CN109735525B - 一种交联酶聚体的制备方法 - Google Patents
一种交联酶聚体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109735525B CN109735525B CN201811618116.6A CN201811618116A CN109735525B CN 109735525 B CN109735525 B CN 109735525B CN 201811618116 A CN201811618116 A CN 201811618116A CN 109735525 B CN109735525 B CN 109735525B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- cross
- aqueous solution
- ethanol
- linked
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 222
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 222
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 47
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 22
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 19
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 18
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 claims abstract description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 56
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 56
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 56
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 27
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 27
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 27
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 23
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 7
- 235000019982 sodium hexametaphosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H sodium hexametaphosphate Chemical compound [Na]OP1(=O)OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])OP(=O)(O[Na])O1 GCLGEJMYGQKIIW-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 6
- UGTZMIPZNRIWHX-UHFFFAOYSA-K sodium trimetaphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P1(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)O1 UGTZMIPZNRIWHX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 79
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract description 30
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 27
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 20
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 19
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 14
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 13
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 11
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 11
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 10
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 10
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- MLIWQXBKMZNZNF-KUHOPJCQSA-N (2e)-2,6-bis[(4-azidophenyl)methylidene]-4-methylcyclohexan-1-one Chemical compound O=C1\C(=C\C=2C=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])CC(C)CC1=CC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 MLIWQXBKMZNZNF-KUHOPJCQSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- BHTJEPVNHUUIPV-UHFFFAOYSA-N pentanedial;hydrate Chemical compound O.O=CCCCC=O BHTJEPVNHUUIPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 phosphate