CN109750019B

CN109750019B - 一种改善单子叶作物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及应用

Info

Publication number: CN109750019B
Application number: CN201711089560.9A
Authority: CN
Inventors: 李召虎; 张娟; 张钰石; 张明才; 邢嘉鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN109750019A

Abstract

本发明公开了一种改善单子叶作物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及应用。本发明提供了蛋白质，为将蛋白ZmCPS1氨基酸序列第409位的赖氨酸突变为酪氨酸，得到的蛋白突变体。本发明的实验证明了，对ZmCPS1的409位的赖氨酸(K)进行编辑为酪氨酸(Y)得到K409YZmCPS1突变体，将其转入玉米中，可以改变玉米对缩节安的敏感性，使经济安全的赤霉素合成抑制剂缩节安应用到玉米栽培中，实现对玉米理想株型的有效塑造，最终达到使玉米增产抗逆的效果。

Description

一种改善单子叶作物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种改善单子叶作物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是世界上非常重要的粮食作物、饲料作物、工业原料以及能源作物，在国民经济发展中起到无法取代的作用，世界上玉米产量最大的两个国家分别是美国和中国(Ci等,2012)。但是目前由于气候条件的变化及灌溉不合理等因素，玉米倒伏的现象越来越严重，造成玉米收获困难，严重影响其产量，因此可以通过对玉米株型的塑造来解决倒伏的问题，无疑是首要选择。为了提高玉米的产量，可以通过对玉米株型的塑造抑制植株生长和节间缩短，抑制营养生长而促进生殖生长，提高玉米产量和质量。

缩节安(N,N-dimethylpiperidinium chloride,DPC)，其化学名称为1,1-二甲基哌啶鎓氯化物,是一种无害安全又经济的植物生长调节抑制剂，广泛应用于棉花生产上。棉花应用缩节安后，可以按照人们的意愿对棉花植株进行株型塑造，抑制棉株主茎的生长,使棉株节间缩短；减弱植株的顶芽长势，促进侧枝的生长，紧凑株型；从而防止棉花植株旺长，促进营养生长，增加棉絮的产量和质量(田晓莉等，2004；田晓莉等，2006；Ren等，2013)。但缩节安对玉米调控效应不显著，应用1000mg/L DPC处理玉米郑单958，株高和茎粗与对照都没有显著的差异(陈吟，2012)。因此改善玉米对缩节安的敏感性是迫切的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白(K409YZmCPS1)，为将蛋白ZmCPS1氨基酸序列第409位的赖氨酸突变为酪氨酸，得到的蛋白突变体。

所述蛋白质中，所述蛋白ZmCPS1来源于单子叶植物或双子叶植物；或，所述蛋白ZmCPS1来源于具体为玉米；

或所述蛋白质为如下1)-5)中任一种：

1)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

3)将1)或2)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

4)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

5)1)-4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列1；

2)其编码序列为序列表中序列1；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

下述1)-4)中的任一种生物材料也是本发明保护的范围：

1)含有上述核酸分子的表达盒；

2)含有上述核酸分子的重组载体；

3)含有上述核酸分子的重组菌；

4)含有上述核酸分子的转基因细胞系。

上述蛋白质或上述核酸分子或上述的生物材料在提高植物对赤霉素抑制剂敏感性中的应用也是本发明保护的范围。

所述提高植物对赤霉素抑制剂敏感性为降低植物在赤霉素抑制剂诱导下的株高。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的表达或含量，得到转基因植物；

所述转基因植物对赤霉素抑制剂敏感性大于所述目的植物对赤霉素抑制剂敏感性。

所述转基因植物对赤霉素抑制剂敏感性大于所述目的植物对赤霉素抑制剂敏感性体现在所述转基因植物在赤霉素抑制剂诱导下的株高低于所述目的植物在赤霉素抑制剂诱导下的株高；

上述方法中，所述提高目的植物中蛋白的表达或活性的方法为，将蛋白编码基因导入目的植物中。

上述中，所述赤霉素抑制剂为缩节安；

或，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

或，所述单子叶植物为玉米；

或，所述目的植物为AtCPS的完全突变体。

本发明另一个目的是提供一种提高ZmCPS1对赤霉素抑制剂敏感性的方法。

本发明提供的方法，为将ZmCPS1蛋白氨基酸序列第409位赖氨酸突变为酪氨酸，实现提高ZmCPS1对赤霉素抑制剂敏感性。

提高ZmCPS1对赤霉素抑制剂敏感性体现在ZmCPS1未使ent-CPP含量随着DPC浓度增加没有减少的趋势，K409YZmCPS1使ent-CPP产量随着DPC浓度增加而逐渐降低。

本发明的实验证明了，对ZmCPS1的409位的赖氨酸(K)进行编辑为酪氨酸(Y)得到K409YZmCPS1突变体，将其转入玉米中，可以改变玉米对缩节安的敏感性，使经济安全的赤霉素合成抑制剂缩节安应用到玉米栽培中，实现对玉米理想株型的有效塑造，最终达到使玉米抗逆增产的效果。

附图说明

图1为ga1-1:ZmCPS1与ga1-1:K409Y ZmCPS1互补株系对不同浓度DPC敏感性的表型。

图2为体外分析ZmCPS1与K409Y ZmCPS1在不同浓度DPC下的产物量。

图3为ZmCPS1和K409Y ZmCPS1的kinetics分析。

图4为ZmCPS1和K409Y ZmCPS1分别与DPC互作的IC50。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的载体pSuper1300为文献(Lipid transfer protein 3 as atarget of MYB96 mediates freezing and drought stress in Arabidopsis，Journalof Experimental Botany,Guo et al.,Vol.64,No.6,pp.1755–1767,2013)中的pSuper1300::GFP，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌GV3101为文献(APlasma Membrane ReceptorKinase,GHR1,Mediates Abscisic Acid-and Hydrogen Peroxide-Regulated StomatalMovement in Arabidopsis,Hua et al.,The Plant Cell,Vol.24:2546–2561,June 2012)中的Agrobacterium strain GV3101，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的拟南芥突变体ga1-1为俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心产品，是AtCPS的完全突变体，为了检测ZmCPS1以及K409Y ZmCPS1对DPC的反应并不受AtCPS的干扰所以选择ga1-1。

下述实施例中的0mg/L的缩节安DPC水溶液为超纯水，下述实施例中的30mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入30mg DPC得到的溶液，下述实施例中的50mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入50mg DPC得到的溶液,下述实施例中的100mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入100mg DPC得到的溶液,下述实施例中的500mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入500mg DPC得到的溶液,下述实施例中的1000mg/L的DPC水溶液为向1L超纯水中加入1000mg DPC得到的溶液。

下述实施例中拟南芥的生长条件均为：光周期为16h光/8h暗，光强为60μmol/m²/s，湿度60％-70％，温度为22℃的培养室中培养。

下述实施例中的缩节安为江苏润泽农化有限公司公司产品，货号为:HG/T2856-1997，缩节安为赤霉素生物合成抑制剂。

下述实施例中的ZmCPS1源于玉米(B73)。

实施例1、K409Y ZmCPS1的获得

K409Y ZmCPS1蛋白为将ZmCPS1蛋白氨基酸序列(序列2)第409位的赖氨酸突变为酪氨酸，得到的蛋白突变体。

K409Y ZmCPS1基因为将ZmCPS1基因核苷酸序列(序列1)第1225－1227位的AAG碱基突变为TAT，得到的核酸突变体。

实施例2、K409Y ZmCPS1在改善玉米对赤霉素抑制剂敏感性中的应用

一、重组载体的获得

重组载体pSuper1300-ZmCPS1为将pSuper1300载体的Spe I和Kpn I间的DNA片段替换为ZmCPS1基因，得到的载体，ZmCPS1蛋白与载体上的GFP形成的融合蛋白表达；

重组载体pSuper1300-K409Y ZmCPS1为将pSuper1300载体的Spe I和Kpn I间的DNA片段替换为K409Y ZmCPS1基因，得到的载体，K409Y ZmCPS1蛋白与载体上的GFP形成的融合蛋白表达。

二、重组菌的获得

分别将重组载体pSuper1300-ZmCPS1和pSuper1300-K409Y ZmCPS1导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将该重组菌命名为GV3101-pSuper1300-ZmCPS1和GV3101-pSuper1300-K409Y ZmCPS1；

将对照载体pSuper1300导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将该重组菌命名为GV3101-pSuper1300。

三、转基因拟南芥的获得

用上述二的重组菌GV3101-pSuper1300-K409Y ZmCPS1转化拟南芥突变体ga1-1，得到转K409Y ZmCPS1拟南芥ga1-1(K409Y ZmCPS1::ga1-1)T₁代种子，具体方法如下：

1)拟南芥的培养:将突变体ga1-1种子在4℃条件下春化72h，于赤霉素培养基(赤霉素培养基为向MS培养基中加入赤霉素(GA₃)得到的GA₃浓度为10^-4M的固体培养基)中于22℃、16h光/8h暗、光强为60μmol/m²/s、湿度60％-70％的培养室中培养，生长到4片真叶时移栽到营养土与蛭石等比例混合的种植钵中，其中突变体要两天喷一次10^-4M GA₃；

2)农杆菌菌液的制备:取GV3101-pSuper1300-K409Y ZmCPS1农杆菌接种于5mlYEP液体培养基(含抗生素)中，28℃、220rpm下培养30h，按体积比为1:100将得到的菌液转接到50ml YEP(含抗生素)中，28℃，220rpm培养过夜，至OD₆₀₀为0.6-0.8；4℃于6000g离心15min，所收集的菌体重悬于1/2MS+5％蔗糖溶液，转化前加入0.02％-0.05％Silwet L-77(一种表面活性剂，为美国AMRESCO公司产品)。

3)转化:待拟南芥突变体ga1-1植株开花后，剪去主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的6天内，将上述2)准备好的农杆菌蘸湿拟南芥未露白的花序上。将转化后的拟南芥用充满气的黑色塑料袋包住，暗培养24h后去掉黑色塑料袋。恢复光照按正常方法培养植株至结实，收获成熟的转K409Y ZmCPS1基因ga1-1(K409Y ZmCPS1::ga1-1)T₁代种子。

4)K409Y ZmCPS1::ga1-1的纯系植株获得

①将T₁代K409Y ZmCPS1::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，将真叶健康呈深绿色、根伸长至培养基中的抗潮霉素的阳性植株移入土壤中，收获T₂代K409Y ZmCPS1::ga1-1种子；②将T₂代K409Y ZmCPS1::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS固体培养基上得到T₂代K409Y ZmCPS1::ga1-1植株，利用潮霉素进行筛选，选择抗潮霉素：不抗潮霉素＝3:1的T₂代K409Y ZmCPS1::ga1-1植株并将其中的抗潮霉素植株移入土壤中，收获T₃代K409Y ZmCPS1::ga1-1种子(抗潮霉素植株表现为：真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中；不抗潮霉素植株表现为：真叶发黄，根不伸长)；③将T₃代K409Y ZmCPS1::ga1-1种子播种在含有潮霉素的MS培养基上，得到T₃代K409Y ZmCPS1::ga1-1植株，利用潮霉素进行筛选，选择全部为抗潮霉素的T₃代K409Y ZmCPS1::ga1-1植株并将其移栽到土壤中，得到K409Y ZmCPS1::ga1-1的纯系植株。

按照上述方法，将GV3101-pSuper1300-K409Y ZmCPS1分别替换为GV3101-pSuper1300-ZmCPS1和GV3101-pSuper1300，其他步骤均不变，分别得到名称为ZmCPS1::ga1-1的转ZmCPS1基因ga1-1及其纯系植株和名称为pSuper1300::ga1-1的转空载体ga1-1及其纯系植株。

四、转基因植株的鉴定

1、转K409Y ZmCPS1纯系拟南芥中K409Y ZmCPS1基因表达量的检测

利用Real-Time PCR鉴定K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株K409YZmCPS1基因的表达水平及ZmCPS1::ga1-1的纯系植株中ZmCPS1基因的表达水平，所用的引物为5’-TGCAGCCACTTATCGACCAG-3’和5’-AGGCGAGGGTGTTGATCATG-3’。

内参为AtUbi基因，内参的引物为5’-ATTACCCGATGGGCAAGTCA-3’和5’-CACAAACGAGGGCTGGAACA-3’。

分别提取K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株和ZmCPS1::ga1-1的纯系植株的DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增。

结果显示，K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株和ZmCPS1::ga1-1的纯系植株中均能分别表达K409YZmCPS1和ZmCPS1基因。

2、转K409YZmCPS1基因的纯系拟南芥中K409YZmCPS1蛋白表达量的检测

利用Westernblot鉴定K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株中的K409YZmCPS1蛋白以及ZmCPS1::ga1-1的纯系植株中的ZmCPS1蛋白，一抗为Anti-GFP Tag Rabbit(Roche产品，货号为14717400)。

结果显示，K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株有K409YZmCPS1蛋白表达，ZmCPS1::ga1-1的纯系植株中均有ZmCPS1蛋白表达。

五、DPC降低转基因拟南芥株高体现K409YZmCPS1改善植物对DPC的敏感性

DPC对转基因拟南芥株高的影响，实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：

选取上述获得的K409YZmCPS1::ga1-1的纯系植株、ZmCPS1::ga1-1纯系植株、pSuper1300::ga1-1的纯系植株和ga1-1植株；每个株系70株。

将上述各个株系分为如下几组处理，每组10株，在这几组植株自播种(播种当天记为播种第1天)的第33天时分别进行以下处理：

一组喷施水(即0mg/L的DPC水溶液)后，培养12天，得到未处理的K409YZmCPS1::ga1-1、未处理的ZmCPS1::ga1-1、未处理的pSuper1300::ga1-1和未处理的ga1-1植株；

一组喷施30mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到30mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、30mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1、30mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和30mg/L DPC处理的ga1-1植株；

一组喷施50mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到50mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、50mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1、50mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和50mg/L DPC处理的ga1-1植株；

一组喷施100mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到100mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、100mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1、100mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和100mg/L DPC处理的ga1-1植株；

一组喷施300mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到300mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、300mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1、300mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和300mg/L DPC处理的ga1-1植株；

一组喷施500mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到500mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、500mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1、500mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和500mg/L DPC处理的ga1-1植株；

一组喷施1000mg/L的DPC水溶液后，培养12天，得到1000mg/L DPC处理的K409YZmCPS1::ga1-1、1000mg/L DPC处理的ZmCPS1::ga1-1和1000mg/L DPC处理的pSuper1300::ga1-1和1000mg/L DPC处理的ga1-1植株。

分别测量上述不同处理拟南芥的株高。

结果如图1所示，为不同浓度DPC处理不同株系12天后表型；A：不同浓度DPC处理ZmCPS121::ga1-1株系(ZmCPS1::ga1-1一个株系)12天后的表型；B：不同浓度DPC处理ZmCPS149::ga1-1株系(ZmCPS1::ga1-1一个株系)12天后的表型；C：不同浓度DPC处理K409YZmCPS121::ga1-1株系(K409YZmCPS1::ga1-1一个株系)12天后的表型；D：不同浓度DPC处理K409YZmCPS134::ga1-1株系1(K409YZmCPS1::ga1-1一个株系)2天后的表型；可以看出，K409YZmCPS1::ga1-1株系高受DPC浓度而影响，转K409YZmCPS1基因拟南芥的株高随DPC浓度的增加而降低，彻底改善了转ZmCPS1基因拟南芥植株对DPC不敏感。

统计各个株系的平均株高见表1。

表1、不同浓度DPC处理的不同转基因株系拟南芥的株高(cm)

六、DPC降低ZmCPS1产物ent-CPP含量体现K409YZmCPS1改善植物对DPC的敏感性

1、DPC降低ZmCPS1产物ent-CPP含量

1)构建重组载体

K409YZmCPS1-pENTR/SD/D-TOPO为将K409Y ZmCPS1基因连接到pENTR/SD/D-TOPO载体(invitrogen，Catalog no K2420-20，是Gateway反应的入门载体)得到。

ZmCPS1-pENTR/SD/D-TOPO为将ZmCPS1基因连接到pENTR/SD/D-TOPO载体得到。

将载体K409YZmCPS1-pENTR/SD/D-TOPO和ZmCPS1-pENTR/SD/D-TOPO分别与pDEST-17(美国爱荷华州立大学Peters lab)进行LR反应，得到重组载体pDEST-17-K409YZmCPS1和pDEST-17-ZmCPS1。

pDEST-17-K409YZmCPS1为将K409Y ZmCPS1基因通过LR反应连插入pDEST-17载体attL1和attL2位点间得到的载体。

pDEST-17-ZmCPS1为将ZmCPS1基因通过LR反应连插入pDEST-17载体attL1和attL2位点间得到的载体。

2)将pDEST-17-K409YZmCPS1载体和pDEST-17-ZmCPS1载体分别与pGG(美国爱荷华州立大学Peters lab)、pIRS(美国爱荷华州立大学Peters lab)共同转化到C41大肠杆菌细胞(美国爱荷华州立大学Peters lab)中，进行诱导3天(摇菌到OD0.6-0.8后加入终浓度为1mM IPTG)。

将各个诱导后菌株用有机溶剂hexanes提取ent-CPP产物,上样到GC-MS，仪器参数为：VARIAN 3900GC-Saturn 2100T MS；所用的柱子为Agilent HP-5MS(Agilent,19091S-433)；采用8400自动进样器，进样体积1uL，不分流模式，进样口温度设为250℃；载气：高纯氦气，恒流模式，流速：1.2mL/min。柱温：50℃(3min)，15℃/min到300℃，保持3min；MS收集范围为90－650；收集时间为：进样13min到终止。

统计各个相应的峰值，计算ent-CPP产物的平均值。

含有pDEST-17-K409YZmCPS1载体诱导后菌株的ent-CPP产物出峰时间为16.770min；

含有pDEST-17-ZmCPS1载体诱导后菌株的ent-CPP产物出峰时间为16.770min；

ent-CPP标准品的出峰时间为16.770min；证明均得到目的产物ent-CPP。

计算含量如图2所示，为不同浓度DPC处理ZmCPS1和K409YZmCPS1后产物ent-CPP的含量；A为不同浓度DPC处理ZmCPS1后产物ent-CPP的含量；B：不同浓度DPC处理K409YZmCPS1后产物ent-CPP的含量；可以看出，ZmCPS1产物ent-CPP含量随着DPC浓度增加没有减少的趋势，但K409YZmCPS1产物ent-CPP含量随着DPC浓度增加而逐渐降低。说明K409YZmCPS1彻底改变了ZmCPS1对DPC不敏感。

2、K409YZmCPS1蛋白酶活性动力学常数研究

将转入pDEST-17-K409YZmCPS1的C41大肠杆菌细胞和转入pDEST-17-ZmCPS1的C41大肠杆菌细胞进行蛋白表达和纯化，具体如下：

(1)将构建好的原核表达载体pDEST17-ZmCPS1和pDEST-17-K409YZmCPS1分别转化到C41感受态细胞中，倒置培养16h。

(2)挑取一个单克隆到50mL的培养基过夜培养。

(3)再转化到1L NZY培养基中培养到OD₆₀₀为0.8～1.0左右，加入1mM的IPTG进行诱导大约20h。

(4)将1L的菌体进行5000g，4℃离心20min，如果不立即纯化蛋白保存到-80℃冰箱。

(5)用40mL纯化蛋白bufferA重悬菌体，加入40μL 1M DTT，使菌体充分溶解到bufferA中。

(6)将菌体溶液过homogenizer 3～4次，直至菌体看起来比较清亮，过程中用的压力为10,000～12,000PSI。

(7)用无菌水清洗homogenizer3～4次，然后用20％的乙醇清洗。

(8)将透亮的菌体进行16,000g，4℃离心30min，收集上清液。

(9)打开Bio-Rad蛋白纯化仪，检查所有的部分都已连接好，先不连柱子用mixbuffer(bufferA:bufferB＝50％:50％)清洗3min尽量除去整个仪器中的乙醇，然后再用bufferA清洗3min。

(10)连接纯化Ni柱(10ml)，用bufferA平衡柱子30min。

(11)运行KPN140程序，共得到14管2mL的蛋白。

(12)程序运行完后，用bufferA平衡柱子5min，然后用MES buffer平衡柱子20min后，用灭菌水平衡柱子20min，最后用20％的乙醇溶液平衡柱子10min后断开柱子。

(13)最后用20％的乙醇溶液清洗整个仪器10min后，关掉仪器。

(14)将收集的各管蛋白上样到SDS-PAGE胶，检测每管蛋白纯化的情况。

(15)选择纯度较高且浓度较高的蛋白在冷室中进行透析两次，每次至少6h。

(16)提前准备离心管放到冷室中，分别分装200μL蛋白到每个离心管。

(17)利用Nanodrop检测蛋白的浓度后，用液氮速冻蛋白，保存至-80℃冰箱以备用，得到ZmCPS1纯化蛋白和K409YZmCPS1纯化蛋白。

将ZmCPS1纯化蛋白和K409YZmCPS1纯化蛋白分别与底物GGPP的酶活性动力学的分析，具体如下：

(1)打开30℃的水浴锅，平衡过夜。

(2)准备蛋白反应buffer(最后反应浓度为：50mM HEPES,pH7.75；100mM KCl；10％甘油；0.1mM MgCl₂)。

(3)加入反应buffer、底物GGPP和无菌水总体积为1ml在水浴锅平衡10min。

(4)开始反应加入蛋白，快速涡旋混匀立即放入水浴锅，开始计时。

(5)反应结束后立即加入110μL 20mM的NEM，75℃平衡5min。

(6)冷却到室温后加入20μL 1M的DTT，室温平衡15min目的是灭活NEM以免影响下一步反应。

(7)加入60μL 1M的HCl平衡pH。

(8)再加入134μL 10X CIAP buffer。

(9)加入15U Promega CIAP，37℃平衡至少14h。

(10)用有机溶剂hexanes提取3次，用氮气吹干。

(11)重新溶解到50μL hexanes中，上样到GC-FID。

(12)检测完后，统计产物、底物以及副产物的面积值。

结果如图3所示，为ZmCPS1和K409YZmCPS1蛋白酶活性动力学分析；A：ZmCPS1酶动力学分析；B：K409YZmCPS1蛋白酶活性动力学分析；经过分析ZmCPS1蛋白酶活性动力学常数为：Kcat＝0.25405s-1；Km＝0.60173uM；Ki＝162.74uM；R²＝0.95857。K409YZmCPS1蛋白酶活性动力学常数为：Kcat＝0.27013s^-1；Km＝0.71842uM；Ki＝58.014uM；R²＝0.92721；表明，ZmCPS1和K409YZmCPS1的酶活性常数在催化效率基本一致。

3、K409YZmCPS1与DPC反应的IC50

挑选酶活最强所对应的底物浓度5uM进行与不同浓度DPC反应，具体如下：

(1)打开30℃的水浴锅，平衡过夜。

(3)加入反应buffer及相应浓度的DPC、底物GGPP和无菌水总体积为1ml在水浴锅平衡10min。

(5)反应结束后立即加入110μL 20mM的NEM，75℃平衡5min。

(7)加入60μL 1M的HCl平衡pH。

(8)再加入134μL 10X CIAP buffer。

(9)加入15U Promega CIAP，37℃平衡至少14h。

(10)用有机溶剂hexanes提取3次，用氮气吹干。

(11)重新溶解到50μL hexanes中，上样到GC-FID。

(12)检测完后，统计产物、底物以及副产物的面积值。

统计K409YZmCPS1和ZmCPS1分别与DPC反应的IC50，结果如图4所示，为ZmCPS1和K409YZmCPS1蛋白酶-DPC IC50分析；A：ZmCPS1-DPC IC50分析；B：K409YZmCPS1-DPC IC50分析；ZmCPS1-DPC的IC50为3.594*10^-3M DPC R²＝0.95558；而K409Y ZmCPS1-DPC的IC50为4.642*10^-5M DPC R²＝0.99392；可以看出K409Y ZmCPS1提高了ZmCPS1对DPC敏感100倍，增加了ZmCPS1对DPC的敏感性。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种改善单子叶作物对赤霉素抑制剂敏感性的方法及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2568

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgaagctcc tctcgccggc ggccgcaccg tcgtcctcgc cgttgttccc tcctcgcatc 60

gtcgaagctg cagctcgtca atcaggtcca tgccgtatcc gcatccgtat ccgtggcaaa 120

gcagcagcag caggaggagg aggaggcgcg ggcgcgacgg ggccccgcgg cagcctcagg 180

ctcgccgggt ggtggagagc gcagcagcag gccccggcca cggcgacgac aacgcagcag 240

cctgacaacg tctccagtgc taaagtgttc cagaccagcc gtgtggaaac cgagtccgaa 300

attgcgaaat ggccagggaa accacaagac cttgaggatg agcaccaggc tgaggaggca 360

gagctgcagc cacttatcga ccaggtgagg gcgatgctac ggtcgatgaa cgacggggat 420

accagcgcct cggcgtacga cacggcgtgg gtggcgatgg tgccgaaggt gggcggcgac 480

ggcggcgccc agccccagtt cccggccacc gtgcgctgga tcgtggacca ccagctgccc 540

gacggctcct ggggcgactc ggccctgttc tccgcctacg accgcatgat caacaccctc 600

gcctgcgtcg tcgcgctgac caagtggtcg ctggagcccg cgaggtgcga ggcggggctc 660

tcgttcctgc acgagaacat gtggaggcta gcggaggagg aggcggagtc gatgcccatc 720

ggcttcgaga tcgccttccc ttctctcatc cagacggcta gggacctggg cgtcgtcgac 780

ttcccgtacg gacacccggc gctgcagagc atatacgcca acagggaagt caagctgaag 840

cggatcccaa gggacatgat gcacagggtc ccgacgtcca tcctgcacag ccttgaaggg 900

atgcctgacc tggactggcc gaggcttctg aacctccagt cctgcgacgg ctccttcttg 960

ttctctcctt cggctaccgc ttacgcgctg atgcaaaccg gtgacaagaa gtgcttcgaa 1020

tacatcgaca ggattgtcaa aaaattcaac gggggagtcc ccaatgttta tccggtcgat 1080

cttttcgagc acatctgggt tgtggatcgg ttggagcgac tcgggatctc ccgctacttc 1140

caacgagaga ttgagcagtg catggactat gtgaacaggc actggactga agatgggatt 1200

tgctgggcta ggaaatccaa tgtgaaggat gtggatgaca cagctatggc tttccgacta 1260

ctaaggctac atggatacaa tgtctctcca agtgtgttta agaactttga gaaagatgga 1320

gagttctttt gttttgtggg ccaatcgact caagccgtca ctgggatgta taacctcaac 1380

agagcctctc agataagttt tcaaggagag gatgtattgc atcgtgctag ggttttctcg 1440

tatgagtttc tgagacagag agaagaacaa ggcatgatcc gtgataaatg gatcgttgcc 1500

aaggatctac ctggcgaggt gcaatataca ctagacttcc cttggtatgc aagcttgcct 1560

cgtgtagagg caagaaccta tctagatcaa tatggtggta aagatgacgt ttggattgga 1620

aagacactct acaggatgcc tcttgtgaat aacgacacat atctagagtt ggcaataagg 1680

gatttcaacc attgccaagc tctgcatcag cttgagtgta atgggctgca aacgtggtac 1740

aaggataatt gccttgacgc ttttggagta gaaccacaag atgttttaag atcttacttt 1800

ttagctgctg cttgcatttt tgaacctagc cgtgctgctg agcggcttgc atgggctaga 1860

acgtcaatga ttgccaatgc catttctaca catcttcgtg acatttcgga agacaagaag 1920

agattggaat gtttcgtgca ctgtctctat gaagaaaacg atgtatcatg gcttaaacga 1980

aatcctaatg atgttattct tgagagggca cttcgaagat taattaactt attagcacaa 2040

gaagcattgc caattcatga aggacaaaga ttcatacaca gtctattgag tcttgcatgg 2100

accgaatgga tgttgcaaaa ggcaaataaa gaagaaaaca aatatcacaa atgcagtggt 2160

atagaaccac aatacatggt tcatgatagg caaacatact tacttttagt tcaggttatt 2220

gagatttgtg ctggacgaat tggtgaggct gtgtcaatga taaacaacaa ggataatgat 2280

tggtttattc aactcacatg tgctacttgt gacagtctta accataggat gttactgtcc 2340

caggatacta tgaagaatga agcaagaata aattggattg agaaggaaat cgagttgaat 2400

atgcaagagc ttgctcaatc tctccttttg agatgtgatg agaaaactag caataagaag 2460

accaagaaaa ccttatggga tgtcctaaga agtttatact atgctactca ttccccacaa 2520

catatgatcg atagacatgt ttccagagtt atctttgagc ctgtttaa 2568

<210> 2

<211> 855

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Lys Leu Leu Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ser Ser Ser Pro Leu Phe

1 5 10 15

Pro Pro Arg Ile Val Glu Ala Ala Ala Arg Gln Ser Gly Pro Cys Arg

20 25 30

Ile Arg Ile Arg Ile Arg Gly Lys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Thr Gly Pro Arg Gly Ser Leu Arg Leu Ala Gly Trp

50 55 60

Trp Arg Ala Gln Gln Gln Ala Pro Ala Thr Ala Thr Thr Thr Gln Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asn Val Ser Ser Ala Lys Val Phe Gln Thr Ser Arg Val Glu

85 90 95

Thr Glu Ser Glu Ile Ala Lys Trp Pro Gly Lys Pro Gln Asp Leu Glu

100 105 110

Asp Glu His Gln Ala Glu Glu Ala Glu Leu Gln Pro Leu Ile Asp Gln

115 120 125

Val Arg Ala Met Leu Arg Ser Met Asn Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser

130 135 140

Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Lys Val Gly Gly Asp

145 150 155 160

Gly Gly Ala Gln Pro Gln Phe Pro Ala Thr Val Arg Trp Ile Val Asp

165 170 175

His Gln Leu Pro Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ser Ala Leu Phe Ser Ala

180 185 190

Tyr Asp Arg Met Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Ala Leu Thr Lys

195 200 205

Trp Ser Leu Glu Pro Ala Arg Cys Glu Ala Gly Leu Ser Phe Leu His

210 215 220

Glu Asn Met Trp Arg Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Ser Met Pro Ile

225 230 235 240

Gly Phe Glu Ile Ala Phe Pro Ser Leu Ile Gln Thr Ala Arg Asp Leu

245 250 255

Gly Val Val Asp Phe Pro Tyr Gly His Pro Ala Leu Gln Ser Ile Tyr

260 265 270

Ala Asn Arg Glu Val Lys Leu Lys Arg Ile Pro Arg Asp Met Met His

275 280 285

Arg Val Pro Thr Ser Ile Leu His Ser Leu Glu Gly Met Pro Asp Leu

290 295 300

Asp Trp Pro Arg Leu Leu Asn Leu Gln Ser Cys Asp Gly Ser Phe Leu

305 310 315 320

Phe Ser Pro Ser Ala Thr Ala Tyr Ala Leu Met Gln Thr Gly Asp Lys

325 330 335

Lys Cys Phe Glu Tyr Ile Asp Arg Ile Val Lys Lys Phe Asn Gly Gly

340 345 350

Val Pro Asn Val Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Val Val

355 360 365

Asp Arg Leu Glu Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Gln Arg Glu Ile

370 375 380

Glu Gln Cys Met Asp Tyr Val Asn Arg His Trp Thr Glu Asp Gly Ile

385 390 395 400

Cys Trp Ala Arg Lys Ser Asn Val Lys Asp Val Asp Asp Thr Ala Met

405 410 415

Ala Phe Arg Leu Leu Arg Leu His Gly Tyr Asn Val Ser Pro Ser Val

420 425 430

Phe Lys Asn Phe Glu Lys Asp Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gln

435 440 445

Ser Thr Gln Ala Val Thr Gly Met Tyr Asn Leu Asn Arg Ala Ser Gln

450 455 460

Ile Ser Phe Gln Gly Glu Asp Val Leu His Arg Ala Arg Val Phe Ser

465 470 475 480

Tyr Glu Phe Leu Arg Gln Arg Glu Glu Gln Gly Met Ile Arg Asp Lys

485 490 495

Trp Ile Val Ala Lys Asp Leu Pro Gly Glu Val Gln Tyr Thr Leu Asp

500 505 510

Phe Pro Trp Tyr Ala Ser Leu Pro Arg Val Glu Ala Arg Thr Tyr Leu

515 520 525

Asp Gln Tyr Gly Gly Lys Asp Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Tyr

530 535 540

Arg Met Pro Leu Val Asn Asn Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ile Arg

545 550 555 560

Asp Phe Asn His Cys Gln Ala Leu His Gln Leu Glu Cys Asn Gly Leu

565 570 575

Gln Thr Trp Tyr Lys Asp Asn Cys Leu Asp Ala Phe Gly Val Glu Pro

580 585 590

Gln Asp Val Leu Arg Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Cys Ile Phe Glu

595 600 605

Pro Ser Arg Ala Ala Glu Arg Leu Ala Trp Ala Arg Thr Ser Met Ile

610 615 620

Ala Asn Ala Ile Ser Thr His Leu Arg Asp Ile Ser Glu Asp Lys Lys

625 630 635 640

Arg Leu Glu Cys Phe Val His Cys Leu Tyr Glu Glu Asn Asp Val Ser

645 650 655

Trp Leu Lys Arg Asn Pro Asn Asp Val Ile Leu Glu Arg Ala Leu Arg

660 665 670

Arg Leu Ile Asn Leu Leu Ala Gln Glu Ala Leu Pro Ile His Glu Gly

675 680 685

Gln Arg Phe Ile His Ser Leu Leu Ser Leu Ala Trp Thr Glu Trp Met

690 695 700

Leu Gln Lys Ala Asn Lys Glu Glu Asn Lys Tyr His Lys Cys Ser Gly

705 710 715 720

Ile Glu Pro Gln Tyr Met Val His Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Leu Leu

725 730 735

Val Gln Val Ile Glu Ile Cys Ala Gly Arg Ile Gly Glu Ala Val Ser

740 745 750

Met Ile Asn Asn Lys Asp Asn Asp Trp Phe Ile Gln Leu Thr Cys Ala

755 760 765

Thr Cys Asp Ser Leu Asn His Arg Met Leu Leu Ser Gln Asp Thr Met

770 775 780

Lys Asn Glu Ala Arg Ile Asn Trp Ile Glu Lys Glu Ile Glu Leu Asn

785 790 795 800

Met Gln Glu Leu Ala Gln Ser Leu Leu Leu Arg Cys Asp Glu Lys Thr

805 810 815

Ser Asn Lys Lys Thr Lys Lys Thr Leu Trp Asp Val Leu Arg Ser Leu

820 825 830

Tyr Tyr Ala Thr His Ser Pro Gln His Met Ile Asp Arg His Val Ser

835 840 845

Arg Val Ile Phe Glu Pro Val

850 855

Claims

1.一种蛋白质，为将序列2所示的蛋白ZmCPS1第409位的赖氨酸突变为酪氨酸得到的蛋白突变体。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的编码序列为序列表中序列1。

4.下述1）-4）中的任一种生物材料：

1）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

2）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；

3）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌；

4）含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4所述的生物材料在提高植物对赤霉素抑制剂敏感性中的应用。

6.一种提高植物对赤霉素抑制剂敏感性的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达或含量，得到转基因植物；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达或含量为将蛋白K409Y ZmCPS1编码基因导入目的植物中；

所述蛋白K409Y ZmCPS1为将序列2所示的蛋白ZmCPS1第409位的赖氨酸突变为酪氨酸得到的蛋白突变体。

8.根据权利要求5所述的应用或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述赤霉素抑制剂为缩节安。

9.根据权利要求5所述的应用或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求5所述的应用或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述植物为玉米。