CN109805159A

CN109805159A - 复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法

Info

Publication number: CN109805159A
Application number: CN201910157646.3A
Authority: CN
Inventors: 郝林; 杨晨煜; 齐文良; 许光映
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: CN109805159B

Abstract

本发明公开了一种复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，包括菌种活化、制备液体菌种、制备生产发酵剂培养基、制备生产发酵剂、制备复合菌种生产发酵剂、制备固体发酵原料、固体发酵。本发明筛选的复合菌种均符合有关规定，不产毒，安全性好。采用本发明生产的亚麻饼脱毒蛋白饲料，生氰糖苷脱除率91%，产品无异味、适口性好，产品中蛋白含量达到32.1%，其中主要为微生物蛋白，改善了蛋白质量；含有利于饲料被畜禽采食后消化的纤维素酶、糖化酶和蛋白酶，可提高饲料的利用率，含有菌种产生的有益代谢产物、活性肽等益生物质，可提高免疫力。本发明方法对固体发酵原料不进行高温灭菌处理，设备投资少、处理条件温和、生产成本低、经济效益好。

Description

复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法

技术领域

本发明属于饲料蛋白深加工技术领域，具体涉及微生物脱除亚麻饼中生氰糖苷的生产方法。

背景技术

胡麻又称亚麻，是一种经济价值较高的油料作物，胡麻籽可榨油食用外，还可用作油漆等化工原料。胡麻籽粕是胡麻籽榨油后的副产物，它富含蛋白质和膳食纤维等营养成分，可作为优质的畜禽饲料。然而，胡麻籽中含有生氰糖苷，生氰糖苷本身不呈现毒性，但含有生氰糖苷的胡麻籽饼粕被动物采食、咀嚼后，组织的结构遭到破坏，生氰糖苷与其共存的水解酶作用产生HCN （一种剧毒）可引起动物中毒。国内外学者对脱除胡麻籽饼粕中的生氰糖苷做了许多的研究，常用的脱毒方法有水煮法、溶剂浸出法、挤压法、微生物法等。水煮法脱毒是亚麻籽在足量的水中使其中的糖苷酶充分地发挥效力，最终使生氰糖苷转化成HCN并得以释放。Madhusudha等报道水煮脱毒使亚麻籽粕中的蛋白质分子发生解离，可利用赖氨酸含量下降30％。水煮法虽然脱毒率很高，但这种方法容易造成部分营养成分的损失和功能性质的变化。溶剂法主要是利用极性溶剂对生氰糖苷的浸提作用，去除粕中的二糖苷。杨宏志等研究了溶剂系统、加水量、浸提温度和浸提次数对脱毒效果的影响，结果表明，最佳工艺脱除率可达到89%。溶剂脱毒法可显著降低亚麻籽中生氰糖苷含量，脱氰成本低、工艺简单，但存在溶剂残留等食品安全风险。挤压法具有高压、高温、剪切和热处理、以及短时强烈挤压的功能，使亚麻籽中生氰糖苷的化学结构受到破坏，从而起到降低甚至完全失去毒性的目的。吴敏等采用挤压法对亚麻籽脱毒工艺进行了优化研究，在最优条件下，脱氰率可达 90%以上；在不影响生产效率的前提下，实际脱氰率也可达 83.32%。挤压法具有物料作用时间短、营养损失小等优点，但需挤压膨化机等专门设备和挤压过程难以控制及油脂浪费等是该方法的缺点。微生物法是利用微生物自身代谢过程中产生的β-葡萄糖苷酶，可以降解生氰糖苷。梅莺等研究使用酿酒酵母对亚麻饼粕中生氰糖苷进行脱毒，在对原料灭菌的条件下结合微生物作用最终脱毒率为76.91%。上述所有脱除胡麻籽饼中生氰糖苷的方法或是脱毒效果较差，或是脱除方法复杂、设备要求高、作业成本较大、经济较差。因此，亟待开发一种技术先进、设备投资少、经济合理的以亚麻饼为主要原料生产脱毒蛋白饲料方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，该方法选用多种不产生有害物质的菌种，组合在一起作为脱除亚麻饼中生氰糖苷的复合菌种，以亚麻饼为主要原料，通过固态发酵方法，生产脱毒蛋白饲料；脱除生氰糖苷效率高，设备投资少，处理条件温和，生产成本低，出品率高。

本发明是通过以下技术方案实现上述目的的。

一种复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，包括如下步骤：

（1）菌种活化

A AS2.361白地霉（Geotrichum candidum)活化将AS2.361白地霉接到斜面PDA培养基上，在25-30℃下培养5-7d，备用；

B CICC 31258扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fiburiger )活化将CICC 31258菌种接到斜面YPD培养基中，在25-30℃下培养5-7d，备用；

C AS2.112酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活化将AS2.112酿酒酵母接到斜面YPD培养基中，在25-30℃培养2-4d，备用；

D CICC 31268产朊假丝酵母（Candida utilis )活化将CICC 31268菌种接到斜面YPD培养基，在25-30℃下培养5-7d，备用。

（2）制备液体菌种

A AS2.361白地霉洁净容器中装入不加琼脂的PDA培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的AS2.361白地霉斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d。

B CICC 31258扣囊拟内孢霉洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的CICC 31258斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d。

C AS2.112酿酒酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的AS2.112酿酒酵母斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d。

D CICC 31268产朊假丝酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的CICC 31268斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d。

（3）制备生产发酵剂培养基称取玉米粉1份倒入不锈钢容器中，加玉米粉重量4-5倍的水，加热到85-95℃糊化10-15min，降温至70-82℃时，用6%-7%的盐酸调节pH至6.2，加入玉米粉重量1%的中高温淀粉酶液化2h，再降温至60-65℃时用6%-7%的盐酸调节pH至4.3，再加入玉米粉重量0.1%的糖化酶糖化4h，然后在100℃下灭酶10-15min，冷却制得玉米粉糖化液，接种前，用凉开水将糖化液再稀释一倍，得发酵剂培养基。

（4）制备生产发酵剂

A AS2.361白地霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的AS2.361白地霉液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使白地霉细胞数量达到1.2-1.8×10⁸个/mL。

B CICC 31258扣囊拟内孢霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的扣囊拟内孢霉液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.0-1.5×10⁸个/mL。

C AS2.112酿酒酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的酿酒酵母液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-30h，使酿酒酵母细胞数量达到1.2-1.6×10⁸个/mL。

D CICC 31268产朊假丝酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的产朊假丝酵母液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.0-1.5×10⁸个/mL。

（5）制备复合菌种生产发酵剂复合菌种生产发酵剂由（4）制备的下列重量份生产发酵剂组成，1份的AS2.361白地霉、2份CICC 31258扣囊拟内孢霉、1份AS2.112酿酒酵母和2份CICC 31268产朊假丝酵母。

（6）制备固体发酵原料固体发酵原料由以下重量份原料组成，80份亚麻饼，15-20份马铃薯渣，40-45份净水，0.1份硫酸铵，0.4份磷酸二氢钾，0.15份氯化钠，0.2份硫酸镁，15份（5）制备的复合菌种生产发酵剂。

（7）固体发酵将步骤（6）中除复合菌种生产发酵剂外的原料混合均匀，100℃下蒸30-50min，冷却后将步骤（5）制备的复合菌种生产发酵剂接入，升温到28-30℃发酵36-48 h翻动一次，再发酵12h，继续升温到38-42℃搅拌烘干2-3 h，得成品。

所述PDA培养基由下列原料组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18-20g，蒸馏水1000mL，0.10MPa灭菌20min。

所述YPD培养基由下列原料组成：葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母膏1g，琼脂18-20g，蒸馏水100mL，0.10MPa灭菌20min。

本发明的复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，优选如下步骤：

（1）菌种活化

A AS2.361白地霉（Geotrichum candidum)活化将AS2.361白地霉接到斜面PDA培养基上，在30℃下培养5d，备用；

B CICC 31258扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fiburiger )活化将CICC 31258菌种接到斜面YPD培养基中，在30℃培养5d，备用；

C AS2.112酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）活化将AS2.112酿酒酵母接到斜面YPD培养基中，在30℃培养72 h，备用；

D CICC 31268产朊假丝酵母（Candida utilis )活化将CICC 31268菌种接到斜面YPD培养基，在30℃下培养5d，备用。

（2）制备液体菌种

A AS2.361白地霉洁净容器中装入不加琼脂的PDA培养基，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（1）活化的AS2.361白地霉斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。

B CICC 31258扣囊拟内孢霉洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（1）活化的CICC 31258斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。

C AS2.112酿酒酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（1）活化的AS2.112酿酒酵母斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d 。

D CICC 31268产朊假丝酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（1）活化的CICC 31268斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。

（3）制备生产发酵剂培养基称取玉米粉1份倒入不锈钢容器中，加玉米粉重量4倍的水，加热到90℃糊化10min，降温至80℃时，用6%-7%的盐酸调节pH至6.2，再加入玉米粉重量1%的中高温淀粉酶液化2h，再降温至60℃时用6%-7%的盐酸调节pH至4.3，再加入玉米粉重量0.1%的糖化酶糖化4h，然后在100℃下灭酶10min，冷却制得玉米粉糖化液，接种前，用凉开水将糖化液再稀释一倍，得发酵剂培养基。

（4）制备生产发酵剂

A AS2.361白地霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为6%的（2）制备的AS2.361白地霉液体菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使白地霉细胞数量达到1.6×10⁸个/mL。

B CICC 31258扣囊拟内孢霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为6%的（2）制备的扣囊拟内孢霉液体菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.2×10⁸个/mL。

C AS2.112酿酒酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为6%的（2）制备的酿酒酵母液体菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养24h，使酿酒酵母细胞数量达到1.5×10⁸个/mL。

D CICC 31268产朊假丝酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为6%的（2）制备的产朊假丝酵母液体菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.3×10⁸个/mL。

（6）制备固体发酵原料固体发酵原料由以下重量份原料组成，80份亚麻饼，20份马铃薯渣，45份净水，0.1份硫酸铵，0.4份磷酸二氢钾，0.15份氯化钠，0.2份硫酸镁，15份（5）制备的合菌种生产发酵剂。

（7）固体发酵将步骤（6）中除复合菌种生产发酵剂外的原料混合均匀，100℃下蒸30min，冷却后将步骤（5）制备的制合菌种生产发酵剂接入，升温到30℃发酵36 h时翻动一次，再发酵12h，继续升温到40℃搅拌烘干2 h，得成品。

本发明的菌种是在大量符合有关规定、可应用于饲料生产、不产毒、安全性好的菌种中经初步筛选后，再从中选出脱除亚麻饼中生氰糖苷效果好、蛋白质含量高的菌种，最后再从中选出交互作用强的四个菌种进行复合。

本发明对固体发酵原料的处理只是针对微生物代谢需求进行了原料配比，并不做高温灭菌处理，因此，极大地降低了饲料生产的设备投入和生产成本，也显著不同于常规的制备方法。由于对亚麻饼高温（100℃以上）处理对生氰糖苷也有脱毒作用，如果对原料加以高温灭菌处理的话，本发明方法的脱毒效果将进一步提高。

采用本发明生产的亚麻饼脱毒蛋白饲料与现有微生物脱毒技术相比，具有以下优点：（1）生氰糖苷脱除率91%。实施例采集的原料中生氰糖苷含量135 mg/kg，成品中12.1mg/kg，达到中华人民共和国国家标准（GB13078-2017）饲料卫生标准中氰化物（以HCN计mg/kg）饲料原料-其它饲料原料≤50 mg/kg的限量标准。亚麻饼中常规生氰糖苷含量300 mg/kg以下，本发明方法完全适用于所有亚麻饼的脱毒处理；（2）本发明采用的四种复合菌种均符合有关规定，不产毒，安全性好；（3) 生成产品无异味、适口性好；（4）产品的蛋白含量达到32.1%，其中主要为微生物蛋白，富含17种氨基酸，包括多种动物的必需氨基酸，改善了蛋白质量；（5）产品中含有微生物产生的有益酶，包括利于饲料被畜禽采食后消化的纤维素酶、糖化酶和蛋白酶，可提高饲料的利用率；（6）产品中含有生产菌产生的有益代谢产物、活性肽等益生物质，可提高免疫力；（7）本发明方法对固体发酵原料不进行高温灭菌处理，设备投资少、处理条件温和、生产成本低、经济效益好。

下面结合实施例对本发明内容及其本发明的先进性作进一步的说明。

实施例1

本发明的复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法如下：

（1）制备PDA培养基取马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，蒸馏水1000mL，0.10MPa灭菌20min，倒入试管中倾斜放置得斜面PDA培养基；上述原料不加琼脂时得液体PDA培养基。

（2）制备YPD培养基取葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，0.10MPa灭菌20min，倒入试管中倾斜放置得斜面YPD培养基；上述原料不加琼脂时得液体YPD培养基。

（3）菌种活化将AS2.361白地霉（Geotrichum candidum) 菌种接到斜面PDA培养基上，在30℃下培养5d，备用；将CICC 31258扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fiburiger )菌种接到斜面YPD培养基中，在30℃培养5d，备用；将AS2.112酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）接到斜面YPD培养基中，在30℃培养72 h，备用；将CICC 31268产朊假丝酵母（Candida utilis )菌种接到斜面YPD培养基，在30℃下培养5d，备用。

（4）制备液体菌种 250ml三角瓶中装入液体PDA培养基70ml，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（3）活化的AS2.361白地霉斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。250ml三角瓶中装入液体酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基130ml，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（3）活化的CICC 31258斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。250ml三角瓶中装入液体酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基70ml，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（3）活化的AS2.112酿酒酵母斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d 。250ml三角瓶中装入液体酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基130ml，0.10MPa灭菌20min，冷却后接入（3）活化的CICC 31268斜面菌种，30℃恒温、160r／min振荡培养2d。

（5）制备生产发酵剂培养基称取玉米粉1公斤倒入不锈钢容器中，加4公斤净水，加热到90℃糊化10min，降温至80℃时，用6%的盐酸调节pH至6.2，再加入10g的中高温淀粉酶液化2h，再降温至60℃时用6%的盐酸调节pH至4.3，再加入1g的糖化酶糖化4h，然后在100℃下灭酶10min，冷却制得玉米粉糖化液4.8公斤，接种前加入4.8公斤凉开水，得9.6公斤发酵剂培养基。

（6）制备生产发酵剂称取0.83公斤（5）制备的生产发酵剂培养基，接入（4）制备的AS2.361白地霉液体菌种50g， 30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使白地霉细胞数量达到1.6×10⁸个/mL。称取1.67公斤（5）制备的发酵剂培养基，接入（4）制备的CICC 31258扣囊拟内孢霉液体菌种100g，30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.2×10⁸个/mL。称取0.83公斤（5）制备的发酵剂培养基，接入（4）制备的酿酒酵母液体菌种50g，30℃恒温、160r／min振荡培养24h，使酿酒酵母细胞数量达到1.5×10⁸个/mL。称取1.67公斤（5）制备的发酵剂培养基，接入（4）制备的产朊假丝酵母液体菌种100g，30℃恒温、160r／min振荡培养36h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.3×10⁸个/mL。

（7）制备复合菌种生产发酵剂将（6）制备的所有AS2.361白地霉、CICC 31258扣囊拟内孢霉、AS2.112酿酒酵母和CICC 31268产朊假丝酵母生产发酵剂混合得到5.1公斤复合菌种生产发酵剂。

（8）固体发酵称取27.2公斤亚麻饼、6.8公斤马铃薯渣、15.3公斤净水、34g硫酸铵、136g磷酸二氢钾、51g氯化钠、68g硫酸镁，混合均匀后在100℃下蒸30min，冷却后将步骤（7）制备的5.1公斤复合菌种生产发酵剂接入，升温到30℃发酵36 h时翻动一次，再发酵12h，继续升温到40℃搅拌烘干2 h，得成品34.4公斤。

经检测，采用实施例1生产的亚麻饼脱毒蛋白饲料的质量指标如下：（1) 粗脂肪1.5%；粗蛋白含量32.1%，含17种氨基酸，包括多种动物的必需氨基酸，如赖氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和精氨酸；水分含量7.9%；（2)酵母菌体细胞数7.5×10⁸个/g；（3)纤维素酶活力50.89U/g，α-淀粉酶活力156.7 U/g，中性蛋白酶活力567.42 U/g；（4）生氰糖苷含量12.1mg/kg，生氰糖苷脱除率91%（原料中生氰糖苷含量135mg/kg），达到中华人民共和国国家标准（GB13078-2017）饲料卫生标准中氰化物（以HCN计mg/kg）饲料原料-其它饲料原料≤50的限量标准。出品率高达到97%以上。

本发明复合菌种的互作增效试验

1、试验方法

以AS2.361白地霉、CICC 31258扣囊拟内孢霉、AS2.112酿酒酵母和CICC 31268产朊假丝酵母的菌种按实施例1的方法单独进行脱毒处理作为对照，以实施例1的结果作为处理，比较生产成品中生氰糖苷的含量。

2、试验结果

试验结果见表1。

从表1可见，即使选筛选出的菌种，采用单一菌种处理时脱毒效果在30%-40%之间，按照中华人民共和国国家标准（GB13078-2017）饲料卫生标准中氰化物（以HCN计mg/kg）饲料原料-其它饲料原料≤50 mg/kg的限量标准，与生产实践中亚麻饼中一般生氰糖苷含量300 mg/kg以下常识，如果要达到生产实际安全标准，亚麻饼的脱毒率必须在84%以上。对上述四种菌种进行两两或三三复合搭配，脱毒效果仍然不达上述标准，只有采用了本发明的四种菌种复合，并且制备复合菌种生产发酵剂时上述四种菌种的重量比为1：2：1：2时，才能达到91%脱毒率的效果，才能达到生产实际的要求，才有生产应用价值。

实施例2

复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法如下：

（1）制备PDA培养基、制备YPD培养基、菌种活化、制备液体菌种、制备生产发酵剂培养基同实施例1。

（2）制备生产发酵剂称取1公斤（1）制备的生产发酵剂培养基，接入（1）制备的AS2.361白地霉液体菌种50g， 30℃、120r／min振荡培养24h，使白地霉细胞数量达到1.2×10⁸个/mL。称取2公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的CICC 31258扣囊拟内孢霉液体菌种100g，26℃、160r／min振荡培养24h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.0×10⁸个/mL。称取1公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的酿酒酵母液体菌种50g，26℃、160r／min振荡培养24h，使酿酒酵母细胞数量达到1.2×10⁸个/mL。称取2公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的产朊假丝酵母液体菌种100g，30℃、120r／min振荡培养24h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.0×10⁸个/mL。

（3）制备复合菌种生产发酵剂将（2）制备的所有AS2.361白地霉、CICC 31258扣囊拟内孢霉、AS2.112酿酒酵母和CICC 31268产朊假丝酵母生产发酵剂混合得到6公斤复合菌种生产发酵剂。

（4）固体发酵称取32公斤亚麻饼、6公斤马铃薯渣、16公斤净水、40g硫酸铵、160g磷酸二氢钾、60g氯化钠、80g硫酸镁，混合均匀后在100℃下蒸40min，冷却后将步骤（3）制备的6公斤合菌种生产发酵剂接入，升温到30℃发酵48 h时翻动一次，再发酵12h，继续升温到38℃搅拌烘干3 h，得成品38.2公斤。

实施例3

复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法如下：

（2）制备生产发酵剂称取0.72公斤（1）制备的生产发酵剂培养基，接入（1）制备的AS2.361白地霉液体菌种50g， 28℃、160r／min振荡培养48h，使白地霉细胞数量达到1.7×10⁸个/mL。称取1.43公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的CICC 31258扣囊拟内孢霉液体菌种100g，30℃、120r／min振荡培养48h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.5×10⁸个/mL。称取0.72公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的酿酒酵母液体菌种50g，30℃、120r／min振荡培养30h，使酿酒酵母细胞数量达到1.6×10⁸个/mL。称取1.43公斤（1）制备的发酵剂培养基，接入（1）制备的产朊假丝酵母液体菌种100g，28℃、160r／min振荡培养40h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.5×10⁸个/mL。

（3）制备复合菌种生产发酵剂将（2）制备的所有AS2.361白地霉、CICC 31258扣囊拟内孢霉、AS2.112酿酒酵母和CICC 31268产朊假丝酵母生产发酵剂混合得到4.6公斤复合菌种生产发酵剂。

（4）固体发酵称取24.5公斤亚麻饼、6.1公斤马铃薯渣、13.8公斤净水、31g硫酸铵、124g磷酸二氢钾、45g氯化钠、62g硫酸镁，混合均匀后在100℃下蒸30min，冷却后将步骤（3）制备的4.6公斤合菌种生产发酵剂接入，升温到28℃发酵36 h时翻动一次，再发酵12h，继续升温到42℃搅拌烘干2 h，得成品31公斤。

Claims

1.一种复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，包括如下步骤：

菌种活化

D CICC 31268产朊假丝酵母（Candida utilis )活化将CICC 31268菌种接到斜面YPD培养基，在25-30℃下培养5-7d，备用；

制备液体菌种

A AS2.361白地霉洁净容器中装入不加琼脂的PDA培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的AS2.361白地霉斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d；

B CICC 31258扣囊拟内孢霉洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的CICC 31258斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d；

C AS2.112酿酒酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的AS2.112酿酒酵母斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d；

D CICC 31268产朊假丝酵母洁净容器中装入不加琼脂的酵母蛋白胨葡萄糖YPD培养基，0.10MPa灭菌15-25min，冷却后接入（1）活化的CICC 31268斜面菌种，24-30℃、100-160r／min振荡培养2-3d；

制备生产发酵剂培养基

称取玉米粉1份倒入不锈钢容器中，加玉米粉重量4-5倍的水，加热到85-95℃糊化10-15min，降温至70-82℃时，用6%-7%的盐酸调节pH至6.2，加入玉米粉重量1%的中高温淀粉酶液化2h，再降温至60-65℃时用6%-7%的盐酸调节pH至4.3，再加入玉米粉重量0.1%的糖化酶糖化4h，然后在100℃下灭酶10-15min，冷却制得玉米粉糖化液，接种前，用凉开水将糖化液再稀释一倍，得发酵剂培养基；

（4）制备生产发酵剂

A AS2.361白地霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的AS2.361白地霉液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使白地霉细胞数量达到1.2-1.8×10⁸个/mL；

B CICC 31258扣囊拟内孢霉在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的扣囊拟内孢霉液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使扣囊拟内孢霉细胞数量达到1.0-1.5×10⁸个/mL；

C AS2.112酿酒酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的酿酒酵母液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-30h，使酿酒酵母细胞数量达到1.2-1.6×10⁸个/mL；

D CICC 31268产朊假丝酵母在（3）制备的生产发酵剂培养基中接入重量比为5%-7%的（2）制备的产朊假丝酵母液体菌种，25-30℃、100-160r／min振荡培养24-48h，使产朊假丝酵母细胞数量达到1.0-1.5×10⁸个/mL；

（5）制备复合菌种生产发酵剂

复合菌种生产发酵剂由（4）制备的下列重量份生产发酵剂组成，1份的AS2.361白地霉、2份CICC 31258扣囊拟内孢霉、1份AS2.112酿酒酵母和2份CICC 31268产朊假丝酵母；

（6）制备固体发酵原料

固体发酵原料由以下重量份原料组成，80份亚麻饼，15-20份马铃薯渣，40-45份净水，0.1份硫酸铵，0.4份磷酸二氢钾，0.15份氯化钠，0.2份硫酸镁，15份（5）制备的复合菌种生产发酵剂；

（7）固体发酵

将步骤（6）中除复合菌种生产发酵剂外的原料混合均匀，100℃下蒸30-50min，冷却后将步骤（5）制备的复合菌种生产发酵剂接入，升温到28-30℃发酵36-48 h翻动一次，再发酵12h，继续升温到38-42℃搅拌烘干2-3 h，得成品。

2.根据权利要求1所述的复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，其特征在于，所述的PDA培养基由下列原料组成：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18-20g，蒸馏水1000mL，0.10MPa灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的复合菌种固态发酵亚麻饼脱毒蛋白饲料的生产方法，其特征在于，所述YPD培养基由下列原料组成：葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母膏1g，琼脂18-20g，蒸馏水100mL，0.10MPa灭菌20min。