radical Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000003614 protease activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N γ Benzene hexachloride Chemical compound ClC1C(Cl)C(Cl)C(Cl)C(Cl)C1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种交联酶聚体的制备方法,所述为:将酶水溶液调节pH至2.5‑4.5,加入丙酮或乙醇,搅拌均匀后,室温静置1‑3h,排出酶水溶液与丙酮或乙醇总体积50‑70%的上清液后,在60‑100转/分钟搅拌下加入磷酸盐水溶液,继续搅拌20‑40分钟,室温静置1.5‑3.5小时,过滤,滤液与排出的上清液合并后蒸馏回收丙酮或乙醇;滤饼用去离子水洗涤,然后真空干燥,得到交联酶聚体;本发明方法制备得到的交联酶聚体酶活回收率达到94.3‑97.6%,比现有方法提高27‑36%;在45℃水中90分钟,酶活力保持率达到84.3‑88.7%,比游离酶酶活力保持率提高126.6‑158.6%。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种交联酶聚体的制备方法,特别一种以磷酸盐为交联剂的交联酶聚体的制备方法。
(二)背景技术
2000年荷兰Delfe大学的Sheldondx提出一种酶的制剂新方法,在酶的水溶液中加入硫酸铵或乙醇沉淀酶蛋白,分离出酶蛋白后加入交联剂戊二醛水溶剂,制备得到酶聚集体。这种新型的酶制剂制备成本低,酶活稳定性高,耐热,耐有机溶剂,耐酸碱的性能均优于游离酶,可多次重复使用,成为开发的热点。近20年来,许多酶种均研制了酶聚集体,但是在制备中发现,以戊二醛作为交联剂,共价交联酶蛋白,制得的酶聚集体虽然机械强度较好,但戊二醛交联酶活力损失较大。一方面戊二醛分子尺寸小,可进入酶聚集体内部交联酶活性位点的基团,另一方面共价交联使酶聚集体比较紧密,阻碍部分酶活性位点。为此,国内外科技人员也探索了乙二醇双(N,N-羟基琥珀酰亚胺)作为交联剂,将琼脂,壳聚糖,葡聚糖,阿拉伯胶用高碘酸钾氧化,得到两个或多个交联基团,作为酶的交联剂,这些交联剂与酶蛋白的交联机理与戊二醛相似,只是分子尺寸变大,对酶活影响减少,但交联紧密依然影响酶活。采用磷酸盐作为酶蛋白交联剂,是磷酸根与酶蛋白的氨基、羟基之间的离子交联,磷酸盐分子尺寸较小,可以与酶聚集体内部的基团交联,形成的酶聚集体较稳定,仍保持聚集体的优点。而离子交联的强度明显低于共价交联,因而可较好的避免共价交联影响酶活性位点基团及交联紧密阻碍酶活的问题,使制备的酶聚集体活力保持更好。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种以磷酸盐为交联剂,以离子交联方式制备的交联酶聚集体,与国内外现有制备方法比较,可更好的保持酶催化活力,并具有酶聚集体的相应优点。磷酸盐作为交联剂的酶聚集体,用于食品加工,安全性有保障。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种交联酶聚体的制备方法,所述方法为:将酶水溶液调节pH至2.5-4.5,加入丙酮或乙醇,搅拌均匀后,室温静置1-3h,排出酶水溶液与丙酮或乙醇总体积50-70%的上清液后,在60-100转/分钟搅拌下加入磷酸盐水溶液,继续搅拌20-40分钟,室温静置1.5-3.5小时,过滤,滤液与排出的上清液合并后蒸馏回收丙酮或乙醇;滤饼用去离子水洗涤(优选3次),然后真空干燥(优选在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时),得到交联酶聚体;所述丙酮或乙醇体积用量以酶水溶液体积比为2-4:1;所述磷酸盐水溶液中磷酸盐与酶水溶液中酶的重量比为2~65:1。
进一步,所述酶水溶液浓度为1.0-20mg/mL,优选用0.5M磷酸调节酶液的pH至2.5-4.5。
进一步,所述乙醇优选体积浓度95%乙醇水溶液。
进一步,所述酶为脂肪酶或蛋白酶,更优选黑曲霉脂肪酶(深圳绿微康生物工程有限公司生产,30万单位/克)、假丝酵母脂肪酶(北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产,13万单位/克)、中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产,5-20万单位/克,南宁东恒华道生物科技有限公司生产,20万单位/克)。
进一步,所述磷酸盐水溶液浓度为0.10-0.25g/mL,所述磷酸盐为三聚磷酸钠(Na5P3O10)、三偏磷酸钠(Na3(PO3)3)或六偏磷酸钠(Na6(PO3)6)。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:
本发明以磷酸盐作为离子交联剂,交联酶蛋白制备交联酶聚体,对酶活的影响较常用的交联剂戊二醛小,酶活回收率更高。磷酸盐为国内外均批准用于食品加工的添加剂,可保证食用安全,故用磷酸盐制备的交联酶用于食品工业,安全有保障。本发明方法制备得到的交联酶聚体酶活回收率达到94.3-97.6%,比现有方法提高27-36%;在45℃水中90分钟,酶活力保持率达到84.3-88.7%,比游离酶酶活力保持率提高126.6-158.6%。
(四)附图说明
图1酪氨酸标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明所述室温是指25-30℃。
实施例1
将黑曲霉脂肪酶(深圳绿微康生物工程有限公司生产,30万单位/克)1.0g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到10mg/mL的脂肪酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至3.5,加入300mL丙酮,搅拌均匀,室温静置2h,倾出上清液250mL。余下的酶液在80转/分搅拌下,加入0.15g/mL浓度的三聚磷酸钠(Na5P3O10食品级,淄博越洋化工科技有限公司生产)水溶液50mL,加完三聚磷酸钠水溶液后再搅拌30分钟,静置2.5h,过滤,沉淀以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联脂肪酶(即黑曲霉脂肪酶交联酶聚体)4.5g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收丙酮。黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为97.6%。将黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与黑曲霉脂肪酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为88.5%,黑曲霉脂肪酶游离酶的酶活力保持率为36.2%。
