CN109738624A

CN109738624A - 一种血小板衍生生长因子pdgf-bb的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN109738624A
Application number: CN201811641168.5A
Authority: CN
Inventors: 李志远; 程娜; 肖杰; 苏柳惠; 周鹏; 谢威; 杨生辰; 杨秀珍; 邓思浩; 卢大华
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明公开了一种血小板衍生生长因子PDGF‑BB的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法。所述的胶体金核酸适配体试纸条包括底板，所述的底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，两相邻粘贴物之间部分重叠，所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述的结合垫上包被有胶体金标记的Apt1‑Poly T，所述的检测线上包被有PDGF‑BB的核酸适配体Apt2，所述的质控线上包被有3’端标记有生物素的Poly A。本发明的胶体金核酸适配体试纸条的快速、简便、准确、低成本的优势将会促进该种检测方法的推广应用，为药物研究和筛选提供一种新的方法和思路。

Description

一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法

技术领域：

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法。

背景技术：

血小板衍生生长因子(PDGF)是一种人血小板中的生长因子蛋白，具有PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD五种不同形式的二聚体类型。其中，PDGF-BB是血清中重要的细胞因子，是用于癌症诊断和直接参与许多细胞转化过程的蛋白质标志物。PDGF-BB与许多恶性的疾病相关，如，动脉粥样硬化、纤维化。其常在人类恶性肿瘤细胞中过度表达。因此，PDGF-BB的定性和定量检测在生物和医学领域中至关重要。现在常用的方法用于PDGF的检测方法有：酶联免疫吸附测定法、荧光免疫分析和化学发光免疫分析等。

目前常用的用于PDGF的检测方法有：酶联免疫吸附测定法、荧光免疫分析和化学发光免疫分析等。与酶联免疫技术中应用的显色酶或荧光素、放射免疫技术中应用的同位素、血清学中应用的荧光素相比，胶体金拥有以下优点：结果肉眼可见，无需复杂、昂贵的仪器，可用于现场快速诊断；环境友好型，无任何放射污染，无毒无害；结果可长期保存；需时短，可用于快速诊断。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，包括底板，所述的底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，两相邻粘贴物之间部分重叠，所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述的结合垫上包被有胶体金标记的Apt1-Poly T，所述的Apt1-Poly T为3’端加有Poly T的PDGF-BB的核酸适配体Apt1，所述的检测线上包被有PDGF-BB的核酸适配体Apt2，所述的质控线上包被有3’端标记有生物素的Poly A。

优选，所述的Apt1-Poly T的核苷酸序列为：5’-AGGGCGCGTTCTTCGTGGTTACTTTTAGTCCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；所述的PDGF-BB的核酸适配体Apt2的核苷酸序列为：5’-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；所述的Poly A的核苷酸序列为：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

所述的底板优选为PVC底板。

所述的检测线和质控线之间的距离优选为3mm。

本发明的第二个目的是提供一种所述的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1)样品垫的制备：将玻璃纤维膜浸泡在样品垫处理液中，取出干燥，制备得到样品垫；

2)结合垫的制备：用胶体金标记5’端修饰有巯基的Apt1-Poly T，得到胶体金标记的Apt1-Poly T，经封闭、老化后喷到玻璃纤维膜上，干燥，制备得到结合垫；

3)将PDGF-BB的核酸适配体Apt2和3’端标记有生物素的Poly A分别划在硝酸纤维素膜上，以PDGF-BB的核酸适配体Apt2作为检测线，以3’端标记有生物素的Poly A作为质控线；

4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到底板上，两相邻粘贴物之间部分重叠，得到血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条。

优选，所述的样品垫处理液包括4％Triton X-100、1％BSA、2％蔗糖、2％PEG-4000、100mM硼酸、0.1％SDS和0.5μg/mL鲑鱼精DNA，余量为水，pH 9.0。

所述的检测线和质控线之间的距离优选为3mm。

本发明利用血小板衍生生长因子PDGF-BB及其核酸适配体、核酸碱基特异性相互作用，不用任何抗体，实现了血小板衍生生长因子PDGF-BB活性的快速检测。本发明的胶体金核酸适配体试纸条的快速、简便、准确、低成本的优势将会促进该种检测方法的推广应用，为药物研究和筛选提供一种新的方法和思路。

本发明的胶体金核酸适配体试纸条具有以下有益效果：

1.使用简单方便，不需要电泳及酶处理等过程，而且也不需要特殊仪器的使用，只要将血清样品与上样缓冲液滴加到样品垫上即可，各操作过程无需专门的培训，适合于普通实验室使用；

2.检测耗时短，整个过程10min左右即可得到检测结果；

3.价格低廉，不用价格高昂的单克隆抗体，检测用的都是合成的DNA；

4.检测的是细胞因子活性，与普通的抗体双夹心法的最大区别是本方法在保证特异性的同时检测的是细胞因子的DNA结合能力，即通过核酸适配体来捕获特异性细胞因子。

附图说明：

图1是血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的结构示意图；其中，1、底板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7、吸水纸。

图2是血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的检测原理图；(A)胶体金通过Apt1与PDGF-BB蛋白特异性结合；AuNP-Apt1-Poly T Complex为胶体金-核酸复合物，AuNP-Apt1-PDGF-BB-Poly T Complex为胶体金-核酸适配体-PDGF-BB-Poly T聚合物；(B)胶体金核酸适配体试纸条的组装及各部分组成；SP为样品垫，CP为结合垫，NM为硝酸纤维素膜，TL为检测线，CL为质控线，AP为吸水垫；(C)胶体金通过PDGF-BB蛋白和Poly T分别与T线和C线结合。

图3是血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的检测结果，T为检测线，C为质控线。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明建立并完善了一种基于核酸适配体的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，对胶体金-核酸复合物制备溶液配方进行筛选、检测线和质控线的制备以及硝酸纤维素膜的选择、检测液配方选择等关键步骤进行考察，并对试纸条的特异性和稳定性等质量性能指标进行测试。

如图1所示，本发明的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条包括底板1，底板1上依次粘贴有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸7，两相邻粘贴物之间重叠2mm，硝酸纤维素膜4上设有检测线5和质控线6，结合垫3上包被有胶体金标记的Apt1-Poly T(Apt1-Poly T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，检测线5上包被有PDGF-BB的核酸适配体Apt2(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，质控线6上包被有3’端标记有生物素的Poly A(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。

血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的检测原理如图2所示，结合垫上平铺一定量的胶体金标记的Apt1-Poly T，检测线和质控线上分别铺有PDGF-BB的核酸适配体Apt2和3’端标记有生物素的Poly A。当样品为阳性，含待测物(PDGF-BB)溶液经过结合垫时，溶解并与胶体金标记的Apt1-Poly T中的Apt1结合，形成胶体金-核酸适配体-PDGF-BB-Poly T聚合物，Apt2与胶体金-核酸适配体-PDGF-BB-Poly T聚合物中的PDGF-BB结合，在检测区聚集形成红色条带；当样品为阴性时，Apt2与胶体金标记的Apt1-Poly T无法结合，检测线不显色。质控线区域的Poly A能够特异性与胶体金标记的Apt1-Poly T或胶体金-核酸适配体-PDGF-BB-Poly T聚合物的Poly T结合，无论样品中是否含有待测物，均能与胶体金标记的Apt1-Poly T或胶体金-核酸适配体-PDGF-BB-Poly T聚合物结合形成红色条带。当质控线不显色，则视为无效测试。

实施例1：血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的制备

1.1材料与方法

1.1.1主要材料

1.1.2DNA序列

1.1.3主要仪器

1.2实验方法

1.2.1胶体金的制备

(1)取250mL锥形瓶，在准确加入100mL超纯水放入清洗干净的磁力搅拌子，将锥形瓶放入加热型磁力搅拌器中加热搅拌至沸腾；

(2)1％氯金酸工作液配置：准确称取1.0g氯金酸，用90mL超纯水溶解，等其充分溶解后，定容到100mL，配成l％的氯金酸工作液，该溶液于4℃棕色试剂瓶保存备用；

(3)1％柠檬酸三钠溶液配置(现配现用)：准确称取0.1g二水合柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，用10mL超纯水溶解，配成1％的柠檬酸三钠溶液，再用0.22μM滤膜过滤；

(4)将1％氯金酸工作液加热，当氯金酸溶液开始沸腾时，搅拌的同时快速加入4.0mL上述配制的1％柠檬酸三钠溶液；

(5)继续加热搅拌，保持溶液沸腾，当溶液颜色从淡黄转为黑色再变成砖红色时，计时继续加热10分钟，其后关掉加热旋钮，但保持搅拌并自然冷却至室温，制备得到胶体金溶液，已制备的胶体金溶液4℃保存。

1.2.2胶体金-核酸适配体复合物(胶体金标记的Apt1-Poly T)的制备

1.2.2.1最佳核酸标记pH的确定

(1)取8个1.5mL试管，分别加入1mL上述未浓缩的胶体金溶液；

(2)每管分别加入0.1M的K₂CO₃溶液0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL和35μL，混匀，静置5min；

(3)每管分别加入6μL 10μM的DNA1(DNA1为5’端修饰有巯基的Apt1-Poly T，Apt1-Poly T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)溶液混合，室温下震荡30min；

(4)每管分别加入100μL浓度为10％的NaCl溶液，混合均匀，室温下静置10min；

(5)观察胶体金颜色变化，记录保持砖红色的最低pH(加入0.1M的K₂CO₃溶液5μL时的pH8.0)；

(6)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持砖红色的最低pH为最佳标记pH(加入0.1M的K₂CO₃溶液5μL时的pH8.0)。

表1最适核酸标记pH的确定

1.2.2.2最适核酸标记量的确定

(1)取8个1.5mL试管，分别加入1mL上述未浓缩的胶体金溶液；

(2)根据上述结果，每管分别加入最适合量的0.1M的K₂CO₃溶液5μL，混匀，静置5min；

(3)每管分别加入0μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL和9μL 10μM的DNA1(DNA1即为5’端修饰有巯基的Apt1-Poly T，Apt1-Poly T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)溶液混合，室温下震荡30min；

(5)观察胶体金颜色变化，记录保持砖红色的最低核酸标记量(本实验结果是4μL10μM的DNA1)；

(6)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持砖红色的最低核酸标记量为最适核酸标记量(本实验结果是4μL 10μM的DNA1)。

表2最适核酸适配体标记量的确定

1.2.2.3核酸适配体与胶体金的偶联

(1)于1.5mL EP管中加入1mL 10*浓缩的胶体金溶液(10*浓缩，以10mL为例：10mL未浓缩的胶体金溶液，10000rpm，离心35min，去上清，取沉淀，加PBS缓冲液定至1mL)，用5μL0.1M K₂CO₃调pH至最适(pH为8.0)；

(2)取1管1OD的DNA1(DNA1即为5’端修饰有巯基的Apt1-Poly T，Apt1-Poly T的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，打开盖子前先高速迅时离心10秒，加入100μL双蒸去离子水，vortex溶解，静置5分钟，低速离心收集；

(3)将溶解好的DNA1缓慢加于1mL浓缩好的胶体金溶液中，添加过程中保vortex；

(4)4℃反应24小时，得到胶体金-核酸复合物(即胶体金标记的Apt1-Poly T)溶液。

1.2.2.4胶体金-核酸复合物的封闭与老化

(1)封闭液的配置(10％BSA)：电子天平称取10μg BSA溶于100μL ddH₂O中，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用；

(2)取4℃偶联反应24h的胶体金-核酸复合物溶液，缓慢加入10％的BSA溶液，BSA终浓度为1％，添加过程中保持vortex；

(3)室温静置封闭30分钟；

(4)老化溶液的配置：取700μL氯化钠溶液(1.5μM)和7μL的SDS(1％)溶液混合。

(5)将老化溶液缓慢加入步骤(3)BSA封闭好的胶体金-核酸复合物溶液中，添加过程中保持vortex；

(6)4℃老化过夜；

(7)4℃离心，9500rpm，20分钟，弃上清；

(8)用1mL PBS缓冲液(pH7.4)重悬底层胶体金-核酸复合物颗粒，重复步骤(7)和(8)两次；

(9)4℃离心，11500rpm，20分钟，弃上清；

(10)用100μL PBS缓冲液(pH7.4)重悬经封闭、老化、离心收集的胶体金-核酸复合物颗粒，得到经封闭、老化的胶体金-核酸复合物溶液，4℃保存备用。

1.2.3检测线(T线)和质控线(C线)的制备

1.2.3.1 T区制备

(1)取1管1.0OD的DNA2(DNA2即PDGF-BB的核酸适配体Apt2，其核苷酸序列如SEQID ON.2所示)，高速离心5min，缓缓打开盖子，加入三蒸去离子水，振荡溶解，使其终浓度为100μM，得到DNA2溶液；

(2)4℃保存，预备用于制作硝酸纤维膜上的检测线。

1.2.3.2 C区制备

(1)取1管1.0OD的DNA3(DNA3即3’端标记有生物素的PolyA，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示)，高速离心5min，缓缓打开盖子，加入三蒸去离子水，振荡溶解，使其终浓度为100μM，得到DNA3溶液；

(2)4℃保存，预备用于制作硝酸纤维膜上的质控线。

1.2.4血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的制备

1.2.4.1样品垫的预处理

(1)样品垫处理液的配制：裁剪所需大小的玻璃纤维膜，将其浸泡在样品垫处理液(样品垫处理液的配方为：pH 9.0，包括4％Triton X-100，1％BSA，2％蔗糖，2％PEG-4000，100mM硼酸，0.1％SDS，0.5μg/mL鲑鱼精DNA，余量为水)中；

(2)将玻璃纤维膜浸泡在样品垫处理液中半小时后取出晾干，再37℃烘干，制备得到样品垫；

(3)室温干燥下保存。

1.2.4.2结合垫的制备

取1.5μL的经封闭、老化的胶体金-核酸复合物溶液喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干过夜，制备得到结合垫。

1.2.4.3硝酸纤维素膜划线

(1)裁剪所需大小的硝酸纤维素膜，注意不要损坏膜的完整性；

(2)借助点膜仪，将划线量调至1.0μL/cm，质控线和检测线的距离为3.0mm；

(3)将提前准备好的DNA2溶液和DNA3溶液各取30μL依次划在硝酸纤维素膜上，37℃过夜烘干，以DNA2作为检测线(T线)，以DNA3作为质控线(C线)，干燥保存，用于血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的组装。

1.2.4.4血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的组装

(1)血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条一共分为四个部分，依次为样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，依次将其粘贴到一个PVC底板上，相邻两粘贴物之间重叠2mm；

(2)用切条仪将组装好的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条切割成4.0mm宽的条子，干燥密封保存待用。

1.2.5血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的检测

(1)缓冲液的配制

①DNA-蛋白杂交液的配制：称取一定量的Tris-HCl、KCl、MgCl₂、BSA，加入到一定体积的灭菌超纯水中，置于磁力搅拌器中搅拌溶解混匀，调节pH到7.5，并使Tris-HCl的终浓度为10mM，KCl的终浓度为150mM，MgCl₂的浓度为1mM，BSA的终浓度为5％。混合均匀后，加入一定量的甘油，使其终浓度为10％，并充分混匀。在使用之前补加DTT，使之终浓度为1mM。

②上样缓冲液的配制：称取一定量的Tris-HCl和NaCl，加入到一定体积的灭菌超纯水中，置于磁力搅拌器中搅拌溶解混匀，调节pH到8.0，并使Tris-HCl的终浓度为20mM，NaCl的终浓度为150mM。

(2)用DNA-蛋白杂交液将人重组PDGF-BB蛋白以不同浓度梯度稀释，使最终蛋白量分别为0、100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL；

(3)将检测样品(梯度稀释的PDGF-BB蛋白)2μL加到血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的样品垫上，然后往样品垫上滴加65μL上样缓冲液，水平放置该试纸条并放室温静置5～10min后观察结果。

1.2.6检测结果判定标准

阳性：当检测线和质控线都显示红色条带，则判断为阳性，说明待测样品中含有PDGF-BB。检测线的红色条带越深则待测样品中的PDGF-BB浓度越高。

阴性：当检测线不显示红色条带，质控线显示红色条带，则判断为阴性，说明待测样品中不含有PDGF-BB。

无效：当质控线不显示红色条带，无论检测线显不显示红色条带，都判断为无效。

1.3 PDGF-BB蛋白的检测结果

我们用DNA-蛋白杂交液将人重组细胞因子PDGF-BB蛋白稀释为3个浓度梯度：100ng/mL、1μg/mL、10μg/mL，检测结果如图3。

如图3所示，不含有PDGF-BB和含有浓度为100ng/mL PDGF-BB的样品的检测结果为阴性，含有浓度为1μg/mL、10μg/mL PDGF-BB的样品的检测结果为阳性。

实施例2：特异性实验

用DNA-蛋白杂交液(配方同实施例1)分别将PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD蛋白稀释至最终蛋白量为10μg/mL。然后取2μL加到实施例1的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的样品垫上，再往样品垫上滴加65μL上样缓冲液(配方同实施例1)，水平放置该试纸条并放室温静置5～10min后观察结果。

结果表明：只有PDGF-BB的检测结果为阳性，PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD的检测结果均为阴性。说明本发明的胶体金核酸适配体试纸条具有高度的特异性。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggcgcgtt cttcgtggtt acttttagtc ccgttttttt tttttttttt tttt 54

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggctacgg cacgtagagc atcaccatga tcctg 35

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 21

Claims

1.一种血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，包括底板，所述的底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，两相邻粘贴物之间部分重叠，所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，其特征在于，所述的结合垫上包被有胶体金标记的Apt1-Poly T，所述的Apt1-Poly T为3’端加有Poly T的PDGF-BB的核酸适配体Apt1，所述的检测线上包被有PDGF-BB的核酸适配体Apt2，所述的质控线上包被有3’端标记有生物素的Poly A。

2.根据权利要求1所述的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的Apt1-Poly T的核苷酸序列为：5’-AGGGCGCGTTCTTCGTGGTTACTTTTAGTCCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’；所述的PDGF-BB的核酸适配体Apt2的核苷酸序列为：5’-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’；所述的Poly A的核苷酸序列为：5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。

3.根据权利要求1所述的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的底板为PVC底板。

4.根据权利要求1所述的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条，其特征在于，所述的检测线和质控线之间的距离为3mm。

5.一种权利要求1-4任一项所述的血小板衍生生长因子PDGF-BB的胶体金核酸适配体试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的样品垫处理液包括4％TritonX-100、1％BSA、2％蔗糖、2％PEG-4000、100mM硼酸、0.1％SDS和0.5μg/mL鲑鱼精DNA，余量为水，pH 9.0。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的检测线和质控线之间的距离为3mm。