CN109781691B - 一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法 - Google Patents
一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，该方法步骤如下：（1）制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；（2）制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒；（3）制备纳米微球‑氯霉素荧光探针；（4）氯霉素荧光试纸条构建和检测方法。（5）将氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；（6）将待测样品加入到步骤（5）中的酶标板的孔中；（7）向步骤（6）的酶标板孔中插入层析试纸条，得到检测结果。本发明提高了荧光探针的稳定性和灵敏度；本发明制备聚苯乙烯纳米荧光微球探针，不存在Eu(DBM)3phen泄露问题，构建的氯霉素荧光试纸条稳定性好，灵敏度高，具有巨大的商业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于材料、生物、生物检测等交叉领域，特别涉及基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法。
背景技术
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)又叫左旋霉素，是一种用于治疗伤寒、脑膜炎和尿路感染等疾病的酰胺醇类抗生素类药物，该药物能有效抑制炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌、李斯特菌、葡萄球菌以及衣原体、立克次氏体等病原微生物。毒理学研究表明，CAP对人体具有较大的毒副作用，主要表现为：抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血、细胞减少性贫血、血小板减少和粒状白细胞减少。另外，该药物理化性质极为稳定，可通过食物链在人体内蓄积，从而对人体健康造成严重损害。
稀土元素具有独特的发光特性，已被开发出多种发光材料，Eu(DBM)3phen是典型代表。与量子点等荧光转换元件相比，该物质具有发射光谱窄、Stokes位移大、荧光寿命长、可同时发射多波长荧光等特点，是理想的荧光信号。
将Eu(DBM)3phen参杂到某些基体中，能顺利的得到功能化荧光基材。将Eu(DBM)3phen参杂或包埋到硅球和聚苯乙烯微球中已有文献报道。二氧化硅微球表面惰性，性质稳定，但不适合与抗体等分子识别元件偶联。羧基化的聚苯乙烯微球对Eu(DBM)3phen已有报道，如彭超(彭超.含稀土配合物的荧光编码聚苯乙烯微球的制备与表征[D].天津大学,天津，2012.)通过苯乙烯与甲基丙烯酸甲酯共聚制备出微米级微球，再经水解作用得到羧基化聚苯乙烯微球，通过溶胀法得到Eu(DBM)3phen参杂的聚苯乙烯荧光微球，该方法制备的微球直径为微米级，不适合生物探针的应用，且羧基化过程繁琐。将苯乙烯与丙烯酸共聚获得羧基化聚苯乙烯微球，避免了水解酯的步骤，但合成方法繁琐，聚合物的侧链简单，获得微球热稳定性和化学稳定性有待提高。
发明内容
发明目的
本发明解决的技术问题是针对当前缺乏快速、简便、灵敏度高、准确的检测氯霉素的方法，提供一种利用纳米荧光探针检测氯霉素的方法。该方法灵敏度高、快速、操作简便、稳定性好，可广泛推广用于氯霉素检测。
技术方案
一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒直径为110±5nm；
(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒：
取步骤(1)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8-4.2℃下磁力搅拌大于等于4小时；
去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；
(3)利用步骤(2)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球-氯霉素荧光探针；
(4)利用氯霉素-牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；
(5)将步骤(3)制备的纳米微球-氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；
(6)将待测样品加入到步骤(5)中的酶标板的孔中；
(7)向步骤(6)的酶标板孔中插入步骤(4)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4-5分钟后得到检测结果。
步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将甲基丙烯酸(95.5％)加入0.5％的过硫酸钾溶液中，500-600转/分钟下搅拌3-5分钟；然后加入苯乙烯(95.5％)，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在惰性气体保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；甲基丙烯酸，过硫酸钾溶液，苯乙烯之间的体积比为1:50:3；
反应结束后在4500-5000rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000-12000rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤大于等于5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用。
步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与十二烷基磺酸钠溶液的质量体积比为100-110mg：5mL；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液浓度为0.2-0.25％；步骤(2)中的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液浓度为0.05mol/L，pH为6.0。
步骤(2)中的聚苯乙烯纳米微球与Eu(DBM)3phen的质量比为10：0.8-1；步骤(2)中的十二烷基磺酸钠溶液与二氯甲烷溶剂的体积比为5：1-1.5。
步骤(3)所述纳米微球-氯霉素荧光探针，由包括以下步骤的方法制得：
将步骤2制备的荧光聚苯乙烯纳米微球2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液悬浮液超声分散10-15分钟；
取10-15μL超声分散好的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮液分散于990-1000μL2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，得反应液A；
迅速取10-15μL溶剂为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化溶液加入反应液A中，混匀，在18～37℃温度下，搅拌条件下活化50-60分钟；
活化结束后，在10000-15000rpm条件下离心分离，固体分散于200-250μL磷酸盐缓冲液中，得反应液B；
取800-900μL氯霉素抗体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到反应液B中，立即涡旋混匀，超声3-5分钟后，18～37℃温度下反应2～4小时，得反应液C；
向反应液C中加入70-80μL 0.2mol/L的甘氨酸，封闭1.5-2.0小时，再加入20-50μL10％牛血清白蛋白溶液，封闭10-12小时；
将反应液C 10000-15000rpm离心20-25分钟，收集沉淀，沉淀悬浮于1-1.5mL含有0.1％Tween-20、1％牛血清白蛋白、0.01％Procline 300的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液中。
步骤(4)所述的层析试纸条是在硬垫板上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维样品垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水垫，再剪成3-4毫米宽的试纸条。
所述悬浮分散的过程中，辅以施加超声震动，振动频率为20KHz。
所述磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器包括氮吹筒、氮气瓶和连接管路，氮吹筒的上端为敞开式，氮吹筒的下端为漏斗状，漏斗状，的下端连通有连接管路，连接管路的另一端与氮气瓶相连；连接管路为弯曲管，弯曲管最高处的高度高于氮吹筒的高度。
所述氮吹筒内设有多层的多孔网，多孔网密布有大量的孔，每层多孔网之间使用支撑架支撑隔离，最上层的支撑架的上端压有重物。
相邻层的多孔网的孔在竖直方向位置不相同。
优点及效果
本发明具有如下优点及有益效果：
本发明中以甲基丙烯酸与苯乙烯共聚合制备羧基化聚苯乙烯纳米微球，由于增加了侧链的空间位阻效应，极性效应及高分子链之间的氢键作用，不但提高了纳米微球的热稳定性和化学稳定性，还增加了Eu(DBM)3phen在聚合物纳米微球中的稳定性，应用过程中不易泄露，提高了纳米微球的荧光强度和荧光探针的灵敏度和稳定性。
附图说明
图1为Eu(DBM)3phen掺杂的聚苯乙烯荧光纳米微球；
图2为磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器示意图。
附图标记说明：1.氮吹筒、2.氮气瓶、3.连接管路、4.多孔网、5.支撑架、6.重物。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细的说明：
一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，步骤如下：
(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒直径为110±5nm；
羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将甲基丙烯酸(95.5％)加入0.5％的过硫酸钾溶液中，500-600转/分钟下搅拌3-5分钟；然后加入苯乙烯(95.5％)，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在惰性气体保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；甲基丙烯酸，过硫酸钾溶液，苯乙烯之间的体积比为1:50:3；
反应结束后在4500-5000rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000-12000rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤大于等于5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用。
(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒：
取步骤(1)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8-4.2℃下磁力搅拌大于等于4小时；聚苯乙烯纳米微球与十二烷基磺酸钠溶液的质量体积比为100-110mg：5mL；十二烷基磺酸钠溶液浓度为0.2-0.25％；聚苯乙烯纳米微球与Eu(DBM)3phen的质量比为10：0.8-1；
用真空旋转蒸发仪去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液浓度为0.05mol/L，pH为6.0；十二烷基磺酸钠溶液与二氯甲烷溶剂的体积比为5：1-1.5；悬浮分散的过程中，辅以施加超声震动，振动频率为20KHz。
(3)利用步骤(2)制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米荧光微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球-氯霉素荧光探针；
纳米微球-氯霉素荧光探针，由包括以下步骤的方法制得：
将步骤2制备的荧光聚苯乙烯纳米微球2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液悬浮液超声分散10-15分钟；
取10-15μL超声分散好的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮液分散于990-1000μL2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，得反应液A；
迅速取10-15μL溶剂为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液，浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化溶液加入反应液A中，混匀，在18～37℃温度下，搅拌条件下活化50-60分钟；
活化结束后，在10000-15000rpm条件下离心分离，固体分散于200-250μL磷酸盐缓冲液中，得反应液B；
取800-900μL氯霉素抗体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到反应液B中，立即涡旋混匀，超声3-5分钟后，18～37℃温度下反应2～4小时，得反应液C；
向反应液C中加入70-80μL 0.2mol/L的甘氨酸，封闭1.5-2.0小时，再加入20-50μL10％牛血清白蛋白溶液，封闭10-12小时；
将反应液C 10000-15000rpm离心20-25分钟，收集沉淀，沉淀悬浮于1-1.5mL含有0.1％Tween-20、1％牛血清白蛋白、0.01％Procline 300的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液中。
(4)利用氯霉素-牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；层析试纸条是在硬垫板上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维样品垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水垫，再剪成3-4毫米宽的试纸条。
(5)将步骤(3)制备的纳米微球-氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；
(6)将待测样品加入到步骤(5)中的酶标板的孔中；
(7)向步骤(6)的酶标板孔中插入步骤(4)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4-5分钟后得到检测结果。
如图2所示，磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器包括氮吹筒1、氮气瓶2和连接管路3，氮吹筒1的上端为敞开式，氮吹筒1的下端为漏斗状，漏斗状，的下端连通有连接管路3，连接管路3的另一端与氮气瓶2相连；连接管路3为弯曲管，弯曲管最高处的高度高于氮吹筒1的高度，以防液体倒灌流入氮气瓶2。氮吹筒1内设有多层的多孔网4，多孔网4密布有大量的孔，每层多孔网4之间使用支撑架5支撑隔离，最上层的支撑架5的上端压有重物6，以防氮吹和磁力搅拌时多孔网4移动。：相邻层的多孔网4的孔在竖直方向位置不相同，有利于增加气泡的移动距离，减少氮吹的时间。
本发明中以甲基丙烯酸与苯乙烯共聚合制备羧基化聚苯乙烯纳米微球，由于增加了侧链的空间位阻效应，极性效应及高分子链之间的氢键作用，不但提高了纳米微球的热稳定性和化学稳定性，还增加了Eu(DBM)3phen在聚合物纳米微球中的稳定性，应用过程中不易泄露，提高了纳米微球的荧光强度和荧光探针的灵敏度和稳定性。
实施例1：
一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其步骤如下：
(1)制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米颗粒：
取2mL 95.5％甲基丙烯酸加入100mL0.5％的过硫酸钾溶液中，强力搅拌5分钟；然后加入6mL苯乙烯(95.5％)，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在氩气保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；
反应结束后在5000rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用；
(2)制备荧光聚苯乙烯纳米颗粒
取100mg步骤(1)制备的聚苯乙烯纳米颗粒分散于5mL浓度为0.25％十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散5分钟后，再将10mg Eu(DBM)3phen稀土配合物的1mL二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散20分钟后，4℃下磁力搅拌4小时；
用真空旋转蒸发仪去除二氯甲烷，离心分离产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于1mL 0.05mol/L，pH为6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中备用；
(3)制备纳米微球-氯霉素荧光探针
首先将步骤2制备的荧光聚苯乙烯纳米微球分2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液悬浮液超声分散10分钟。然后，取10μL超声分散好的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮液分散于990μL2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中，得反应液A；
迅速取10μL活化溶液加入反应液A中，混匀，在18～37℃温度下，搅拌条件下活化60分钟；
活化结束后，在10000rpm条件下离心分离，固体分散于200μL磷酸盐缓冲液中，得反应液B；
取800μL氯霉素抗体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到反应液B中，立即涡旋混匀，超声5分钟后，18～37℃温度下反应2～4小时，得反应液C；
向反应液C中加入70μL 0.2mol/L的甘氨酸，封闭1.5小时，再加入20μL10％牛血清白蛋白溶液，封闭12小时；
将反应液C 10000rpm离心20分钟，收集沉淀，沉淀悬浮于1mL含有0.1％Tween-20、1％牛血清白蛋白、0.01％Pr℃line 300的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液中。
(4)免疫层析试纸条的制备
选取型号为赛多利斯140(CN 140)硝酸纤维素膜为载体，将氯霉素-BSA包被原溶解于含0.05％Tween-20的pH为7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，确定终浓度为1mg/mL，得喷膜液A，用划膜仪(上海金标)将喷涂液A喷涂于硝酸纤维素膜上方10mm处形成T线(检测线)；
将羊抗兔二抗溶解于含0.05％Tween-20的pH为7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，确定终浓度为1mg/mL，得喷膜液B，用划膜仪(上海金标)将喷涂液B喷涂于检测线T线上方5mm处形成C线(质控线)；
将喷涂好的硝酸纤维素膜置于37℃恒温真空干燥箱中烘干，于室温干燥环境中保存备用；
在硬纸板上按顺序拼接、粘贴：玻璃纤维样本垫、划好C、T线的硝酸纤维素膜、吸水纸。组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，即得免疫层析试纸条，密封干燥袋内保存备用(暂时测定保存时间为2个月内，检测结果无影响)
(5)氯霉素的检测
将步骤(3)制备的纳米微球-氯霉素荧光探针取6微升，加入到100微升待测样品中，于37℃烘箱内孵育20min后，取出，即得A液；
用移液枪取出A液，将其逐滴滴加在免疫层析试纸条的样本端，待液体开始向硝酸纤维素膜层析时开始计时，15min后置于365nm紫外分析仪下观察，通过T线颜色变化进行定量判断；
(6)准确性测定
准确配制氯霉素标品，稀释液为不含氯霉素的去离子水，使其浓度分别为0、50、100、200、400ng/mL，进行步骤(5)的步骤进行测定；
重复实验10次，结果表明该氯霉素免疫层析试纸条检出限为100ng/mL，在365nm紫外灯照射下，随着浓度梯度增大，T线颜色逐渐变浅至消失，T线颜色梯度变化较为一致，线性范围较为良好，满足定量检测的需要，较胶体金免疫层析试纸条相比，灵敏度有所提高。
如图1所示，为Eu(DBM)3phen掺杂的聚苯乙烯荧光纳米微球，微球直径110±5nm，分散性好。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (4)
1.一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制备羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球；所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球直径为110±5 nm；
（2）制备羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球：
取步骤（1）制备的羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球分散于十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于4.5分钟，再将Eu(DBM)3phen稀土配合物的二氯甲烷溶液加入到十二烷基磺酸钠水溶液中，超声分散大于等于20分钟，3.8-4.2 ℃下磁力搅拌大于等于4小时；
去除二氯甲烷，分离得到产物，然后用去离子水和乙醇洗涤产物，获得的羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球悬浮分散于2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液中备用；
（3）利用步骤（2）制备的羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球和氯霉素单克隆抗体，制备纳米微球-氯霉素荧光探针；
（4）利用氯霉素-牛血清白蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂，装获得层析试纸条；
（5）将步骤（3）制备的纳米微球-氯霉素荧光探针加入到酶标板孔中；
（6）将待测样品加入到步骤（5）中的酶标板的孔中；
（7）向步骤（6）的酶标板孔中插入步骤（4）制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到酶标板孔中的液体中，4-5分钟后得到检测结果；
所述步骤（1）所述羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将甲基丙烯酸加入0.5%的过硫酸钾溶液中，500-600转/分钟下搅拌3-5分钟；然后加入苯乙烯，磁力搅拌条件下氮吹10分钟除去溶液中的氧气；在惰性气体保护下，300r/min转速下，70℃反应10小时；甲基丙烯酸，过硫酸钾溶液，苯乙烯之间的体积比为1:50:3；
反应结束后在4500-5000 rpm转速下离心，去除沉淀，悬浮液再次在10000 -12000 rpm转速下离心分离，去除液体，获得产物，产物用去离子水洗涤大于等于5次去除未反应的原料，产物在低温干燥后备用；
步骤（2）中羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球与十二烷基磺酸钠溶液的质量体积比为100-110mg：5mL；步骤（2）中的十二烷基磺酸钠溶液浓度为0.2-0.25%；步骤（2）中的2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液浓度为0.05 mol/L，pH为6.0；
步骤（2）中羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球与Eu(DBM)3phen的质量比为10：0.8-1；步骤（2）中的十二烷基磺酸钠溶液与二氯甲烷溶剂的体积比为5：1-1.5；
步骤（3）所述纳米微球-氯霉素荧光探针，由包括以下步骤的方法制得：
将步骤（2）制备的羧基修饰的荧光聚苯乙烯纳米微球加入2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液，超声分散10-15分钟得到悬浮液；
取10-15 μL超声分散好的悬浮液分散于990-1000 μL的 2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液中，得反应液A；
迅速取10-15 μL溶剂为2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲溶液，浓度为10mg/mL的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化溶液加入反应液A中，混匀，在18~37 ℃温度下，搅拌条件下活化 50-60 分钟；
活化结束后，在10000-15000 rpm条件下离心分离，固体分散于200-250 μL 磷酸盐缓冲液中，得反应液B；
取800-900 μL氯霉素抗体溶解于磷酸盐缓冲溶液中，然后加入到反应液B中，立即涡旋混匀，超声3-5分钟后，18~37 ℃温度下反应2~4小时，得反应液C；
向反应液C中加入70-80 μL 0.2 mol/L的甘氨酸，封闭1.5-2.0小时，再加入20-50 μL10%牛血清白蛋白溶液，封闭10-12小时；
将反应液C 10000-15000 rpm离心20-25分钟，收集沉淀，沉淀悬浮于1-1.5mL含有0.1%Tween-20、1%牛血清白蛋白、0.01% Procline 300的20mmol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液中；
步骤（4）所述的层析试纸条是在硬垫板上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维样品垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水垫，再剪成3-4毫米宽的试纸条；
所述悬浮分散的过程中，辅以施加超声震动，振动频率为20KHz。
2.根据权利要求1所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：所述磁力搅拌条件下氮吹所用的仪器包括氮吹筒、氮气瓶和连接管路，氮吹筒的上端为敞开式，氮吹筒的下端为漏斗状，漏斗状，的下端连通有连接管路，连接管路的另一端与氮气瓶相连；连接管路为弯曲管，弯曲管最高处的高度高于氮吹筒的高度。
3.根据权利要求2所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：所述氮吹筒内设有多层的多孔网，多孔网密布有大量的孔，每层多孔网之间使用支撑架支撑隔离，最上层的支撑架的上端压有重物。
4.根据权利要求3所述的基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法，其特征在于：相邻层的多孔网的孔在竖直方向位置不相同。
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