脂肪酶酶活检测依据国标GB/T23535-2009脂肪酶制剂检测方法。
脂肪酶交联酶聚集体酶活的检测按国标GB/T23535-2009脂肪酶制剂检测方法进行。
脂肪酶交联酶聚集体酶活回收率的测定及酶活保持率的检测,均按酶活测定数据计算。
脂肪酶交联酶聚集体的酶活回收率:交联酶聚集体酶活力与用于交联制备的游离酶活力的百分比。
脂肪酶交联酶聚集体的酶活保持率:经加热的交联酶聚集体酶活力与原交联酶聚集体酶活力的百分比。
脂肪酶游离酶的酶活保持率:经加热的游离酶酶活力与原游离酶酶活力的百分比。
实施例2
将假丝酵母脂肪酶(北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产,13万单位/克)1.5g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到15mg/mL的脂肪酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至4.5,加入200mL丙酮,搅拌均匀,室温静置3h,倾出上清液150mL。余下的酶液在60转/分搅拌下,加入0.10g/mL浓度的三偏磷酸钠(Na3(PO3)3食品级,济南光辉化工有限公司生产)水溶液50mL,加完三偏磷酸钠水溶液后再搅拌20分钟,静置3.5h,过滤,沉淀以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联脂肪酶4.1g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收丙酮。
按实施例1确定方法测定脂肪酶酶活。假丝酵母脂肪酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为95.8%。将假丝酵母脂肪酶交联酶聚集体与假丝酵母脂肪酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为87.7%,假丝酵母脂肪酶游离酶的酶活力保持率为35.4%。
实施例3
将黑曲霉脂肪酶(南宁庞博生物工程有限公司生产,30万单位/克)0.2g溶解在200mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到1mg/mL的脂肪酶水溶液200mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至4.0,加入800mL95%乙醇,搅拌均匀,室温静置3h,倾出上清液650mL。余下的酶液在100转/分搅拌下,加入0.25g/mL浓度的六偏磷酸钠(Na6(PO3)6食品级,吴江市鑫茂精细化工有限公司生产)水溶液50mL,加完六偏磷酸钠水溶液后再搅拌40分钟,室温静置1.5h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联脂肪酶3.8g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收乙醇。
按实施例1确定方法测定脂肪酶酶活。黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为97.1%。将黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与黑曲霉脂肪酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为88.3%,黑曲霉脂肪酶游离酶的酶活力保持率为37.2%。
实施例4
将黑曲霉脂肪酶(深圳绿微康生物工程有限公司生产,30万单位/克)0.5g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到5mg/mL的脂肪酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至2.5,加入300mL95%乙醇,搅拌均匀,室温静置1h,倾出上清液250mL。余下的酶液在90转/分搅拌下,加入0.2g/mL浓度的三聚磷酸钠(Na5P3O10食品级,滨州市德盛化工有限公司生产)水溶液50mL,加完三聚磷酸钠水溶液后再搅拌30分钟,静置2h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联脂肪酶4.8g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收乙醇。
按实施例1确定方法测定脂肪酶酶活。黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为97.3%。将黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与黑曲霉脂肪酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为88.7%,黑曲霉脂肪酶游离酶的酶活力保持率为36.5%。
实施例5
1、将中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产,5万单位/克)2.0g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使蛋白酶充分溶解,得到20mg/mL的蛋白酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至3.0,加入200mL丙酮,搅拌均匀,室温静置3h,倾出上清液150mL。余下的酶液在100转/分搅拌下,加入0.1g/mL浓度的三聚磷酸钠(Na5P3O10食品级,淄博越洋化工科技有限公司生产)水溶液50mL,加完三聚磷酸钠水溶液后再搅拌40分钟,静置1.5h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤酶聚集体,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联蛋白酶4.7g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收丙酮。
2、蛋白酶酶活测定
蛋白酶酶活采用福林酚法进行测定,依据国标GB/T 23527-2009蛋白酶制剂检测方法,酶活定义:每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位。
1)L-酪氨酸标准曲线制作:
称取L-酪氨酸0.1000g,用1mol/L盐酸60mL溶解后再用蒸馏水定容至100mL,即为1mg/mL的L-酪氨酸标准溶液;吸取1mg/mL的L-酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸定容至100mL,即得到100ug/mL的L-酪氨酸标准储备溶液,按表1进行酪氨酸标准溶液的配置。
表1L-酪氨酸标准溶液
分别取上述溶液各1.00ml,各加0.4mol/L碳酸钠水溶液5.00ml、福林试剂1.00ml,振荡均匀,置于30℃水浴中显色20min,取出冷却至常温,用分光光度计于波长680nm,以0号管为空白测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线,结果见图1所示。标准曲线拟合方程为:Y=0.0104x+0.001;拟合度R2=0.9998。
2)游离酶酶活的测定
先将质量浓度1%酪蛋白水溶液放入30℃恒温水浴锅中,预热5min。样品管加入游离蛋白酶用去离子水溶解制备的10mg/mL待测蛋白酶液1.00mL,保温2min,再加入预热的质量浓度1%酪蛋白水溶液1.00mL,摇匀,反应10min,再加入0.4mol/L的三氯乙酸水溶液2.00mL,摇匀,过滤,取1.00ml上清液,加入0.4mol/L的碳酸钠水溶液5.0mL,再加入福林酚试剂1.00mL,30℃下显色20min,取出冷却至常温,用分光光度计于波长680nm测定其吸光度(A);以0号管为空白对照,先加入待测蛋白酶液1.00mL,保温2min,再加入0.4mol/L的三氯乙酸水溶液2.00mL,摇匀,加预热的质量浓度1%酪蛋白水溶液1.00mL,摇匀,静置10min,过滤,取1.00mL上清液,加入0.4mol/L的碳酸钠水溶液5.0mL,再加入福林酚试剂1.00mL,30℃下显色20min,取出冷却至常温,用分光光度计于波长680nm测定其吸光度(A)。
3)交联酶聚集体的酶活测定
向锥形瓶中加入质量浓度1%的酪蛋白水溶液10.00mL和pH 7.0去离子水9.00mL,于30℃水浴保温5min,再加入1.00ml(酶活范围为10~15u/mL)交联酶聚集体在去离子水中的搅拌分散液,混匀,于30℃水浴保温10min后,取2.00mL置于试管中,再加入0.4mol/L的三氯乙酸水溶液2.00mL,摇匀,过滤,取1.00ml上清液,加入0.4mol/L的碳酸钠水溶液5.0mL,再加入福林酚试剂1.00mL,30℃下显色20min,取出冷却至常温,以0号管为空白对照,用分光光度计于波长680nm测定其吸光度(A)。
根据吸光值从标准曲线上读出酪氨酸的浓度,根据酶活的定义,转换为最终稀释液的酶活力,单位为u/mL。样品的酶活力按下式计算:
X——样品的酶活,u/g;
A——由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力,u/mL;
n——样品的稀释倍数;
m——样品的质量,单位为克(g)
蛋白酶交联酶聚集体酶活回收率的测定及酶活保持率的检测,均按酶活测定数据计算。
蛋白酶交联酶聚集体的酶活回收率:交联酶聚集体酶活力与用于交联制备的游离酶活力的百分比。
蛋白酶交联酶聚集体的酶活保持率:经加热的交联酶聚集体酶活力与原交联酶聚集体酶活力的百分比。
蛋白酶游离酶的酶活保持率:经加热的游离酶酶活力与原游离酶酶活力的百分比。
按上述方法测定蛋白酶酶活。中性蛋白酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为94.3%。将中性蛋白酶交联酶聚集体与中性蛋白酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为85.4%,中性蛋白酶游离酶的酶活力保持率为34.6%。
实施例6
将中性蛋白酶(南宁东恒华道生物科技有限公司生产,20万单位/克)1.0g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使蛋白酶充分溶解,得到10mg/mL的蛋白酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至3.5,加入300mL丙酮,搅拌均匀,室温静置2h,倾出上清液200mL。余下的酶液在80转/分搅拌下,加入0.15g/mL浓度的三偏磷酸钠(Na3(PO3)3食品级,济南光辉化工有限公司生产)水溶液50mL,加完三偏磷酸钠水溶液后再搅拌30分钟,静置2.5h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联蛋白酶4.3g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收丙酮。
按实施例5方法测定蛋白酶酶活。中性蛋白酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为95.1%。将中性蛋白酶交联酶聚集体与中性蛋白酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为85.7%,中性蛋白酶游离酶的酶活力保持率为35.3%。
实施例7
将中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产,10万单位/克)0.2g溶解在200mL去离子水中,搅拌均匀使蛋白酶充分溶解,得到1mg/mL的蛋白酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至4.0,加入800mL95%乙醇,搅拌均匀,室温静置1h,倾出上清液700mL。余下的酶液在60转/分搅拌下,加入0.25g/mL浓度的三聚磷酸钠(Na5P3O10食品级,淄博越洋化工科技有限公司生产)水溶液50mL,加完三聚磷酸钠水溶液后再搅拌20分钟,静置3.5h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联蛋白酶4.0g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收乙醇。
按实施例5方法测定蛋白酶酶活。中性蛋白酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为94.8%。将中性蛋白酶交联酶聚集体与中性蛋白酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为84.7%,中性蛋白酶游离酶的酶活力保持率为35.1%。
实施例8
将中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产,20万单位/克)0.7g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使蛋白酶充分溶解,得到7mg/mL的蛋白酶水溶液100mL。用0.5M磷酸调节酶液pH至4.5,加入300mL95%乙醇,搅拌均匀,室温静置2h,倾出上清液250mL。余下的酶液在70转/分搅拌下,加入0.2g/mL浓度的六偏磷酸钠(Na6(PO3)6食品级,吴江市鑫茂精细化工有限公司生产)水溶液50mL,加完六偏磷酸钠水溶液后再搅拌30分钟,静置3h,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到离子交联蛋白酶4.4g。滤液与排出的上清液合并,蒸馏回收乙醇。
按实施例5方法测定蛋白酶酶活。中性蛋白酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为94.5%。将中性蛋白酶交联酶聚集体与中性蛋白酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为84.3%,中性蛋白酶游离酶的酶活力保持率为34.9%。
对比例1
将黑曲霉脂肪酶(深圳绿微康生物工程有限公司生产,30万单位/克)1.0g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到10mg/mL的脂肪酶水溶液100mL。加入硫酸铵(食品级,江苏科伦多食品配料有限公司生产)35克,搅拌使硫酸铵完全溶解,室温静置3小时,加入质量浓度1%戊二醛(化学纯,山东攀泽化工科技有限公司生产)水溶液10mL,搅拌40分钟,静置3小时,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到戊二醛交联脂肪酶1.7g。滤液真空蒸发脱水,回收硫酸铵。
按实施例1确定的方法测定脂肪酶酶活。黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为73.8%。将黑曲霉脂肪酶交联酶聚集体与黑曲霉脂肪酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为88.2%,黑曲霉脂肪酶游离酶的酶活力保持率为35.7%。
对比例2
将中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产,10万单位/克)1.0g溶解在100mL去离子水中,搅拌均匀使脂肪酶充分溶解,得到10mg/mL的脂肪酶水溶液100mL。加入硫酸铵(食品级,江苏科伦多食品配料有限公司生产)35克,搅拌使硫酸铵完全溶解,静置3小时,加入质量浓度1%戊二醛(化学纯,山东攀泽化工科技有限公司生产)水溶液10mL,搅拌40分钟,室温静置3小时,过滤,以100mL去离子水分三次洗涤,然后在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时,得到戊二醛交联脂肪酶1.6g。滤液真空蒸发脱水,回收硫酸铵。
按实施例5方法测定蛋白酶酶活。中性蛋白酶交联酶聚集体与原酶比较,酶活回收率为71.7%。将中性蛋白酶交联酶聚集体与中性蛋白酶游离酶均用去离子水配成10mg/mL的样液,放入45℃水中90分钟,交联酶聚集体的酶活力保持率为85.6%,中性蛋白酶游离酶的酶活力保持率为34.3%。
Claims (3)
1.一种交联酶聚体的制备方法,其特征在于所述方法为:将1.0-20mg/mL酶水溶液调节pH至2.5-4.5,加入丙酮或乙醇,搅拌均匀后,室温静置1-3h,排出酶水溶液与丙酮或乙醇总体积50-70%的上清液后,在60-100转/分钟搅拌下加入0.10-0.25g/mL磷酸盐水溶液,继续搅拌20-40分钟,室温静置1.5-3.5小时,过滤,滤液与排出的上清液合并后蒸馏回收丙酮或乙醇;滤饼用去离子水洗涤,然后真空干燥,得到交联酶聚体;所述丙酮或乙醇体积用量以酶水溶液体积比为2-4:1;所述磷酸盐水溶液中磷酸盐与酶水溶液中酶的重量比为2~65:1;所述磷酸盐水溶液中的磷酸盐为三聚磷酸钠、三偏磷酸钠或六偏磷酸钠;所述酶为黑曲霉脂肪酶、假丝酵母脂肪酶或中性蛋白酶。
2.如权利要求1所述交联酶聚体的制备方法,其特征在于所述乙醇为体积浓度95%乙醇水溶液。
3.如权利要求1所述交联酶聚体的制备方法,其特征在于所述真空干燥是在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811618116.6A CN109735525B (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种交联酶聚体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811618116.6A CN109735525B (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种交联酶聚体的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109735525A CN109735525A (zh) | 2019-05-10 |
CN109735525B true CN109735525B (zh) | 2021-05-07 |
Family
ID=66361740
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811618116.6A Active CN109735525B (zh) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | 一种交联酶聚体的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109735525B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1418231A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Avantium International B.V. | Stabilised crosslinked enzyme aggregates |
CN102154256A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-17 | 深圳大学 | 一种无载体固定化脂肪酶及其制备方法 |
CN102492683A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-06-13 | 南宁奕德环境科技有限公司 | 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法 |
CN103923900A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-07-16 | 江南大学 | 一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用 |
CN106177924A (zh) * | 2016-07-15 | 2016-12-07 | 黑龙江省科学院高技术研究院 | 纳米级乳铁蛋白壳聚糖微粒的制备方法 |
CN108753755A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海师范大学 | 一种交联生物酶催化剂及其应用 |
-
2018
- 2018-12-28 CN CN201811618116.6A patent/CN109735525B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1418231A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Avantium International B.V. | Stabilised crosslinked enzyme aggregates |
CN102154256A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-17 | 深圳大学 | 一种无载体固定化脂肪酶及其制备方法 |
CN102492683A (zh) * | 2011-12-01 | 2012-06-13 | 南宁奕德环境科技有限公司 | 一种交联草酸脱羧酶聚集体的制备方法 |
CN103923900A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-07-16 | 江南大学 | 一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用 |
CN106177924A (zh) * | 2016-07-15 | 2016-12-07 | 黑龙江省科学院高技术研究院 | 纳米级乳铁蛋白壳聚糖微粒的制备方法 |
CN108753755A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-06 | 上海师范大学 | 一种交联生物酶催化剂及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
三偏磷酸钠交联玉米淀粉的理化性质研究;季佳佳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20130115(第1期);全文 * |
交联酶聚集体性能改善研究进展;陈翠翠等;《食品工业科技》;20180723;第39卷(第22期);全文 * |
六偏磷酸钠制备交联淀粉中不同反应条件对沉降;张皓等;《当代化工研究》;20170703(第5期);全文 * |
应用三聚磷酸钠为交联剂制备药物纳米粒的研究;蒋新宇等;《中国现代医学杂志》;20031111;第13卷(第22期);摘要、第69-70页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109735525A (zh) | 2019-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
McCready et al. | The separation and quantitative estimation of amylose and amylopectin in potato starch | |
Biely et al. | Remazol brilliant blue-xylan: a soluble chromogenic substrate for xylanases | |
Peterson et al. | Chromatography of proteins. I. Cellulose ion-exchange adsorbents | |
BG63014B1 (bg) | Метод за получаване на зърнени екстракти | |
CN107459585B (zh) | 一种低分子量银耳多糖的生产方法 | |
US10961324B2 (en) | Method for preparation of novel modified bio based materials | |
CN112647351B (zh) | 一种环保低氯湿强剂的制备方法 | |
WO2019091496A1 (zh) | 一种采用纤维素酶喷雾干燥制备壳寡糖的方法 | |
CN104861182A (zh) | 基于纤维素化学交联的明胶膜及其制备方法 | |
CN109735525B (zh) | 一种交联酶聚体的制备方法 | |
WO2020038077A1 (zh) | 一种复合酶制备的壳寡糖及其制备方法 | |
CN112337495A (zh) | 过氧化物模拟酶、其制备方法及用途 | |
West et al. | Evaluating lignins as enzyme substrates: Insights and methodological recommendations from a study of laccase-catalyzed lignin polymerization | |
CN108864271B (zh) | 一种蛋白琥珀酸铁的制备方法 | |
CN105727761B (zh) | 一种抗蛋白质污染两性离子超滤膜及其制备方法 | |
CN109182308B (zh) | 一种利用pH响应型木质素基聚醚回收纤维素酶的方法 | |
Taylor et al. | Separation of the amyloses in some common starches | |
CN107574197A (zh) | 一种浒苔多糖的生物降解方法 | |
Yamaguchi et al. | Macromolecular structure and morphology of native glycogen particles isolated from Candida albicans | |
JPS6014761B2 (ja) | β−1,3−グルカン誘導体およびその製造法 | |
CN110038455A (zh) | 一种提高聚偏氟乙烯膜材料耐污性的方法 | |
CN113185708B (zh) | 一种改性木质素及其制备方法和应用 | |
CN116496419A (zh) | 硅烷偶联剂改性醋酸纤维素耐高温耐旱固沙剂及制备方法与用途 | |
CN115992198A (zh) | 一种测定右旋糖酐酶活力的方法及其应用 | |
CN118083995A (zh) | 一种二氧化硅表面改性方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |