CN109820834B - 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 - Google Patents
一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109820834B CN109820834B CN201811585092.9A CN201811585092A CN109820834B CN 109820834 B CN109820834 B CN 109820834B CN 201811585092 A CN201811585092 A CN 201811585092A CN 109820834 B CN109820834 B CN 109820834B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- foot
- mouth disease
- antigen
- inactivated
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了口蹄疫灭活病毒抗原的保护剂,该保护剂由下列组份组成:海藻糖、棉子糖、葡聚糖、山梨醇、甘露醇、肌醇、木糖醇、聚乙二醇3350、TPGS、蜂胶;其能使抗原保存时间延长,在生产过程和冷链运输过程中保护口蹄病毒146s抗原稳定;有利于建立口蹄疫病毒抗原库,提高口蹄疫病毒抗原液中146s抗原低温储存的稳定性。本发明还提供了含有该保护剂和口蹄疫灭活病毒抗原作为芯材的口蹄疫灭活病毒微胶囊疫苗和其制备方法。该疫苗经口服或注射免疫动物,可以在8周就能产生高滴度FMDV抗体且持续时间较常规油佐剂灭活疫苗更长,更快实现免疫保护;且无需佐剂直接注射免疫,还可通过饮水或采食对动物进行预防接种,临床操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域,具体涉及一种口蹄疫灭活病毒 的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染 病,主要危害牛、羊、猪、骆驼等,发病率极高,传播速度极快,对各 国的畜牧业有着巨大的危害。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科,口蹄疫 病毒属。目前已知有7个血清型,A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、 Asia1,每个血清型又有很多亚型。我国流行3个血清型,这三个血清 型也是致病力最强、分布最广泛的,分别为A型、O型以及Asia1型。
目前,口蹄疫的防控措施主要是以广泛的大面积免疫预防为主,配 合以扑杀疫区内的病畜和易感动物并在周围10公里范围内进行环形预 防注射。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段,制备安全有效的疫 苗是成功地预防、控制乃至最终消灭FMD的先决条件。FMD灭活疫苗 具有良好的免疫原性,在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用, 但在疫苗制备过程中残余的一些宿主细胞残余蛋白、核酸、牛血清白蛋 白、化学试剂等如果不加以控制、去除,疫苗免疫接种动物则引起动物 严重副反应甚至死亡、特别是可能使动物致癌或影响肉类动物食品安 全。
当使用高纯度抗原146s颗粒,颗粒含量≥100μg/mL,纯度为90% 以上时,可降低动物副反应,甚至不会引起动物任何副反应,但高纯度 也降低了抗原液的稳定性,即随保存时间增加抗原含量下降的现象。
口蹄疫疫苗生产环节、冷链运输、田间使用中,选择适合的温度保 存原液、半成品、成品对疫苗抗原活性或效价非常重要,但疫苗抗原活 性稳定的温度范围非常狭窄,一般在每段工艺单元完成之间、疫苗库或 抗原库、冷链运输、使用时保存在2-8℃,但不能冷冻,以避免温度升 高或低于零下破环抗原结构或活性。为保持疫苗稳定性或工艺过程中贮备抗原的稳定,多对疫苗或抗原进行冻干或冷冻,但由于灭活纯化抗原 需要加入佐剂如铝盐、油佐剂增强其免疫作用,冻干或冷冻使抗原凝聚 变性或分层,失去免疫原性和生物活性,因此冻干或冷冻不适用于口蹄 疫灭活疫苗的存储。在现实生产中有必要对口蹄疫抗原的稳定保护剂进 行研究,筛选,以便应对规模化生产大量抗原处理、贮存或抗原库稳定 需要,但不能影响后续乳化工艺配制疫苗的操作和疫苗的最终田间使 用,同时还要求选择医学或兽医学允许使用的安全疫苗抗原保护剂。
目前市场上商品化口蹄疫灭活疫苗大多为油佐剂疫苗,油佐剂苗接 种一次可产生较好和较长时间的保护作用,但在接种部位可引起严重的 不良反应,注射部位吸收不好,给肉的品质带来较大的影响,而且常规 的油佐剂疫苗需要逐只进行免疫,费事费力,容易出现漏免的情况,而 且不同的疫苗至少需要相互间隔5~7日进行免疫以免造成较大的副反 应,因此,有必要开发一种易于免疫,肉品中无残留的新型的疫苗。
微囊化技术是指将某一目的物(芯或内相)用各种天然的或合成的高 分子化合物连续薄膜(壁或外相)完全包覆起来,而对目的物的原有化学 性质丝毫无损,然后逐渐地通过某些外部刺激或缓释作用使目的物的功 能再次在外部呈现出来,或者依靠囊壁的屏蔽作用起到保护芯材的作用 的包装技术。微囊化技术应用广泛,已广泛应用于食品、化妆品、药物 和疫苗等多个领域。微囊化技术因其可有效提高疫苗稳定性、生物相容 性并可赋予疫苗靶向性、良好的缓释性能等,现已在兽用疫苗领域得到 应用,并与口服免疫接种途径相结合,避免疫苗在消化道内的酸碱环境 变化和各种酶的作用下丧失活性。但是目前未见有关于口蹄疫微胶囊口 服疫苗的研究报道。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术不足,提供一种口蹄疫灭活病毒的 保护剂及微胶囊疫苗的制备方法,以解决现有技术中缺乏相关方法的技 术问题。
本发明涉及一种口蹄疫灭活病毒抗原的保护剂,其中,在所述灭活 病毒抗原体系中所述保护剂各组分及含量为:1-2%海藻糖、0.3-2%棉子 糖、0.5-1.5%葡聚糖、0.5-1.5%山梨醇、0.5-1%甘露醇、0.5-1.2%肌醇、 0.5-1.5%木糖醇、0.2-2%聚乙二醇3350、1-5%聚乙二醇1000维生素E 琥珀酸酯(TPGS)、0.5-2.5%蜂胶。
本发明的保护剂能保证口蹄疫灭活病毒抗原的稳定性,在4℃条件 下12个月的时间灭活病毒抗原的含量几乎没有下降,能使口蹄疫病毒 抗原保存时间延长,在生产过程和冷链运输过程中保护口蹄疫病毒146s 抗原稳定;有利于建立口蹄疫病毒抗原库,提高口蹄疫病毒抗原液中 146s抗原低温储存的稳定性。本发明提供的口蹄疫病毒抗原保护剂的配方简单,配比合理,易于大规模生产的操作。
作为本发明的一种实施方式,本发明的口蹄疫灭活病毒抗原的保护 剂中,海藻糖1.5%、棉子糖1%、葡聚糖1%、山梨醇1%、甘露醇0.8%、 肌醇0.7%、木糖醇0.8%、聚乙二醇3350 0.5%、TPGS 2%、蜂胶1%。
本发明还涉及一种口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,所述口蹄疫 微胶囊疫苗包括微囊化包被的免疫量的口蹄疫灭活病毒抗原和所述的 保护剂。
本发明的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗在同样抗原含量条件下,不额 外添加佐剂,保护剂能使口蹄疫灭活病毒在免疫后第8周ELISA检测 产生1:1024的效价,远早于同样抗原含量的油佐剂灭活疫苗。
本发明的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗中的保护剂保证了口蹄疫灭 活病毒抗原的稳定性,能使口蹄疫病毒抗原保存时间延长,在生产过程 和冷链运输过程中保护口蹄病毒146s抗原稳定;有利于建立口蹄疫病 毒抗原库,提高口蹄疫病毒抗原液中146s抗原低温储存的稳定性。在 免疫后第8周产生1:1024的FMDV抗体效价,远早于同样抗原含量的 油佐剂灭活疫苗,且抗体持续时间较常规油佐剂灭活疫苗更长,第20 周才开始下降。
作为本发明的一种实施方式,本发明口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗 中,所述口蹄疫灭活病毒抗原为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2 型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原;所述口蹄疫灭活病毒 抗原含量≥108.0TCID50/mL。
本发明的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中的口蹄疫灭活抗原可选 自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄 疫灭活病毒抗原,当146s含量为1μg/mlL时,能对动物产生有效保护。
作为本发明的一种实施方式,本发明口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗 中,所述口蹄疫灭活病毒抗原为所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病 毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原,或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株 灭活全病毒抗原。
O/Mya98/XJ/2010株和A/AKT-Ⅲ株可商业上获得,例如从兰兽研 商购。
本发明的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其抗原选自猪口蹄疫病毒 O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原,或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭 活全病毒抗原,能在免疫后第8周即产生1:1024的ELISA抗体效价, 远早于同样抗原含量的油佐剂灭活疫苗。
作为本发明的一种实施方式,本发明口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗 中,所述包被的微囊的囊材选自海藻酸钠和氯化钙、壳聚糖中的一种或 多种;其中海藻酸钠的浓度为1.5%~3.5%,氯化钙的浓度为2.5%~ 3.5%,壳聚糖的浓度为0.1%~5%。
作为本发明的一种优选实施方式,本发明口蹄疫灭活抗原微胶囊疫 苗中,所述包被的微囊的囊材海藻酸钠的浓度为2%,氯化钙的浓度为 3%,壳聚糖的浓度为3%。
本发明的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗能在生理盐水和中性溶液中 能够进行良好释放,在pH 2.3的盐酸溶液释放较缓慢,说明其具有耐 酸性。本发明的口蹄疫灭活病毒微胶囊疫苗可无需佐剂直接注射免疫, 还可通过饮水或采食对动物进行预防接种,与传统的注射免疫途经相比 更加简单方便,省时省力,并且可有效避免注射部位副反应的发生,有利于改善肉品的品质,可规模化应用。
本发明还涉及一种制备所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗的方法, 其中,所述方法包括:步骤(1)扩增培养口蹄疫病毒,得到扩增的口 蹄疫病毒;步骤(2)将所述步骤(1)制备的口蹄疫病毒纯化、灭活, 制备口蹄疫病毒灭活抗原;步骤(3)将所述步骤(2)制备的口蹄疫病 毒灭活抗原与所述的保护剂按照比例制备芯材;步骤(4)选自海藻酸 钠和氯化钙、壳聚糖中的一种或多种分别溶解于水中,其中海藻酸钠的 浓度为1.5%~3.5%,氯化钙的浓度为2.5%~3.5%,壳聚糖的浓度为 0.1%~5%,作为所述口蹄疫微胶囊疫苗的囊材;以及步骤(5)将所述 步骤(4)制备的囊材包被所述步骤(3)的芯材,得到所述口蹄疫微胶囊疫苗。
本发明也可以选择本领域公知的其他囊材进行包被灭活抗原,使得 制备的口蹄疫微胶囊疫苗能够在生理和消化道环境下释放疫苗即可实 现本发明。
作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的制备口蹄疫灭活抗原 微胶囊疫苗方法中,所述步骤(2)的所述口蹄疫病毒灭活抗原纯度≥ 90%。
作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的制备口蹄疫灭活抗原 微胶囊疫苗方法中,所述步骤(1)包括:2L-10000L生物反应器全悬 浮培养BHK-21细胞,细胞密度达到3-5×106/毫升时,按照病毒感染复 数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒,制备病毒原液,搅拌速度不超过 40rpm,培养8-12h收获病毒液,使用制备型低速连续流离心机离心除 去细胞碎片,同时收获上清和沉淀,沉淀在0.2%Triton-X-100的条件下 裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片,反复冻融3次后,超声3次, 超声仪最大输出功率3×30s;用制备型低速连续流离心机离心收集上清 液,合并上清液,其中口蹄疫病毒滴度为≥108.0TCID 50/mL。
作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的制备口蹄疫灭活抗原 微胶囊疫苗方法中,所述步骤(2)包括:所述步骤(2)包括:步骤(a) 深层过滤装置处理所述口蹄疫病毒液,所述口蹄疫病毒液与深层过滤装 置接触,以300L/m2/hr~500L/m2/hr的流速过滤掉0.5pm~200pm的粒 径分布的细胞碎片和颗粒,以分离目的抗原与细胞碎片和颗粒;步骤(b) 用中空纤维超滤系统或膜包浓缩、进一步纯化所述步骤(a)得到的初 级纯化的所述口蹄疫病毒液;步骤(c)将所述步骤(b)获得的所述口 蹄疫病毒液经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF两步层析柱;步骤 (d)用二乙烯亚胺处理所述步骤(c)得到的所述口蹄疫病毒液进行灭 活,灭活完成后用硫代硫酸钠进行阻断,得到所述口蹄疫病毒抗原。
作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的制备口蹄疫灭活抗原 微胶囊疫苗方法中,所述步骤(5)包被过程包括:将所述(3)制备的 芯材,与海藻酸钠溶液用磁力搅拌器500rpm搅拌混匀35min制成乳浊 液,通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55m L/min的速度泵 入喷雾干燥机,喷入氯化钙溶液中,形成海藻酸钙微胶囊,喷雾完毕后 继续搅拌35min;所述微胶囊通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵 以55mL/min的速度泵入通过喷雾干燥机分散到壳聚糖溶液中,充分搅 拌35min,通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55mL/min的速 度泵入喷雾干燥机进行干燥,制成所述口蹄疫微胶囊疫苗。
附图说明
图1为BCA标准品曲线图;
图2为微囊疫苗在生理盐水溶液中的释放曲线;
图3为微囊疫苗在p H 7.4的PBS溶液中的释放曲线;
图4为微囊疫苗在p H 2.3的Hcl溶液中的释放曲线。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必 要的细节,在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描 述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述,表明在不改变 基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此,用“大约”、“左右” 等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中,“大约” 表示允许其修正的数值在正负百分之十(10%)的范围内变化,比如,“大 约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外,在“大约第一数 值到第二数值”的表述中,大约同时修正第一和第二数值两个数值。在 某些情况下,近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外,以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所 属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材,如无特殊说明,均为常规生化 试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;以下实施例中的 定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值;以下实施例中的%, 如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1本发明口蹄疫微囊化疫苗的制备
1灭活抗原的制备
1.1病毒液的制备
1.1.1 A型口蹄疫病毒液的制备
10000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞,细胞密度达到 3-5×106个/毫升时,按照病毒感染复数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒细 胞适应株(牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株,内蒙古必威安泰生物科技有限公 司制备),制备病毒原液,搅拌速度不超过40rpm,培养8-12h收获病毒 液。
1.1.2 O型口蹄疫病毒液的制备
10000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞,细胞密度达到 3-5×106个/毫升时,按照病毒感染复数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒细 胞适应株(猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株,内蒙古必威安泰生物科 技有限公司制备),制备病毒原液,搅拌速度不超过40rpm,培养8-12h 收获病毒液。
1.2病毒液的浓缩
将实施例1.1.1和1.1.2制备的病毒液分别经离心,并进行浓缩,使 用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片,同时收获上清和沉淀, 沉淀在0.2%Triton-X-100存在的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细 胞膜碎片,反复冻融3次后、超声3次(最大输出功率3×30s);用制备 型低速连续流离心机离心收集上清液,合并上清液,其中口蹄疫病毒滴度为≥108.0TCID50/mL。
1.3病毒液的纯化
1.3.1经深层过滤装置处理,即:病毒细胞培养液与深层过滤装置 接触,以300L/m2/hr~500L/m2/hr的流速过滤具有约0.5pm~200pm 的粒径分布的细胞碎片和颗粒,分离目的抗原与细胞碎片和颗粒;
1.3.2用中空纤维超滤系统或膜包浓缩纯化1.3.1初步纯化的抗原 液;
1.3.3按照上步纯化浓缩方法获得的抗原经过DEAE-Sepharose FF 和Sephawse6FF两步层析柱;
1.3.4用二乙烯亚胺处理1.3.3处理后抗原液进行灭活,硫代硫酸钠 进行阻断。
1.4灭活抗原检验
将1.3制成的纯化口蹄疫病毒灭活抗原进行无菌检验,结果无菌生 长。
2疫苗的制备
2.1将1.4检验合格的纯化后的口蹄疫病毒液按保护剂比例加入保 护剂,保护剂在口蹄疫病毒抗原体系中的终浓度见表1,其优选浓度见 表2
所述的糖类为海藻糖、棉子糖、葡聚糖;所述的醇类为山梨醇、甘 露醇、肌醇、木糖醇、聚乙二醇3350;维生素为聚乙二醇1000维生素 E琥珀酸酯(TPGS)。
表1口蹄疫病毒抗原体系中保护剂浓度
表2口蹄疫病毒抗原体系中保护剂优选浓度
再与1.5%~3.5%海藻酸钠用磁力搅拌器500rpm搅拌混匀35min 制成乳浊液,通过内径约为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55mL/min 的速度泵入喷雾干燥机,喷入2.5%~3.5%氯化钙溶液中,形成海藻酸 钙微胶囊,喷雾完毕后继续搅拌35min;通过内径约为0.8mm的硅胶管, 连通蠕动泵以55mL/min的速度泵入通过喷雾干燥机分散到0.1%~5%壳聚糖溶液中,充分搅拌35min,通过内径约为0.8mm的硅胶管,连通 蠕动泵以55mL/min的速度泵入喷雾干燥机进行干燥,制成口蹄疫灭活 病毒海藻酸钙-壳聚糖微胶囊疫苗。
3疫苗的安全性和效力检验
3.1安全性试验
将常规方法配制的口蹄疫油佐剂疫苗和实施例2.1制备的微囊化疫 苗分别以两倍剂量(即两倍常规免疫剂量,常规的免疫剂量146s含量 为2-6μg/mL)免疫豚鼠、小白鼠、仔猪。使用豚鼠、小白鼠、仔猪作 为实验动物参照《中国兽药典》(2010年版三部)猪口蹄疫(O型) 灭活疫苗安全检验方法检验口蹄疫微胶囊疫苗安全性。
表1a口蹄疫微胶囊疫苗安全性检验
实施例2本发明的口蹄疫微胶囊疫苗的免疫效果监测
将实施例3.1制备的油佐剂疫苗和实施例2.1制备的口蹄疫微囊疫 苗分别以单倍剂量免疫30-45kg,FMDV抗体为阴性的猪各8只。分别 于免疫后4周、8周、10周、12周、14周、18周、20周。ELISA测定 FMDV抗体效价。
结果,单倍剂量(常规的免疫剂量146s含量为2-6μg/mL)口蹄疫 微囊疫苗免疫猪,和4倍剂量(即单倍剂量的4倍)口服免疫猪在第8 周后FMDV抗体效价均能达到1:1024,而油佐剂疫苗直到12周、16 周才能实现FMDV抗体效价均达到1:1024,因此本发明的口蹄疫微囊疫苗比油佐剂疫苗效价上升快,且持续时间更长(比较结果参见表2a、 3~7)。
表2a O型口蹄疫油佐剂疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)免疫效果监测
表3 O型口蹄疫微囊疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)4倍剂量口服免疫 效果监测
表4 O型口蹄疫微囊疫苗(O/Mya98/XJ/2010株)注射免疫效果监测
表5 A型口蹄疫油佐剂疫苗(A/AKT-Ⅲ株)免疫效果监测
表6 A型口蹄疫微囊疫苗(A/AKT-Ⅲ株)4倍量口服免疫效果监测
表7 A型口蹄疫微囊疫苗(A/AKT-Ⅲ株)注射免疫效果监测
实施例3口蹄疫微胶囊的包埋率与释放效果监测
3.1口蹄疫微胶囊疫苗包埋率测定
精确称取0.01g实施例1制备的口蹄微胶囊疫苗,溶解于经Φ0.22 μm滤膜过滤的灭菌水中,800rpm低速离心10min,弃上清,洗去未 包被的抗原;剩余产品精确定容至25mL容量瓶中。用BCA蛋白试剂 盒(具体操作步骤参考试剂盒说明书)以标准曲线法测定其蛋白含量, 计算微胶囊包埋率。计算公式如下:
微胶囊包埋率(%)=(总蛋白含量-未包埋蛋白含量)/总蛋白含 量×100%
标准曲线见图1,经计算后本实验的包埋效率均在85-90%之间。
3.2口蹄疫微胶囊疫苗的体外释放测定
称取100mg实施例1制备的口蹄微胶囊疫苗分别于3个50mL离 心管中,分别依次加入10mL生理盐水,pH 7.4的PBS溶液和pH 2.3 的Hcl溶液,将其放置于37℃恒温振荡器中,调起转速为100r/min。 分别于1h,3h,7h,1d,3d,7d,14d测定释放液中的蛋白含量,统 计数据,并绘制释放曲线,图2~4分别为介质生理盐水、pH 7.4的PBS 溶液、pH 2.3的Hcl溶液中口蹄疫微胶囊疫苗随时间的释放曲线。
结果由图2~3可知,微胶囊口服疫苗于3h后在生理盐水、p H7.4 的PBS溶液中的释放率为30%,说明该微胶囊产品在中性溶液和生理 盐水溶液中能够进行释放。该微胶囊产品在pH2.3的盐酸溶液释放较缓 慢,于试验进行3h时检测其释放率为27.56%(图2-4),证明该产品 具有耐酸性。
实施例4保护剂后口蹄液抗原液在4℃储存时间的比较
为检测本发明保护剂对口蹄疫抗原的保护作用,在4℃条件下,于 2个月、4个月、6个月、8个月、12个月,根据专利申请CN102998378A 公开方法检测添加了保护剂和没有添加保护剂的口蹄疫纯化抗原液 146S含量。
此外,为验证本发明保护剂的保护效果,设计了对比保护剂的储存 时间实验,对比保护剂中各组分在口蹄疫抗原体系中含量为海藻糖2%、 EDTA1%、蔗糖1.5%、山梨醇0.5%、聚乙二醇1.5%。实验条件和检测 方法与上述相同。
具体检测结果见表8:
表8添加和不添加保护剂的口蹄疫抗原纯化液抗原含量下降对比
从表8的结果可知,口蹄疫纯化抗原液146S含量原始浓度为88.98 ug/ml,4℃储存12个月后146S含量仍能达到88.86ug/ml,降解率仅为 0.11%,而同期未添加保护剂的口蹄疫纯化抗原液降解率为20.9%,添 加对比保护剂的口蹄疫纯化抗原液降解率为10.1%,均远远高于添加了 本发明保护剂的口蹄疫纯化抗原液降解率。
以上对本发明的实施例进行了详细说明,但所述内容仅为本发明的 较佳实施例,并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任 何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种口蹄疫灭活病毒抗原的保护剂,其中,在所述灭活病毒抗原体系中所述保护剂各组分及含量为:1-2%海藻糖、0.3-2%棉子糖、0.5-1.5%葡聚糖、0.5-1.5%山梨醇、0.5-1%甘露醇、0.5-1.2%肌醇、0.5-1.5%木糖醇、0.2-2%聚乙二醇3350、1-5%聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)、0.5-2.5%蜂胶。
2.根据权利要求1所述的保护剂,其中,海藻糖1.5%、棉子糖1%、葡聚糖1%、山梨醇1%、甘露醇0.8%、肌醇0.7%、木糖醇0.8%、聚乙二醇3350 0.5%、TPGS 2%、蜂胶1%。
3.一种口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,所述口蹄疫微胶囊疫苗包括微囊化包被的免疫量的口蹄疫灭活病毒抗原和权利要求1~2任一项所述的保护剂。
4.根据权利要求3所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,所述口蹄疫灭活病毒抗原为A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、或Asia1型口蹄疫灭活病毒抗原;所述口蹄疫灭活病毒抗原含量为≥108.0TCID 50/mL。
5.根据权利要求3所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,所述口蹄疫灭活病毒抗原为所述口蹄疫灭活病毒抗原为猪口蹄疫病毒O/Mya98/XJ/2010株灭活全病毒抗原,或牛口蹄疫病毒A/AKT-Ⅲ株灭活全病毒抗原。
6.根据权利要求3所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,所述包被的微囊的囊材选自海藻酸钠和氯化钙、壳聚糖中的一种或多种;其中海藻酸钠的浓度为1.5%~3.5%,氯化钙的浓度为2.5%~3.5%,壳聚糖的浓度为0.1%~5%。
7.根据权利要求6所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗,其中,海藻酸钠的浓度为2%,氯化钙的浓度为3%,壳聚糖的浓度为3%。
8.一种制备权利要求3所述的口蹄疫灭活抗原微胶囊疫苗的方法,其中,所述方法包括:
步骤(1)扩增培养口蹄疫病毒,得到扩增的口蹄疫病毒;
步骤(2)将所述步骤(1)制备的口蹄疫病毒纯化、灭活,制备口蹄疫病毒灭活抗原;
步骤(3)将所述步骤(2)制备的口蹄疫病毒灭活抗原与所述的保护剂按照比例制备芯材;
步骤(4)选自海藻酸钠和氯化钙、壳聚糖中的一种或多种分别溶解于水中,其中海藻酸钠的浓度为1.5%~3.5%,氯化钙的浓度为2.5%~3.5%,壳聚糖的浓度为0.1%~5%,作为所述口蹄疫微胶囊疫苗的囊材;
步骤(5)将所述步骤(4)制备的囊材包被所述步骤(3)的芯材,得到所述口蹄疫微胶囊疫苗。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述步骤(2)的所述口蹄疫病毒灭活抗原纯度≥90%。
10.根据权利要求8所述的方法,其中,所述步骤(1)包括:10000L生物反应器全悬浮培养BHK-21细胞,细胞密度达到3-5×106/毫升时,按照病毒感染复数MOI 0.01-0.1接种口蹄疫病毒,制备病毒原液,搅拌速度不超过40rpm,培养8-12h收获病毒液,使用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片,同时收获上清和沉淀,沉淀在0.2%Triton-X-100的条件下裂解口蹄疫病毒感染细胞和细胞膜碎片,反复冻融3次后,超声3次,超声仪最大输出功率3×30s;用制备型低速连续流离心机离心收集上清液,合并上清液,其中口蹄疫病毒滴度为≥108.0TCID 50/mL。
11.根据权利要求8所述的方法,其中,所述步骤(2)包括:
步骤(a)深层过滤装置处理所述口蹄疫病毒液,所述口蹄疫病毒液与深层过滤装置接触,以300L/m2/hr~500L/m2/hr的流速过滤掉0.5pm~200pm的粒径分布的细胞碎片和颗粒,以分离目的抗原与细胞碎片和颗粒;
步骤(b)用中空纤维超滤系统或膜包浓缩、进一步纯化所述步骤(a)得到的初级纯化的所述口蹄疫病毒液;
步骤(c)将所述步骤(b)获得的所述口蹄疫病毒液经过DEAE-Sepharose FF和Sephawse6FF两步层析柱;
步骤(d)用二乙烯亚胺处理所述步骤(c)得到的所述口蹄疫病毒液进行灭活,灭活完成后用硫代硫酸钠进行阻断,得到所述口蹄疫病毒抗原。
12.根据权利要求8所述的方法,其中,所述步骤(5)包被过程包括:将所述(3)制备的芯材,与海藻酸钠溶液用磁力搅拌器500rpm搅拌混匀35min制成乳浊液,通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55m L/min的速度泵入喷雾干燥机,喷入氯化钙溶液中,形成海藻酸钙微胶囊,喷雾完毕后继续搅拌35min;所述微胶囊通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55mL/min的速度泵入通过喷雾干燥机分散到壳聚糖溶液中,充分搅拌35min,通过内径为0.8mm的硅胶管,连通蠕动泵以55mL/min的速度泵入喷雾干燥机进行干燥,制成所述口蹄疫微胶囊疫苗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811585092.9A CN109820834B (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811585092.9A CN109820834B (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109820834A CN109820834A (zh) | 2019-05-31 |
CN109820834B true CN109820834B (zh) | 2021-06-01 |
Family
ID=66861220
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811585092.9A Active CN109820834B (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109820834B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110800875A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-18 | 河南牧业经济学院 | 一种提高蛋鸡非特异性免疫的添加剂的制备方法 |
CN111467488B (zh) * | 2020-04-17 | 2023-09-01 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 一种水溶性复合免疫佐剂及其应用 |
CN113181354B (zh) * | 2021-04-25 | 2023-05-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 基于树突状细胞的口蹄疫仿生纳米疫苗及其制备方法和应用 |
CN113893340A (zh) * | 2021-09-30 | 2022-01-07 | 中牧实业股份有限公司 | 双相油佐剂口蹄疫疫苗的稳定剂及其应用 |
CN114904006B (zh) * | 2022-05-27 | 2023-10-17 | 中农威特生物科技股份有限公司 | 一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015200770A1 (en) * | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Us Biologic, Inc | Composition and method for reducing zoonotic infectious diseases |
CN107384876A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-24 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 一种用于口蹄疫疫苗146s含量检测的标准抗原及其制备方法和应用 |
CN108210919A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-06-29 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种鸭传染性浆膜炎微囊化口服疫苗的制备方法 |
-
2018
- 2018-12-24 CN CN201811585092.9A patent/CN109820834B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015200770A1 (en) * | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Us Biologic, Inc | Composition and method for reducing zoonotic infectious diseases |
CN107384876A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-11-24 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 一种用于口蹄疫疫苗146s含量检测的标准抗原及其制备方法和应用 |
CN108210919A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-06-29 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种鸭传染性浆膜炎微囊化口服疫苗的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109820834A (zh) | 2019-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109820834B (zh) | 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法 | |
KR100702086B1 (ko) | 동결 건조된 감독 a형 간염의 생 백신 및 그의 안정화제 | |
JP6406703B2 (ja) | コイ科ヘルペスウイルス−2(Cyprinidherpesvirus−2:CyHV−2)感染症用ワクチンおよびその製造方法、ならびにCyHV−2ウイルス製造方法 | |
CN106344917A (zh) | 猪瘟粘膜免疫活疫苗组合物及该疫苗的制备方法 | |
Fohlman et al. | Vaccination of Balb/c mice against enteroviral mediated myocarditis | |
CN1217212A (zh) | 甲肝-麻疹二联疫苗及其生产方法 | |
US3155589A (en) | Parenteral extravascular injectable vaccines for simultaneous immunization of canidae against rabies, canine distemper, and infectious canine hepatitis | |
EP2704740B1 (en) | Inactivated swine flu virus and methods of preparing it | |
CN114904006B (zh) | 一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用 | |
CN104548085B (zh) | 一种口蹄疫全病毒颗粒疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
JP2010065027A (ja) | 魚類のウイルス性出血性敗血症に対する不活化ワクチンとその処方 | |
CN103446182A (zh) | 高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法 | |
CN102764432A (zh) | 大鲵病毒性出血病细胞培养灭活疫苗及制备方法和应用 | |
RU2806164C1 (ru) | Ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции собак | |
CN111467488B (zh) | 一种水溶性复合免疫佐剂及其应用 | |
US3432391A (en) | Attenuated infectious canine hepatitis live virus vaccine and method of producing same | |
US3122477A (en) | Hog cholera vaccine and method of making the same | |
RU2204599C1 (ru) | Штамм № 1734 "приморский-2000" вируса ящура типа о для изготовления диагностических и вакцинных препаратов | |
JPS59137423A (ja) | トキソプラズマ症因子およびその製法 | |
RU2301079C2 (ru) | Вакцина против коронавирусной инфекции крупного рогатого скота сорбированная инактивированная | |
Polley et al. | THE USE OF BETA-PROPIOLACTONE FOR THE PREPARATION OF VIRUS VACCINES: I. SELECTION OF REACTION CONDITIONS | |
RU2056861C1 (ru) | Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и ящура и способ профилактики сибирской язвы и ящура | |
RU1405148C (ru) | Вакцина против оспы птиц и способ ее изготовления | |
JP2950273B2 (ja) | ウシロタウイルス病ワクチン | |
JPS5879929A (ja) | 日本脳炎・豚パルポ混合ワクチン |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |