CN109789169A - 线粒体表观遗传学重编程和移植 - Google Patents
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Abstract
本文中的实施例包括用于通过给予线粒体以及相关装置和方法来增强缺血后功能恢复的方法。在一个实施例中，包括一种用于增强缺血后功能恢复的方法。该方法可包括从患者或供体收获体细胞、将这些体细胞转化成诱导性多能干细胞、从这些诱导性多能干细胞中提取线粒体并且将这些线粒体移植到该患者中。本文还包括其他实施例。
Description
本申请在所有国家的指定申请人、美国国营公司波士顿科学医疗公司(BostonScientific Scimed,Inc.)，以及在所有国家的指定发明人、美国公民Craig Stolen和美国公民Allan Charles Shuros的名义下作为PCT国际专利申请于2017年9月25日提交，并且要求于2016年9月26日提交的美国临时申请号62/399,566的优先权，这些专利的内容通过引用整体结合在本文中。
技术领域
本文中的实施例涉及用于通过给予线粒体并且更确切地说通过给予从细胞中获取的分离的线粒体来增强缺血后功能恢复和/或提供其他益处的方法，这些细胞已通过诸如表观遗传学重编程的技术从体细胞转化成多能干细胞。
背景技术
缺血可由各种生理事件产生，这些生理事件包括心肌梗死、异常心搏节律(诸如心动过速、心动过缓等)、血栓、动脉粥样斑块破裂、冠状动脉痉挛和其他阻塞引起的事件。缺血也可由涉及血流的临时变薄或阻塞的某些医疗程序引起。
线粒体是存在于所有有核细胞中的必需细胞器，其主要功能为通过氧化磷酸化生成细胞ATP。线粒体也参与许多细胞路径，包括钙稳态、细胞凋亡、血红素生物合成和细胞信号传导。线粒体的大小、形状和结构组织以及每个细胞中这些细胞器的数目及其细胞内位置根据器官、组织和所评估的细胞的生理状态而显著改变。在心肌中，线粒体可以构成总心肌细胞体积的30％。
人类线粒体基因组为16,569个碱基对环状分子。该分子由两条链(富含鸟嘌呤链(H-链)和富含胞嘧啶链(L-链))组成。
已发现血流的临时变薄或阻塞可能不利地改变心肌线粒体结构和功能。这些结构和功能改变可能甚至在正常血流恢复之后仍持续并且可能导致心肌收缩功能和线粒体存活减少。
发明内容
本文中的实施例包括用于通过给予线粒体以及相关装置和方法来增强缺血后功能恢复的方法。在一个实施例中，包括一种用于增强缺血后功能恢复的方法。该方法可包括从患者或供体收获体细胞、将这些体细胞转化成诱导性多能干细胞、从这些诱导性多能干细胞中提取线粒体并且将这些线粒体移植到该患者中。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第二方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括选择经历产生缺血性病状的程序的患者。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第三方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括培养这些收获的体细胞、在这些培养的体细胞中表达转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4、鉴别这些诱导性多能干细胞、选择这些诱导性多能干细胞并且培养这些诱导性多能干细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第四方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括在从患者或供体收获体细胞的步骤之后培养这些体细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第五方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括在从诱导性多能干细胞中提取线粒体的步骤之前培养这些诱导性多能干细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第六方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括在提取线粒体的步骤之前调理这些诱导性多能干细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第七方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括通过将电场施加至诱导性多能干细胞来调理这些诱导性多能干细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第八方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括将仅一部分体细胞转化成诱导性多能干细胞，包括从剩余体细胞提取线粒体，并且将来自体细胞的线粒体连同来自诱导性多能干细胞的线粒体一起移植到患者或供体中。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第九方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括从患者或供体收获体细胞、将体细胞转化成诱导性多能干(iPS)细胞、在提取线粒体的步骤之前诱导诱导性多能干细胞分化、从分化的细胞中提取线粒体并且将线粒体移植到患者或供体中。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括在从分化的细胞中提取线粒体的步骤之前培养这些分化的细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十一方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括在提取线粒体的步骤之前调理这些分化的细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十二方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括通过将电场施加至分化的细胞来调理这些分化的细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十三方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括诱导iPS细胞分化成心肌细胞或非多能心肌细胞前体。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十四方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括诱导iPS细胞分化成肝细胞或非多能肝细胞前体。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十五方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括诱导iPS细胞分化成消化道细胞、肺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、胰岛细胞、睾丸或卵巢细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、胃细胞、脂肪细胞、神经元、胶质细胞、视网膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、肾细胞、表皮的皮肤细胞、真皮的皮肤细胞、红细胞、白细胞或上皮细胞。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十六方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括从患者或供体收获体细胞、重编程线粒体以在诱导性多能干细胞中实现与线粒体相关的表型变化并且将线粒体移植到患者或供体中。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十七方面，用于增强缺血后功能恢复的方法可以包括经由将线粒体DNA脱甲基化来重编程线粒体。
除了以上或以下方面中的一个或多个之外或者在一些方面的替代方案中，在第十八方面，包括具有内部体积和设置在容器的内部体积内的混合物的线粒体移植装置。该混合物可包括分离的线粒体和液体介质，其中这些分离的线粒体从作为诱导性多能干细胞的细胞或从已被诱导以从诱导性多能干细胞开始分化的分化细胞收获。
本概述是对本申请的一些传授内容的综述并且不旨在是对本发明主题的排除性或穷尽性处理。在详细说明和所附权利要求书中可找到进一步的细节。当阅读和理解以下详细说明并且查看形成该详细说明的一部分的附图时，其他方面对于本领域技术人员而言将是清楚的，这些附图中的每一个均不具有限制意义。本文的范围是由所附权利要求书和它们的法律等效物来限定。
附图说明
结合以下附图可以更完全地理解多个方面，其中：
图1是示出根据本文中的不同实施例采取的方法操作的流程图。
图2是示出根据本文中的不同实施例采取的方法操作的流程图。
图3是示出根据本文中的不同实施例采取的方法操作的流程图。
图5是根据本文中的不同实施例的线粒体移植装置的示意图。
图6是根据本文中的不同实施例的线粒体移植装置的示意图。
虽然实施例容许各种修改形式和替代形式，但这些实施例的具体形式已借助实例和附图示出，并且将进行详细描述。然而，应理解，本文的范围不局限于所描述的具体实施例。与此相反，本发明将覆盖落入本文的精神和范围内的修改、等效物、以及替代方案。
具体实施方式
本文所描述的实施例不旨在是排他性的或将本发明限制为以下详细说明中所披露的精确形式。而是，这些实施例被选择和描述成使得本领域技术人员可以了解和明白这些原理和实践。
本文中提及的所有公开物以及专利都通过引用结合在本文中。仅为了其披露内容而提供本文中披露的公开物以及专利。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明人无权优先于任何公开物和/或专利，包括本文引用的任何公开物和/或专利。
如上文所参考，缺血可不利地改变心肌细胞线粒体结构和功能并且这些作用甚至在正常氧化/血流恢复之后仍持续。解决此问题的一种方法为移植线粒体以增加或置换缺血所损害的线粒体。
然而，当不希望受到理论约束时，据信表观遗传学修饰可限制移植的线粒体的治疗潜力。术语“表观遗传学”是指不涉及潜在DNA序列的变化的可遗传基因表达变化。这样，表观遗传学变化可涉及在基因型变化的情况下的表型变化。
表观遗传学变化不仅是常规和自然的事件，而且也可受到若干种因素影响，这些因素包括年龄、环境/生活方式、慢性应激、药物使用和疾病状态。表观遗传学修饰可通常表现为其中细胞最终分化成皮肤细胞、肝细胞、大脑细胞等的方式。然而，表观遗传学变化具有更大损害作用，可能导致疾病，像癌症。至少三种系统目前被认为引起并维持表观遗传学变化，这三种系统包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA(ncRNA)-相关性基因沉默。
在形成健康胚胎的过程中，必须通过称为“重编程”的过程消除与患者的繁殖细胞相关的表观遗传学标签。重编程是重设早期胚胎的表观基因组，使得其可以形成身体内需要的任何类型的分化细胞的天然过程。
虽然不旨在受到理论约束，据信重编程从中收获线粒体的细胞可以在随后移植这些线粒体时产生益处。这样，本文中的实施例涉及从已重编程或以其他方式转化成多能干细胞(“诱导性多能干细胞”或“iPS细胞”)的细胞中获得的线粒体的移植。在一些实施例中，当线粒体处于多能状态时，它们可从iPS细胞中收获。在其他实施例中，iPS细胞可首先经历处理以使得它们分化(部分或完全)成组织特异性细胞类型诸如心肌细胞并且然后可以收获线粒体。
现在参见图1，示出根据本文中的实施例的利用未分化的诱导性多能干(iPS)细胞增强患者中的缺血后功能恢复的方法100的流程图。方法100可以包括在操作102中从患者112中收获体细胞114。方法100可以还包括在操作104中将体细胞114转化成iPS细胞118。方法100可以还包括在操作106中从iPS细胞118中提取线粒体120。方法100可以还包括在操作108中将线粒体120移植到患者112中。这些步骤的方面在下文中进一步描述。
在一些实施例中，本文中的方法可以还包括选择经历产生缺血性病状的程序的患者。在一些实施例中，方法包括选择经历产生或可能产生缺血性病状的生理事件的患者。此类生理事件包括但不限于心肌梗死、异常心搏节律诸如心动过速、心动过缓等、血栓、动脉粥样斑块破裂、冠状动脉痉挛和其他阻塞引起的事件。此类缺血性病状可以包括但不限于心肌缺血、神经病学缺血、肠缺血、肝缺血、肾缺血等。在一些实施例中，方法可以包括鉴别多位或鉴别一位正表现出缺血性病状的症状的患者。
在一些实施例中，本文中的方法可以包括选择经历产生缺血性病状的药物诱导事件的患者。此类药物诱导事件可以包括但不限于药物诱导性冠状血管痉挛或药物诱导性冠动脉血栓形成。可导致这些事件的特定药物包括但不限于可卡因、β肾上腺素能激动剂、拟交感神经药、苯肾上腺素、麦角生物碱、曲普坦类、依那普利、硝苯地平、米诺地尔、肼苯哒嗪、硝普盐、腺苷、双嘧达莫、HIV药剂/蛋白酶抑制剂、罗格列酮、雌激素、口服避孕药、NSAID、COX-2抑制剂、及类似物。这样，在一些实施例中，该方法可以包括鉴别多位或鉴别一位目前正服用或已服用任何这些药物的患者。
在一些实施例中，本文中的方法可以包括选择经历产生缺血性病状的医疗程序的患者。此类医疗程序可以包括导致血流阻塞或变薄的任何医疗程序。此类医疗程序可以包括但不限于CABG(冠状动脉旁路搭桥术)、气囊血管成形术、经皮医疗装置放置程序(包括放置支架、瓣膜、植入物等)、器官移植、其他心脏程序等。
在一些实施例中，本文中的方法可以包括将线粒体移植到在医疗程序之前或期间储存短时间的组织或器官中，或者使用诸如冷冻保存的技术长期储存的组织或器官中。
在一些实施例中，本文中的方法可以包括将体细胞转化成iPS细胞。将体细胞转化成iPS细胞可以包括培养收获的体细胞；在培养的体细胞中表达转录因子八聚体结合转录因子4(Oct4)、性别决定区Y-框2(Sox2)、骨髓细胞瘤病癌基因细胞同源物(c-Myc)和Krueppel样因子4(Klf4)；鉴别iPS细胞；选择iPS细胞；并且培养iPS细胞。在一些实施例中，将iPS细胞培养成完全建立的iPS细胞系。
在一些实施例中，本文中的方法可以包括在从患者中收获体细胞的步骤之后培养体细胞。在一些实施例中，方法包括在从iPS细胞提取线粒体的步骤之前培养iPS细胞。在一些实施例中，方法包括在提取线粒体的步骤之前调理iPS细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。在一些实施例中，在提取线粒体的步骤之前调理iPS细胞可以包括将电场施加至细胞。在一些实施例中，调理iPS细胞可以包括将生长因子、细胞因子或其他小分子施加至细胞。在一些实施例中，调理iPS细胞可以包括使细胞经历靶向环境诸如靶向移植环境的模拟环境。在一些实施例中，调理iPS细胞可以包括使细胞连续或以脉冲方式(诸如通过模拟与心搏相关的机械应力)经历机械应力。
在一些实施例中，本文中的方法包括将仅一部分收获的体细胞转化成iPS系统、从剩余体细胞提取线粒体并将来自体细胞的线粒体连同来自iPS细胞的线粒体一起移植到患者中。
在一些实施例中，线粒体的移植可能是自体的，使得从将随后接受移植的同一患者中收获细胞(如图2所示)。这可能在缺血性事件或程序的时间可以预测的情景下特别有效。例如，在经历将导致缺血性病状或具有导致缺血性病状的风险的医疗程序的患者的背景下，细胞(或通常为组织样品)可以提前从该患者中获得。
然而，在一些实施例中，线粒体的移植可能是非自体的。例如，可能更难以允许细胞重编程和线粒体提取的方式从患者中获得细胞。例如，在经历导致缺血性病状的突然生理事件的患者的背景下，可能难以或不可能获得细胞样品或组织样品并及时处理该样品以实现对该患者的治疗益处。这样，在一些实施例中，细胞或组织可以从除最终接受线粒体移植的患者之外的供体收获。因此，在一些情况下，移植可以是同种异体的或同基因的。参见图2，示出非自体移植方法200的图。图2类似于图1。然而，并未从患者112收获细胞，而是从供体212收获细胞。
将了解的是，本文中的方法可由图1所示的方法改变。例如，在一些实施例中，在将收获的体细胞转化成iPS细胞之后，诱导这些细胞分化成分化的组织类型，之后提取线粒体。现在参见图3，示出根据本文中的实施例的利用iPS细胞增强患者中的缺血后功能恢复的方法300的流程图。方法300可以包括在操作102中从患者112中收获体细胞114的操作。方法300可以还包括在操作104中将体细胞114转化成iPS细胞118。该方法可以还包括在操作302中诱导iPS细胞118分化以形成分化的细胞316。该方法可以还包括在操作304中从分化的细胞316中提取线粒体318。该方法可以还包括在操作306中将来自分化的细胞316的线粒体318移植到患者112中。
在一些实施例中，方法300包括选择经历产生缺血性病状的程序的患者。在一些实施例中，方法300包括选择经历产生缺血性病状的生理缺血事件(例如，心肌缺血、中风、肠缺血、肝缺血、肾缺血、锻炼诱导性心肌缺血等)的患者。在一些实施例中，方法300包括选择经历产生缺血性病状的药物诱导事件的患者。
在一些实施例中，方法300包括将体细胞转化成iPS细胞。将体细胞转化成iPS细胞可以包括培养收获的体细胞；在这些体细胞中表达转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；鉴别iPS细胞；选择iPS细胞；并且培养iPS细胞。在一些实施例中，将iPS细胞培养成完全建立的iPS细胞系。
在一些实施例中，方法300包括在从患者中收获体细胞的步骤之后培养体细胞。在一些实施例中，方法300包括在分化iPS细胞的步骤之前培养iPS细胞。在一些实施例中，方法300包括在从分化的细胞提取线粒体的步骤之前培养分化的细胞。在一些实施例中，方法300包括在提取线粒体的步骤之前调理分化的细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。
在一些实施例中，诱导iPS细胞分化包括诱导iPS细胞分化成心肌细胞或非多能心肌细胞前体。在一些实施例中，诱导iPS细胞分化包括诱导iPS细胞分化成肝细胞或非多能肝细胞前体。
在一些实施例中，当iPS细胞分化成心肌细胞或非多能心肌细胞前体时，调理步骤可包括将电场施加至细胞,将生长因子、细胞因子或其他小分子施加至细胞,使细胞经历靶向环境诸如靶向移植环境的模拟环境和/或使细胞连续地或以脉冲方式(诸如通过模拟与心搏相关的机械应力)经历机械拉伸或应力。
应注意，可以诱导iPS细胞分化成代表全部三个胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的任何其他细胞类型。可以诱导iPS细胞分化，以包括但不限于消化道细胞、肺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、胰岛细胞、睾丸或卵巢细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、胃细胞、脂肪细胞、神经元、胶质细胞、视网膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、肾细胞、皮肤细胞、红细胞、白细胞、上皮细胞等或其任何非多能祖细胞。
在一些实施例中，线粒体可以在从一个或多个细胞中提取之后重编程。现在参见图4，示出根据本文中的实施例的用于增强缺血后功能恢复的方法400的流程图。方法400可以包括在操作102中从患者中收获体细胞114的步骤。方法可以还包括在操作402中从体细胞114中提取线粒体418。方法可以还包括在操作404中重编程线粒体418以在iPS细胞中实现与线粒体418相关的表型变化。方法可以还包括在操作406中将重编程的线粒体420移植到患者112中。在一些实施例中，重编程线粒体包含将线粒体DNA脱甲基化。
收获体细胞
根据本文中的实施例可以使用各种各样的体细胞类型。在一些实施例中，可以有利的是从允许使用微创技术的位置中收获体细胞。可以从此类位置中收获的体细胞包括但不限于以下各项：来自常规皮肤活检物的皮肤细胞；来自口腔拭子的颊上皮细胞；来自血液样本的血细胞；来自尿液样本的肾管状成纤维细胞；来自肌肉穿刺活检物的骨骼肌细胞；以及来自毛发样本的毛囊角化细胞。将了解的是，其他体细胞类型可以从身体内需要较大创口技术的其他位置收获，包括但不限于心肌细胞、胃细胞、肝细胞、脾细胞、胰岛细胞、肺细胞、骨细胞、神经元、脂肪细胞、软骨细胞等。在一些实施例中，体细胞可以从哺乳动物收获。在一些实施例中，体细胞可以从人类收获。
所收获的组织和细胞的小心处理对于形成均匀的细胞群可能是重要的。结缔组织和较大不需要的物质的去除可以通过机械分离过程来进行。各种酶促和机械技术可以用于进一步分离感兴趣的体细胞与周围组织。酶诸如胰蛋白酶、胃蛋白酶、胶原酶等可以用于从所收获的样品中去除不需要的细胞外物质。额外分离技术诸如差速离心、差速过滤和FACS分析也可以用于从异源组织或细胞样品分离特定体细胞群。
将体细胞转化成iPS细胞
体细胞到iPS细胞的转化可以通过利用显示有效于将分化的细胞转化回多能状态的特定因子来完成。根据Takahashi和Yamanaka,Cell[细胞]126,663-676,2006的方法，已显示至少转录因子Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc的使用有效于由各种体细胞类型形成iPS细胞。将体细胞转化成iPS细胞的结果也可以导致细胞内的线粒体的重编程。将体细胞转化成iPS细胞的方面描述于美国专利号8,058,065，该专利的内容通过引用结合在本文中。
由将体细胞转化成iPS细胞引起的线粒体重编程的特征可为线粒体表型的变化。在细胞中线粒体重编程期间可观察到的表型变化可包括线粒体形态、超微结构、线粒体数目和活性、mtDNA完整性、线粒体代谢以及mtDNA表观遗传学诸如mtDNA甲基化或脱甲基化的变化。
体细胞转化成iPS细胞可以包括使用各种方法引入编码所希望的转录因子的遗传物质(即DNA或RNA)，并且可以根据选择哪种类型的体细胞用于转化来定制。在一些情况下，逆转录病毒和慢病毒载体的使用可导致遗传物质稳定整合到体细胞的宿主基因组中。逆转录病毒和慢病毒转导技术引起转录因子在细胞内的组成活性表达。在一些情况下，诱导型逆转录病毒和慢病毒载体可以用于提供使用抗生素选择对转录因子表达进行的更严格控制。用于将遗传物质整合到体细胞的宿主基因组中的额外方法可以包括Cre-LoxP重组系统和基于转座子的整合系统。
也可以采用用于将遗传物质引入到体细胞中的其他非整合方法。在一些实施例中，仙台病毒的使用可以将编码转录因子的遗传物质引入到体细胞中。使用仙台病毒的一种不同优点为，它不会引起遗传物质整合到宿主基因组中，而是在细胞的胞质中完整完成转录因子的表达，不会破坏宿主基因组。非整合引入遗传物质的额外方法包括使用腺病毒载体、腺相关病毒载体和各种质粒表达载体。
在一些实施例中，蛋白质转染技术可以用于在不使用遗传物质的情况下将希望的转录因子递送到体细胞中以诱导分化。
从细胞中提取线粒体
可以从直接自患者收获的细胞或组织中或者从自细胞培养物获得的细胞中提取(或分离)线粒体。还可以直接从iPS细胞收获线粒体。在一些实施例中，从细胞或组织提取线粒体的过程以从其余细胞物质中分离线粒体开始。在从患者收获的组织样品的情况下，可以通过酶促或机械技术或二者从周围细胞外物质中分离细胞。希望导致释放到完整细胞器诸如线粒体的溶液中的机械分离技术。在一些情况下，从组织样品中机械分离细胞可以包括使用研钵和研棒、搅拌器、杜恩斯匀浆器、注射器和针、超声破碎法等。在一些情况下，商用分离试剂盒诸如QproteomeTM线粒体分离试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚凯杰(Qiagen,Valencia,CA))可以用于分离线粒体。在一些情况下，机械分离也可以用于裂解细胞培养样品的细胞膜。在一些情况下，细胞可以使用细胞裂解和提取缓冲液裂解，该缓冲液被设计以破开细胞膜并将完整线粒体释放到溶液中以用于进一步纯化。
将了解的是，在一些实施例中，可以利用差速离心，以分离组织样品或细胞培养样品的线粒体级分与其余组织或细胞物质。差速离心为根据较大细胞和细胞外物质将在较低离心力下从溶液中沉淀出来并且较小物质将在较高离心力下从溶液中沉淀出来的原理起作用的分离技术。典型地已发现线粒体的大小为约0.5-10μm。
将了解的是，在一些实施例中，可以使用差速过滤方法从组织或细胞样品中分离线粒体。在差速过滤中，可以使均质化细胞样品穿过相继更小的孔过滤器以分离线粒体级分与其余细胞物质。
完全从组织或细胞样品中提取的线粒体级分可以在进一步使用之前悬浮于线粒体呼吸缓冲液中。关于分离线粒体的方面可见于公开的申请号PCT/US2015/035584(WO2015/192020)和美国专利号7,407,800中，这些专利的内容通过引用结合在本文中。
将线粒体移植到患者中
将线粒体移植到患者中可以通过多种技术来发生。在一些实施例中，当希望将线粒体移植到心脏缺血区域时，可以通过使用注射器或类似装置直接注射到缺血心肌中来移植线粒体。在一些实施例中，线粒体可以注射到缺血心肌周围和内部的一个或多个位置中。在一些实施例中，线粒体可以通过经由冠状动脉进行冠状动脉内输注来移植到缺血心肌中。在一些实施例中，移植线粒体可以在开心手术过程中或在胸廓切开术中发生。在一些实施例中，线粒体可以注射到肾、肝、胰腺、骨骼肌或肺的缺血组织或缺血组织的周围血管中。在一些实施例中，线粒体在多个部位处注射。在一些实施例中，制备线粒体和缓冲液的溶液，使得线粒体的浓度为约2x105至2x108个线粒体/毫升之间。在一些实施例中，所注射的量为每个注射部位0.05mL与0.3mL之间。在一些实施例中，所注射的量为每个注射部位0.1mL。
设置在适合介质内的线粒体可以临时储存在容器诸如袋、包、注射器或套管套筒或类似容器中。在本文的不同实施例中，包括线粒体移植装置。线粒体移植装置可以包括限定内部体积的容器。线粒体和适合介质的混合物可以设置在容器的内部体积内。线粒体和适合介质的混合物的总体积可以是从约0.05ml至约1000ml。在一些实施例中，线粒体和适合介质的混合物的总体积可以是从约0.1ml至约50ml。
现在参见图5，示出了根据本文中的不同实施例的线粒体移植装置500。移植装置500可以包括套筒502和柱塞504。套筒502可以限定线粒体510和适合介质508的混合物可设置的内部体积。应了解的是，该装置可以采用许多不同的特定形式。现在参见图6，示出了根据本文中的不同实施例的另一种线粒体移植装置600。线粒体移植装置600可以包括限定内部体积604的袋602。线粒体510和适合介质508的混合物可以设置在袋602的内部体积604内。
在一些实施例中，混合物的介质可以是缓冲液。在一些实施例中，缓冲液可以是呼吸缓冲液。缓冲液可以包括不同组分，包括但不限于糖(诸如蔗糖)、盐(诸如磷酸二氢钾、氯化镁、谷氨酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐)和其他组分(诸如HEPES缓冲液、EGTA(乙二醇-双(β-胺基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸)、二磷酸腺苷(ADP))以及类似物。在一个特定实施例中，呼吸缓冲液可以包括约250mmol/l蔗糖、2mmol/l KH2PO4、10mmol/l MgCl2、20mmol/l K+-HEPES缓冲液、pH 7.2、0.5mmol/l K+-EGTA、pH 8.0、5mmol/l谷氨酸盐、5mmol/l苹果酸盐、8mmol/l琥珀酸盐以及1mmol/l ADP。
培养细胞
从患者分离的体细胞或通过转化体细胞形成的iPS细胞的培养可以在实验室中使用已建立的细胞培养技术来完成。细胞培养基和条件可以基于正在扩增的细胞类型来选择。生长所需要的各种补充剂为组织特异性的并且包括但不限于生长因子、细胞因子、含血清培养基、无血清培养基、氧、二氧化碳、抗生素、表面活性剂、氨基酸等。在一些情况下，可以使用来自饲养细胞培养物的调理培养基为培养的细胞提供营养素和分泌因子。在一些情况下，iPS细胞可以连同饲养细胞群一起培养。
可以在各种细胞培养容器和环境中培养细胞。在一些实施例中，细胞培养容器可以包括涂覆或未涂覆的平底塑料碟或烧瓶。在一些实施例中，细胞培养容器可以包括滚瓶、旋转摇瓶、中空纤维细胞培养系统或发酵容器。温度和湿度可以在细胞培养过程中得到控制。在一些情况下，孵育的温度为37℃或约37℃。在一些情况下，孵育的温度为25℃-45℃或约25℃-45℃。在一些实施例中，孵育来源的温度保持在5％或约5％。在一些实施例中，孵育来源的湿度保持在0-20％或约0-20％。
保持细胞培养需要定期传代培养。细胞群的定期传代培养确保细胞保持指数生长并且确保足够的营养素用于维持健康的活培养物。在一些实施例中，细胞每24小时传代培养。在一些实施例中，细胞每24-48小时传代培养。在一些实施例中，细胞生长至80％汇合。在一些实施例中，细胞生长至100％汇合。
选择患者和患者类别
选择将受益于本文所体现的方法的患者可能涉及选择正在经历或已经历产生缺血性病状的程序或事件的那些个体。缺血可能基于各种原因发生在患者的器官或组织内。在一些情况下，患者可以选自经历开心手术或胸廓切开术的那些患者，这些手术可能在心肌的局部区域处引起缺血性事件。在一些情况下，患者可以选自经历在组织或器官中产生缺血性病状的生理缺血事件(例如，心肌缺血、中风、肠缺血、肝缺血、肾缺血、锻炼诱导性心肌缺血等)的那些患者。在一些实施例中，患者可以选自经历产生缺血性病状的药物诱导事件的那些患者。在一些实施例中，患者可以选自经历心脏、肝、骨骼肌、胰腺、肾或肺的缺血的那些患者。
在一些情况下，根据本文中的实施例的线粒体移植可以使患有许多线粒体疾病、线粒体肌病和相关病症中的任一者的患者受益。在一些实施例中，根据本文中的实施例的线粒体移植可以用于增强运动表现。
存在线粒体功能的各种标记。作为实例，据信细胞色素氧化酶为受损线粒体功能的指示物。具体而言，可以测量细胞色素氧化酶mRNA水平并且减少可以指示线粒体功能受损。作为另一个实例，可以测量细胞色素氧化酶本身的活性并且活性减小可以指示线粒体功能受损。在一些实施例中，该方法可以包括评价患者的线粒体功能的标记。在一些实施例中，该方法可以包括测量细胞色素氧化酶mRNA水平。在一些实施例中，该方法可以包括测量细胞色素氧化酶活性。
调理细胞以增强线粒体数目/功能
将了解的是，调理分化的细胞以增强线粒体数目或线粒体活性可以依赖于所形成的分化的细胞的类型。在一些实施例中，当iPS细胞分化成心肌细胞或骨骼肌细胞时，调理步骤可包括将电场施加至细胞，将生长因子、细胞因子或其他小分子施加至细胞、使细胞经历靶向环境诸如靶向移植环境的模拟环境和/或使细胞连续地或以脉冲方式(诸如通过模拟与心搏相关的机械应力)经历机械拉伸或应力。
在一些情况下，也可以外部或内部施加外部力量或药剂，诸如生长因子、转录因子、复制因子、酶、激素、辅助因子、小分子、糖、药物化合物、DNA、RNA、蛋白质等，以调理分化的细胞，并且这些外部力量或药剂取决于细胞类型。
线粒体数目和线粒体活性可以通过多种生物化学和分子生物学方法来确定。在一些情况下，线粒体数目可以通过血细胞计数法，定量线粒体DNA(mtDNA)，线粒体质量测定或其他分子可视化技术诸如共聚焦显微镜、电子显微镜或活细胞成像显微镜等来测定。在一些实施例中，线粒体数目可以通过可商购获得的试剂盒来测定。在一些情况下，线粒体活性可以通过酶促报告测定、高分辨率呼吸测定法或流式细胞术等在体内测定。
将iPS细胞分化成心肌细胞或非多能前体
将iPS细胞分化成代表全部三个胚层的任何细胞类型的方法可以依赖于希望的细胞类型。在一些实施例中，iPS细胞定向分化成心肌细胞或其非多能前体的方法可包括操纵参与分化过程的Wnt、激活素、Nodal、TGFβ、BMP和FGF信号传导途径和生长因子。在一些实施例中，将iPS细胞定向分化成细胞类型诸如消化道细胞、肺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、胰岛细胞、睾丸或卵巢细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、肝细胞、胃细胞、脂肪细胞、神经元、胶质细胞、视网膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、肾细胞、表皮的皮肤细胞、真皮的皮肤细胞、红细胞、白细胞、上皮细胞等或其任何非多能祖细胞的方法可以通过操纵负责最终分化成希望的细胞类型中的任一者的细胞信号传导途径来定制。用于将多能干细胞转化成分化的细胞的技术描述于US2015/0299658，该专利的内容通过引用结合在本文中。
直接重编程线粒体
线粒体DNA(mtDNA)是母系遗传的并且在自然界中是无核的。mtDNA编码呼吸链中可见的13种亚基蛋白质和对RNA有特异性的24种非编码基因。核DNA中可见的表观遗传学修饰诸如DNA甲基化同样可见于mtDNA中。当将甲基添加至DNA核苷酸胞嘧啶或腺嘌呤中时发生DNA甲基化，并且DNA甲基化不会改变mtDNA序列。DNA脱甲基化通过DNA修复的机制(包括负责碱基切除修复的那些机制)来发生。
在一些实施例中，mtDNA直接在从体细胞中分离的线粒体内重编程。在一些实施例中，mtDNA的重编程可涉及将分离的线粒体与不同DNA修复酶一起孵育，这些DNA修复酶含有将它们靶向递送至线粒体的编码序列并导致mtDNA脱甲基化。在一些实施例中，mtDNA的重编程可涉及用编码导致mtDNA脱甲基化的DNA修复酶的遗传物质转染线粒体。在一些实施例中，mtDNA的重编程可涉及使用病毒载体诸如腺病毒、腺相关病毒和类似病毒转染线粒体以引入编码导致mtDNA脱甲基化的DNA修复酶的遗传物质转染线粒体。
线粒体的直接重编程或体细胞转化成iPS细胞可以引入mtDNA突变。在一些实施例中，可以对mtDNA测序以在线粒体或细胞重编程事件之后确定mtDNA完整性。在一些实施例中，可执行线粒体基因阵列以确定可在重编程或细胞转化事件过程中引起的基因表达或mtDNA序列异常。
参考以下实例可以更好地理解各方面。这些实例旨在代表特定实施例，但不旨在限制本文中的实施例的总体范围。
实例
实例1：重编程体细胞并提取线粒体
从患者获得组织样品。组织样品含有体细胞。切开组织样品并分离细胞。
然后根据Takahashi和Yamanaka,Cell[细胞]126,663-676,2006的方法重编程细胞。具体而言，在胚胎干细胞培养条件下引入四种因子(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)。
在5mL体积的分离缓冲液(300mmol/L蔗糖、10mmol/L HEPES–KOH、1mmol/L EGTA-KOH、pH 7.4)中将组织均质化并且然后在冰上用枯草杆菌蛋白酶A酶促消化处理10分钟。然后通过一系列过滤器(40、40和10uM)过滤消化的组织，用分离缓冲液预先润湿，并且随后通过在9×g下在4℃下离心10分钟来沉淀线粒体。
通过血细胞计数器或通过粒子计数器来计数线粒体。然后将线粒体悬浮于新鲜制备的呼吸缓冲液(250mmol/l蔗糖、2mmol/l KH2PO4、10mmol/l MgCl2、20mmol/l K+-HEPES缓冲液、pH 7.2、0.5mmol/l K+-EGTA、pH 8.0、5mmol/l谷氨酸盐、5mmol/l苹果酸盐、8mmol/l琥珀酸盐以及1mmol/l ADP)中。
实例2：将诱导性多能线粒体移植到患者中
将如上文所制备的线粒体悬浮于呼吸缓冲液中。然后将线粒体和呼吸缓冲液混合(大约2×107个细胞/ml)并且使用注射器(具有标准18G针的结核菌素注射器)注射到患者中。具体而言，将混合物以0.1mL/部位注射到缺血心肌的多个部位处。
应该注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非内容另外清楚地指明。因此，例如，引用一种含有“一种化合物”的组合物包括两种或更多种化合物。还应该注意的是，术语“或”一般以包括“和/或”的意思使用，除非内容另外清楚地指明。
还应该注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所使用，短语“配置”描述了构建或配置成进行具体任务或采取具体配置的系统、设备或其他结构。短语“配置”可以与其他类似的短语如“安排并配置”、“构建并安排”、“构建”、“制造并安排”等可互换使用。
本说明书中的所有出版物和专利申请指示本发明所涉及的领域中的普通技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用结合在本文中，其程度如同每个单独的出版物或专利申请确切地并且单独地通过引用指明一样。
已经参考不同的特定的和优选的实施例和技术描述了多个方面。但是应理解的是，在留在本文的精神和范围之内的同时可以进行许多变化和修改。
Claims (15)
1.一种用于增强缺血后功能恢复的方法，该方法包括：
从患者或供体收获体细胞；
将这些体细胞转化成诱导性多能干细胞；
从这些诱导性多能干细胞中提取线粒体；并且
将这些线粒体移植到该患者中。
2.如权利要求1所述的方法，该方法还包括选择经历产生缺血性病状的程序的患者。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法，其中将这些体细胞转化成诱导性多能干细胞包括以下步骤：
培养这些收获的体细胞；
在这些培养的体细胞中表达转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；
鉴别这些诱导性多能干细胞；
选择这些诱导性多能干细胞；并且
培养这些诱导性多能干细胞。
4.如权利要求1或2中任一项所述的方法，该方法还包括在从该患者或该供体收获这些体细胞的步骤之后培养这些体细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，该方法还包括在从这些诱导性多能干细胞中提取线粒体的步骤之前培养这些诱导性多能干细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，该方法还包括在提取线粒体的步骤之前调理这些诱导性多能干细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中仅一部分这些体细胞被转化成诱导性多能干细胞，该方法还包括
从这些剩余体细胞中提取线粒体，并且
将来自这些体细胞的线粒体连同来自这些诱导性多能干细胞的这些线粒体一起移植到该患者或供体中。
8.一种用于增强缺血后功能恢复的方法，该方法包括：
从患者或供体收获体细胞；
将这些体细胞转化成诱导性多能干(iPS)细胞；
在提取线粒体的步骤之前诱导这些诱导性多能干细胞分化；
从这些分化的细胞中提取线粒体；并且
将这些线粒体移植到该患者或供体中。
9.如权利要求8所述的方法，该方法还包括选择经历产生缺血性病状的程序的患者。
10.如权利要求8或9中任一项所述的方法，其中将这些体细胞转化成诱导性多能干细胞包括以下步骤：
培养这些收获的体细胞；
在这些培养的体细胞中表达转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4；
鉴别这些诱导性多能干细胞；
选择这些诱导性多能干细胞；并且
培养这些诱导性多能干细胞。
11.如权利要求8或9中任一项所述的方法，该方法还包括在从该患者或供体收获这些体细胞的步骤之后培养这些体细胞。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，该方法还包括在从这些分化的细胞中提取线粒体的步骤之前培养这些分化的细胞。
13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，该方法还包括在提取线粒体的步骤之前调理这些分化的细胞以便增强线粒体数目或线粒体活性。
14.一种用于增强缺血后功能恢复的方法，该方法包括：
从患者或供体收获体细胞；
从这些体细胞中提取线粒体；
重编程这些线粒体以在诱导性多能干细胞中实现与线粒体相关的表型变化；并且
将这些线粒体移植到该患者中。
15.一种线粒体移植装置，其包含：
限定内部体积的容器；
设置于该容器的该内部体积内的混合物，该混合物包含
分离的线粒体，其中这些分离的线粒体从作为诱导性多能干细胞的细胞或从已被诱导以从诱导性多能干细胞开始分化的分化细胞收获；以及
液体介质。
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