CN109771316A

CN109771316A - 一种提高n-乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法及其应用

Info

Publication number: CN109771316A
Application number: CN201811636783.7A
Authority: CN
Inventors: 朱薇薇; 陈祥松; 袁丽霞; 吴金勇; 孙立洁; 李翔宇; 王纪; 王煜; 王刚; 姚建铭
Original assignee: Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd; Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Wuhan Zhongke Optics Valley Green Biotechnology Co ltd; Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109771316B

Abstract

本发明提供了一种提高N‑乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法及其应用。该方法包括如下步骤：将含有N‑乙酰神经氨酸的水溶液的pH调至5～9；所述N‑乙酰神经氨酸由发酵制得。本发明采用调节由发酵制得的N‑乙酰神经氨酸的水溶液pH值的方法以增强N‑乙酰神经氨酸水溶液的稳定性。实验证明此方法可有效提高N‑乙酰神经氨酸水溶液稳定性，且操作简单。

Description

一种提高N-乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及工业化生产领域，更具体地，涉及一种提高N-乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法及其应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，具有调节Ig G抗炎活性，增强和促进婴儿免疫力和大脑发育，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性的作用，参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程，可被应用于食品、化妆品、药品领域。

在工业上，N-乙酰神经氨酸通常是通过发酵法制得，发酵后对发酵液进行一系列的后处理得到N-乙酰神经氨酸，专利一种从微生物发酵液中分离提纯和喷雾干燥制备N-乙酰神经氨酸干粉的方法，解决了N-乙酰神经氨酸因成本较高而无法在化妆品中普遍应用的问题，提供一种从微生物发酵液中分离提纯和喷雾干燥制备N-乙酰神经氨酸干粉的方法，降低了N-乙酰神经氨酸的生产成本，并获得质量稳定的N-乙酰神经氨酸，满足了化妆品领域的应用需求。但是该方法得到的N-乙酰神经氨酸含有一定量的杂质，得到的N-乙酰神经氨酸的水溶液的稳定性较差，当将该N-乙酰神经氨酸溶于水后再进行高温杀菌处理时会有大量的N-乙酰神经氨酸损失，或当该N-乙酰神经氨酸溶于水后常温下用0.22um膜进行除菌处理，再进行室温(25℃)长期放置在放置时也会出现明显的N-乙酰神经氨酸损失。在现有技术中，缺乏一种简单且有效地手段来提高该类N-乙酰神经氨酸的稳定性。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一目的在于提供一种N-乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法，该方法包括如下步骤：

将含有N-乙酰神经氨酸的水溶液的pH调至5～9；

所述N-乙酰神经氨酸由发酵制得。

本发明采用调节由发酵制得的N-乙酰神经氨酸的水溶液pH值的方法以增强N-乙酰神经氨酸水溶液的稳定性。实验证明此方法可有效提高N-乙酰神经氨酸水溶液稳定性，且操作简单。

在本发明一个优选实施方式中，所述pH为5～7，优选为7。

在本发明一个优选实施方式中，所述含有N-乙酰神经氨酸的水溶液中N-乙酰神经氨酸的浓度为5g/L～100g/L，优选为5g/L～50g/L。

在本发明一个优选实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸为由发酵制得的干粉，在所述干粉中，纯N-乙酰神经氨酸的含量在90％以上。在工业上，由发酵制得的N-乙酰神经氨酸干粉中纯的N-乙酰神经氨酸的含量均达不到100％。本发明的方法尤其适用于发酵制得的N-乙酰神经氨酸干粉，其中，纯N-乙酰神经氨酸的含量在90％到100％之间。

在本发明一个优选实施方式中，所述发酵具体为大肠杆菌工程菌通过微生物发酵法得到的发酵液，除去菌体、杂蛋白，进行脱色和除盐，浓缩后喷雾干燥。

其中，所述大肠杆菌工程菌为将6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌。更优选地是，大肠杆菌工程菌为CN201310600843.0中所公开的大肠杆菌工程菌，优选为CN201310600843.0中实施例1中所公开的大肠杆菌工程菌。

其中，“除去菌体、杂蛋白，进行脱色和除盐，浓缩后喷雾干燥”优选使用CN201610003300.4中所公开的分离提纯和喷雾干燥的方法，优选使用CN201610003300.4的实施例1中所公开的分离提纯和喷雾干燥的方法去发酵液进行除去菌体、杂蛋白，进行脱色和除盐，浓缩后喷雾干燥。

由上述方法得到的N-乙酰神经氨酸干粉中纯N-乙酰神经氨酸含量在90％以上。

在本发明一个优选实施方式中，使用强碱和/或盐酸将含有N-乙酰神经氨酸的水溶液的pH调至5～9。

使用本发明的方法得到的N-乙酰神经氨酸水溶液进行高温(110～130℃)灭菌后，N-乙酰神经氨酸的含量的下降幅度得到大大的减缓。

使用本发明的方法得到的N-乙酰神经氨酸水溶液进行0.22um膜过滤除菌后，长期放置(24个月)于室温(25℃)N-乙酰神经氨酸的含量的下降幅度得到大大的减缓。

本发明的再一目的在于提供一种N-乙酰神经氨酸水溶液，将发酵得到的N-乙酰神经氨酸溶于水，得到含有N-乙酰神经氨酸的水溶液，将其pH调至5～9，即得。

其中，pH优选为7。所述含有N-乙酰神经氨酸的水溶液中N-乙酰神经氨酸的浓度优选为5g/L～50g/L。

本发明的再一目的在于提供上述方法或上述N-乙酰神经氨酸水溶液在化妆品领域中的应用。

其中，还包括将pH调至5～9的含有N-乙酰神经氨酸的水溶液进行高菌杀菌处理；所述高温为110～130℃。

其中，还包括将pH调至5～9的含有N-乙酰神经氨酸的水溶液进行0.22um膜过滤除菌处理，长期放置于室温(25℃)。

本发明通过调节N-乙酰神经氨酸水溶液pH值的方法显著增强了由发酵制得的N-乙酰神经氨酸的水溶液的稳定性，操作简单，易于在工业化中应用。本发明通过向N-乙酰神经氨酸水溶液中添加强碱和盐酸调节pH，保证N-乙酰神经氨酸水溶液在高温处理后含量的稳定性以及在室温(25℃)条件放置的长期稳定性

附图说明

图1为实验例1中不同浓度的N-乙酰神经氨酸水溶液在经过高温处理后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图2为实验例1中实施例1～3以及对比例1～2的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图3为实验例1中实施例4～6以及对比例3～4的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图4为实验例1中实施例7～9以及对比例5～6的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图5为实验例1中实施例10～12以及对比例7～8的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图6为实验例2中实施例1～3得到的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后放置不同时间后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图7为实验例2中实施例7～9得到的N-乙酰神经氨酸水溶液在高温灭菌后放置不同时间后N-乙酰神经氨酸的含量值；

图8为实验例3中实施例2、8、11得到的N-乙酰神经氨酸水溶液在经过0.22um膜过滤除菌后，室温(25℃)放置不同时间的N-乙酰神经氨酸的含量；

图9为实验例3中实施例1～3以及对比例1～2的N-乙酰神经氨酸水溶液在经过0.22um膜过滤除菌后，室温(25℃)放置不同时间的N-乙酰神经氨酸的含量；

图10为实验例3中实施例7～9以及对比例5～6的N-乙酰神经氨酸水溶液在经过0.22um膜过滤除菌后，室温(25℃)放置不同时间的N-乙酰神经氨酸的含量。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例，用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。

本发明中使用的原料组分均可市购获得，本发明实施例所用试剂均为化学纯。

实施例1

本实施例提供了一种N-乙酰神经氨酸水溶液，制备方法如下：

N-乙酰神经氨酸的制备方法：使用CN201310600843.0中实施例1中所公开的大肠杆菌工程菌进行发酵得到发酵液，再使用CN201610003300.4的实施例1中所公开的分离提纯和喷雾干燥的方法去发酵液进行除去菌体、杂蛋白，进行脱色和除盐，浓缩后喷雾干燥得到N-乙酰神经氨酸粉体。

将得到的N-乙酰神经氨酸粉体溶于水，制备得到5g/L的N-乙酰神经氨酸水溶液，使用氢氧化钠和盐酸将该N-乙酰神经氨酸水溶液的pH调至5。

实施例2～3

实施例2～3与实施例1的方法和步骤相同，不同在于pH值分别为7、9。

实施例4～6

实施例4～6与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为10g/L，pH值分别为5、7、9。

实施例7～9

实施例7～9与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为30g/L，pH值分别为5、7、9。

实施例10～12

实施例10～12与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为50g/L，pH值分别为5、7、9。

对比例1～2

对比例1～2与实施例1的方法和步骤相同，不同在于pH值分别为3、11。

对比例3～4

对比例3～4与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为10g/L，pH值分别为3、11。

对比例5～6

对比例5～6与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为30g/L，pH值分别为3、11。

对比例7～8

对比例7～8与实施例1的方法和步骤相同，不同在于N-乙酰神经氨酸的浓度均为50g/L，pH值分别为3、11。

实验例1

N-乙酰神经氨酸水溶液中N-乙酰神经氨酸的含量测定方法

高效液相色谱(HPLC)检测法：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87HOrganic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相是6mmol硫酸，流速是0.6ml/min；检测波长210nm。

对照组：

将实施例1中使用的N-乙酰神经氨酸，溶于水配制成一系列含量梯度的水溶液，121℃高压灭菌20min,测定灭菌前后的含量。检测结果见图1，初始含量分别为1g/L,5g/L,10g/L,30g/L,50g/L高温处理后含量均有所下降，且初始含量越高，高温灭菌后含量下降幅度越大。1g/L,5g/L,10g/L,30g/L,50g/L高温处理后含量下降百分比分别为：18％、22％、26％、48％、57％。(所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值)。

实验组：

将实施例1～12以及对比例1～8中得到的N-乙酰神经氨酸水溶液在121℃高压灭菌20min,测定灭菌前后的含量(所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值)。结果如图2、3、4、5所示，当N-乙酰神经氨酸水溶液的浓度分别3g/L、5g/L、10g/L、30g/L、50g/L时，在pH5-9范围内，高温处理后含量未发生明显变化，其中pH为7时，含量基本没有变化，变化幅度最小。pH为3时含量下降幅度最大。5g/L、10g/L、30g/L、50g/L pH为7时N-乙酰神经氨酸水溶液含量下降分别为0％、0％、0.3％、1％，当pH为9时N-乙酰神经氨酸水溶液含量下降分别为0％、1％、1.3％、2％，当pH为5时N-乙酰神经氨酸水溶液含量下降分别为2％、2％、2.1％、2.6％，当pH为3时N-乙酰神经氨酸水溶液含量下降分别为16％、21％、45％、52％，当pH为11时N-乙酰神经氨酸水溶液含量下降分别为4％、5％、5.7％、6％，当pH值为5～9时，灭菌后N-乙酰神经氨酸仅下降2％以下，远远小于pH为3和11时。随着浓度提高，同样处理的下降含量略有提高，但是下降幅度不大。

实验例2

将高温处理后的水溶液放置于25℃条件下考察其在灭菌后的长期稳定性。取实施例1～3中5g/L N-乙酰神经氨酸水溶液，121℃高压灭菌20min,再放置于25℃条件下12个月时间，分别在3、6、9、12个月取样检测含量，检测结果见图6，在放置过程中pH5、9含量呈缓慢下降趋势，pH7含量变化很小。pH5、pH 9含量分别下降8.2％、6％、pH7含量下降1％。(所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值)

取实施例7～9中30g/L N-乙酰神经氨酸水溶液，121℃高压灭菌20min,再放置于25℃条件下12个月时间，分别在3、6、9、12个月取样检测含量，检测结果见图7，在放置过程中pH5、9含量呈缓慢下降趋势，pH7含量变化很小。pH5、pH 9含量分别下降12.2％、11.1％，pH7含量下降1.3％。(所有实验均重复3次，实验结果为3次平均值)

实验例3

将实施例1～12以及对比例1～8中得到的N-乙酰神经氨酸水溶液经过0.22um膜过滤除菌。结果如图8～10。

图8为不同浓度的N-乙酰神经氨酸水溶液在经过0.22um膜过滤除菌后，室温(25℃)放置不同时间的N-乙酰神经氨酸的含量，放置24个月后5g/L，20g/L，30g/L分别下降41％，44.6％，55.8％。

如图9所示，5g/L的N-乙酰神经氨酸水溶液，室温(25℃)放置24个月后，pH5、pH7、pH9、含量分别下降14％、2％、8％。pH3、pH11含量分别下降41％、28％。pH5、pH7、pH9的下降百分含量远低于pH3、pH11的下降百分含量。

如图10所示，30g/L的N-乙酰神经氨酸水溶液，室温(25℃)放置24个月后，pH5、pH7、pH9、含量分别下降15％、2％、9％。pH3、pH11含量分别下降56％、45％。pH5、pH7、pH9的下降百分含量远低于pH3、pH11的下降百分含量。

图9和图10表明含量越高pH对含量损失的影响越明显，高含量时pH3、pH11的下降速率较低含量时要快。调节pH对抑制含量损失的效果越明显。因此，在高温灭菌条件下调节pH5-7，最优选pH7,会明显保持N-乙酰神经氨酸水溶液的稳定性，且高温灭菌后的长期常温(25℃)的放置稳定性也可以保证。另一种除菌方式即0.22um膜过滤除菌也可通过调节pH5-7，最优选pH7,保证N-乙酰神经氨酸水溶液的长期常温(25℃)的放置稳定性。浓度越高对含量损失的抑制效果越明显。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高N-乙酰神经氨酸水溶液稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将含有N-乙酰神经氨酸的水溶液的pH调至5～9；

所述N-乙酰神经氨酸由发酵制得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pH为7。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有N-乙酰神经氨酸的水溶液中N-乙酰神经氨酸的浓度为5g/L～100g/L，优选为5g/L～50g/L。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸为由发酵制得的干粉，在所述干粉中，纯N-乙酰神经氨酸的含量在90％以上。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵具体为大肠杆菌工程菌通过微生物发酵法得到的发酵液，除去菌体、杂蛋白，进行脱色和除盐，浓缩后喷雾干燥。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌为将6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，使用强碱和/或盐酸将含有N-乙酰神经氨酸的水溶液的pH调至5～9。

8.一种N-乙酰神经氨酸水溶液，其特征在于，包括将发酵得到的N-乙酰神经氨酸溶于水，得到含有N-乙酰神经氨酸的水溶液，将其pH调至5～9，即得。

9.权利要求1至7中任一项所述的方法或权利要求8所述的N-乙酰神经氨酸水溶液在化妆品领域中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，还包括将pH调至5～9的含有N-乙酰神经氨酸的水溶液进行高温杀菌处理；所述高温为110～130℃；

和/或，还包括将pH调至5～9的含有N-乙酰神经氨酸的水溶液进行0.22um膜过滤除菌。