。

本发明提供的丙氨酸的衍生物具有抗肿瘤的作用。对肿瘤细胞具有体外抑制增值活性效果，在人白血病细胞(K562细胞)中具有抑制肿瘤细胞的增值活性效果，可用于对白血病的治疗。

取对数生长期的人白血病细胞(K562细胞)，用RPMI1640培养基稀释成10⁴个/ml数量级的细胞溶液，平行接种于96孔培养板中(2000-4000个/孔)，每孔接种体积为180μl，37℃、5％CO₂培养箱中培养12h；

每孔加入不同浓度的待测化合物20μl，使孔中化合物的终浓度为：1.5×10^-7mol/L，1.5×10^-6mol/L，1.5×10^-5mol/L，1.5×10^-4mol/L，每个浓度设3个复孔，阴性对照加细胞不加化合物，设6个复孔，尼罗替尼或伊马替尼为阳性对照，继续培养48h；

每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，使孔中MTT的终浓度0.5mg/ml，37℃培养箱孵育4h，小心吸弃上清，每孔加DMSO 150μl，振荡15min，酶联免疫检测仪测量各孔490nm处的紫外吸收值(OD值)，然后计算细胞抑制率，并根据抑制率采用线性回归法计算求出化合物的IC₅₀值；

细胞抑制率的计算公式为：

抑制率％＝(对照孔平均OD值－用药组平均OD值)/对照孔平均OD值×100％

检测结果显示：与阴性对照组相比，含有丙氨酸的类肽类化合物对上述肿瘤细胞具有不同程度的体外抑制作用，如表2所示

K562细胞增殖活性：

表2丙氨酸衍生物对K562细胞抑制活性IC₅₀(μM)

细胞活性筛选试验表明，化合物对K562细胞具有一定的细胞增值抑制活性。IC₅₀值范围为4.66μM到42.81μM，其中活性较好的化合物IC₅₀值在微摩尔水平，活性最好的是L3，IC₅₀值为4.66μM，活性和伊马替尼相当。对于丙氨酸衍生物来讲，在吡啶环上引入不同的取代基，对生物活性的影响存在较大的差异，且取代基的位置不同对生物活性的影响也不同。化合物L7对Bcr-Abl激酶的抑制活性较好，同时对K562细胞的抑制活性较好，与伊马替尼相接近，值得展开进一步的深入研究。

Claims

1.一种丙氨酸衍生物，其特征在于，该丙氨酸衍生物的结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的丙氨酸衍生物在制备Abl激酶、T315I突变Abl激酶抑制剂中的应用。

3.一种如权利要求1所述的丙氨酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述肿瘤为白血病。