CN115992198A - 一种测定右旋糖酐酶活力的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶活力测定技术领域。针对现有的右旋糖酐酶活力测定技术存在的灵敏度低、标准曲线截距偏离坐标轴原点的问题，本发明公开一种测定右旋糖酐酶活力的方法及其应用，具体包括以下步骤：a.底物的精制；b.酶活力测定：制作用MBTH法测得的葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；用MBTH法检测待测右旋糖酐酶水解右旋糖酐后产生的相当于葡萄糖的吸光度值；推算右旋糖酐酶的活力；c.牙膏以及漱口水中酶活力的测定。本发明的酶活力测定方法灵敏度高，所用葡萄糖标准曲线以及相应的酶浓度曲线的截距均接近于零，样品的稀释倍数不会影响酶活力测定的准确性。
Description
技术领域
本发明属于酶活力测定技术领域，具体涉及的是一种测定右旋糖酐酶活力的方法及其应用。
背景技术
右旋糖酐酶，又称α-葡聚糖酶，是专一性水解右旋糖酐分子中α-1,6糖苷键的酶。其水解类型包括内切型和外切型，内切右旋糖酐酶(Endodextranase EC 3.2.1.11，α-1,6-glucan 6-glucanohydrolase)的主要酶解产物为异麦芽寡糖；外切右旋糖酐酶(Exodextranase EC 3.2.1.70，glucan 1,6-α-glycosidase)的主要酶解产物为葡萄糖。右旋糖酐是牙菌斑生物膜的组成成分，右旋糖酐酶通过降解右旋糖酐能够破坏牙菌斑生物膜，进而达到预防龋齿的目的，因此，右旋糖酐酶常作为抗龋齿成分添加在牙膏或漱口水中。
酶活力是衡量酶活性的重要指标。右旋糖酐酶的活力单位可被定义为在一定酶解条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于葡萄糖的量为一个酶活力单位。目前测定右旋糖酐酶活力的方法主要为DNS法(常国炜,黎志德,黄曾慰,等.右旋糖酐酶酶学特性及热失活动力学研究[J].中国调味品,2021,46(5)；赵亚华.生物化学与分子生物学实验技术教程[M].北京：高等教育出版社,2005:69-70)，DNS法通过测定右旋糖酐酶的酶解过程中还原糖浓度的增加速度来计算右旋糖酐酶活力，但DNS法的灵敏度相对较低，一方面，需较大的底物酶解率才可以测得酶解产物的还原端基的浓度，无法测得酶解初速度，特别是对于Km值较大的右旋糖酐酶，很难得到零级反应的酶解速度，从而无法利用酶解时间段(如酶解30min)来计算酶解初速度；另一方面，需较高的酶浓度，而酶溶液中的杂质(如来源于牙膏、漱口水)浓度也相应较高，它们对右旋糖酐酶的激活或抑制作用会更明显。此外，有关DNS法不符合化学计量学的问题也早有报导(Mccleary B V,Mcgeough P.A Comparison ofPolysaccharide Substrates and Reducing Sugar Methods for the Measurement ofendo-1,4-β-Xylanase[J].Applied Biochemistry&Biotechnology,2015,177(5)：1152-1163)，而且，以DNS法所测得的葡萄糖标准曲线偏离坐标轴原点，在上述常国炜等人的文章中已有描述。迄今为止，右旋糖酐酶活力的测定方法尚未见标准性文件。
MBTH法可以用于测定木聚糖酶、溶菌酶及β-葡聚糖酶的活力，以测定β-葡聚糖酶活力为例，采用的MBTH试剂由MBTH溶液和DTT溶液混合而成，该方法较比浊法简便、快速、准确、价廉；灵敏度明显高于DNS法和铁氰化钾法。发明人尝试将MBTH法用于右旋糖酐酶活力的测定，发现该方法在应用过程中存在下列问题：(1)市售右旋糖酐产品不适于酶活力测定，因为①中、低分子量右旋糖酐(如右旋糖酐20、40、70)致使测定的本底值过高，其吸光度值甚至会超过仪器测量上限；②医药级、标准品级的分子量大的(分子量≥70kDa)的右旋糖酐虽然本底值适用于酶活力测定，但其价格极其昂贵(价格＞250元/g)，导致检测成本过高；③市售的普通级别的右旋糖酐，尽管有大分子量的产品，但是其分子量分布过宽，仍会使其测定本底值过高；④上述①、②中所述的右旋糖酐的原料与③的情况相同，也存在本底值过高的问题；(2)大分子量右旋糖酐在水中的溶解度较低，难以配制浓度适用于酶活力测定时的底物溶液；(3)获得的葡萄糖标准曲线的截距尽管较小，优于DNS法，但是，仍偏离坐标轴原点，会因酶溶液的稀释倍数不同而影响酶活力测定的准确性；(4)显色产物不够稳定，导致葡萄糖标准曲线的斜率随时间发生变化。
另外，在测定牙膏、漱口水中的右旋糖酐酶活力时，发明人发现，牙膏中的成分极其复杂，存在黄原胶、纤维素胶等粘性成分以及碳酸钙、焦磷酸钙等水不溶性成分，如果不除去则会影响测定的精密度、准确度，如果将其除去，右旋糖酐酶可能会吸附于这些不溶物而被同时除去，也会影响检测结果的准确性。而在漱口水中，发明人发现由于酶的保护剂的使用，也会在一定程度上影响酶活力的测定。因此，除去不溶物、保护剂的方法对于右旋糖酐酶活力测定的准确性也是至关重要。
发明内容
针对现有的右旋糖酐酶活力测定技术存在的灵敏度低、标准曲线截距偏离坐标轴原点、牙膏、漱口水中的杂质对酶活力测定干扰明显，以及现有MBTH法用于右旋糖酐酶活力测定存在底物本底值过高、标准曲线截距偏离坐标轴原点、显色产物不稳定的问题，本发明提供一种测定右旋糖酐酶活力的方法及其应用，同时设计了一种应用于全自动化高通量的酶活力测定手段，通过下列手段得以实现：1).提供简便、价廉的右旋糖酐精制方法；2).提供适用于酶解时的底物溶解方法；3).提供牙膏、漱口水中的右旋糖酐酶的提取方法；4).改进了MBTH试剂、检测波长、葡萄糖标准曲线的绘制方法，使获得的标准曲线截距更接近于坐标轴原点且显色产物更加稳定，从而提高了检测的灵敏度、准确性和实验的重复性；5).设计了一种酶解反应与MBTH反应使用同一仪器同一温度进行连续测定的方法，使右旋糖酐酶活力测定时达到快速、高效及自动化。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
(一)测定右旋糖酐酶活力的方法
(1)精制右旋糖酐：
本发明采用右旋糖酐作为底物，如果右旋糖酐的重均分子量≥70kDa且最小分子量
＞10kDa，则可直接作为精制底物使用，省略以下精制步骤。精制底物的方法如下：
a.将右旋糖酐粉碎，制成右旋糖酐粉末，更优选底物研碎至全部通过60目以上筛为止；
b.将右旋糖酐粉末分散于35％-70％的乙醇溶液中，充分搅拌，离心，弃去上清液，可重复该步骤数次，将右旋糖酐粉末中的小分子物质除去；
作为优选，乙醇溶液的浓度为60-70％，低聚糖更容易溶解，所得沉淀中为大分子量底物；
作为优选，底物与乙醇溶液的质量(g):体积(mL)为1:(130-170)，更优选1:(140-160)；
作为优选，搅拌时间为3-5h；
作为优选，2500-4000RCF离心，离心时间为5-20min，更优选10-15min。
c.采用浓度递增的乙醇溶液对步骤b得到的沉淀进行逐级脱水，作为优选，沉淀与80-100％乙醇的质量(g):体积(mL)为1:(20-25)充分混匀后，再次加入80-100％乙醇进行分散，可以重复多次，然后离心，弃去上清液，再向沉淀中加入无水乙醇，离心，弃去上清液；
作为优选，加入90％-100％乙醇；作为优选，每次加入的乙醇溶液的体积相同；作为优选，加乙醇溶液进行分散的操作重复2-5次，更优选3次；作为优选，充分混匀10min后再进行下一次的重复操作；作为优选，2500-4000RCF离心，更优选3000-4000RCF离心；作为优选，每次的离心时间为5-20min，更优选离心10-15min。
d.将丙酮加入到步骤c得到的沉淀中，超声后静置，在高真空度条件下减压旋蒸，得到干燥的精制底物，所述的高真空度是指其压力≤-0.089MPa；作为优选，沉淀与丙酮的质量(g):体积(mL)为1:(20-100)，更优选1:(50-60)；作为优选，超声时间为1-5min，更优选2-3min；作为优选，静置时间为1-2h；作为优选，高真空度的压力范围为-0.09MPa--0.098MPa，维持旋蒸温度在25-40℃范围内。
相比于透析法或超滤法除去小分子底物，这种底物的精制方法，不会像透析法或超滤法一样耗去大量超纯水，更不会像透析法那样耗费大量时间(三天以上)，仅在一天内便可完成，极大幅度地降低了成本。
右旋糖酐具有强大的亲水能力，通过醇沉所得右旋糖酐沉淀中含有大量乙醇和少量水分，如果利用常压干燥或者常规真空干燥箱进行干燥，沉淀中的乙醇随着干燥进程会逐渐减少，而此时沉淀中的水分则会瞬间与右旋糖酐分子发生相互作用而形成膜状或块状物，致使干燥不彻底。为了解决上述问题，首先，利用逐级升高乙醇浓度的方法，逐级脱水，最后用丙酮浸泡进一步脱水；然后，在高真空度条件下以旋蒸的方式避免因乙醇脱除而使样品发生局部凝胶化，因此，逐级脱水和高真空旋蒸是获得右旋糖酐精制样品的关键。如此得到的右旋糖酐精制样品呈均匀、疏松、细腻的粉末状，远优于现有技术。相比于冻干法干燥底物，这种底物干燥的方法，更加省时，更加节约成本。
(2)配制底物溶液及右旋糖酐酶溶液：
将重均分子量≥70kDa且最小分子量＞10kDa的右旋糖酐或精制底物加入到浓度为0.1-1mol/L强碱溶液中，充分混匀使其溶解，加入酸调pH至待测pH值，用待测pH值的缓冲溶液定容，从而得到底物溶液；
用同一所述缓冲溶液配制右旋糖酐酶溶液；同一缓冲溶液具体来说就是配制右旋糖酐酶溶液所使用的缓冲溶液与配制底物溶液的缓冲溶液不论是种类、浓度还是pH值，都是完全相同的；最好选用稳定性好的缓冲溶液，尽量缩短操作时间，以保证配制右旋糖酐酶溶液和配制底物溶液的时候，缓冲溶液的种类、浓度、pH值是完全相同的，以排除对检测结果可能产生的影响。
作为优选，强碱为NaOH或KOH，调pH值的酸为配置缓冲溶液的共轭酸，加强碱溶解和加共轭酸调pH后，体系中的离子强度与定容时用的缓冲溶液的离子强度相同。
作为优选，所述缓冲溶液为测右旋糖酐酶活力的最适酸碱度的缓冲溶液；更优选为丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
现有溶解底物的方法是在热水中(同加热溶解)溶解，溶解后的右旋糖酐溶液粘度较高，不利于酶解反应，本发明的配制的底物溶液粘度较低，更有利于酶解反应，所获得的标准曲线斜率更大，检测还原端基的灵敏度更高。
作为优选，底物溶液现配现用。将室温配制好的右旋糖酐溶液在4℃、-18℃保藏所得标准曲线斜率明显降低，截距明显增大，因此右旋糖酐溶液需现配现用，不宜长期存放。
(3)绘制葡萄糖吸光度值与葡糖糖浓度的标准对应关系曲线：
a.用步骤(2)配制的底物溶液，配制一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液，所述一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液中的底物的浓度相同，并且葡萄糖浓度范围在0-0.5mmol/L；
b.向所述一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液中加入碱性试剂得到碱性葡萄糖标准溶液，所述碱性葡萄糖标准溶液中的碱性试剂的浓度相同，然后向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂，MBTH的初始浓度范围为0.3-4.5mmol/L，DTT的初始浓度范围为0-1.6mmol/L，在50-100℃条件下反应5-180min，再加入酸性铁试剂，反应体系变成酸性，体系中其H+浓度为0.02-0.3mol/L，Fe3+的初始浓度范围为1-6mmol/L，发生显色反应，显色稳定后在580-680nm波长下测定吸光度值，根据每组葡萄糖浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；
所述的MBTH试剂由MBTH和DTT配制而成，或者只由MBTH配制而成；所述的酸性铁试剂由可溶性Fe3+盐和强酸配制而成；
“MBTH的初始浓度范围为0.3-4.5mmol/L，DTT的初始浓度范围为0-1.6mmol/L”，可以理解，此处MBTH试剂的浓度描述的是加入MBTH试剂的瞬间，还未反应时的初始浓度。
“Fe3+的初始浓度范围为1-6mmol/L”，可以理解，此处Fe3+的浓度描述的是加入酸性铁试剂的瞬间，还未反应时的初始浓度。
未反应的MBTH试剂与Fe3+需要在酸性环境下发生反应，前述H+浓度描述的是加入酸性铁试剂后，酸碱中和反应完毕时的H+浓度。
作为优选，酸性铁试剂中的可溶性Fe3+盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁铵中的至少一种，强酸为氨基磺酸、硫酸及盐酸中的至少一种。
作为优选，向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂后，体系中MBTH的初始浓度范围为0.95-3.6mmol/L，DTT的初始浓度为0mmol/L，再加入酸性铁试剂后，体系中Fe3+的初始浓度范围为3-5mmol/L。与含有DTT的MBTH试剂(β-葡聚糖酶活力的测定方法中DTT浓度为1mg/mL)相比，不加DTT时所获得的标准曲线斜率更大，检测还原端基的灵敏度更高，截距也更接近于0。
作为优选，趁热加入酸性铁试剂，室温下冷却，显色稳定后测定吸光度值。
作为优选，在室温静置50-180min，在该显色时间内于590nm-650nm下测定吸光度值，更优选为590nm-610nm。
作为优选，振板后使用酶标仪测定吸光度值。
(4)右旋糖酐酶的酶解反应：
向右旋糖酐酶溶液中加入步骤(2)配制的底物溶液，保证底物的浓度与步骤(2)葡萄糖标准溶液中底物的浓度相同，然后进行酶解反应，再加入碱性试剂，终止酶解反应，得到碱性酶解液，所述碱性酶解液中碱性试剂的浓度与步骤(2)碱性葡萄糖标准溶液中碱性试剂的浓度相同。
作为优选，酶解反应体系中底物浓度范围为0.5-5mg/mL；酶解反应温度为25-60℃，反应时间5-60min；反应以37℃酶解30min为例，优选酶解反应体系中右旋糖酐酶浓度范围为0.032-16.5mU/mL。
(5)制备碱性酶解空白溶液：
具体来讲，参照步骤(4)的方法，区别在于在底物溶液与右旋糖酐酶溶液混合前，先向右旋糖酐酶溶液中加入碱性试剂后再加入底物溶液，由此得到碱性酶解空白溶液；该步骤按照实验室常用的空白对照组的设置方法进行，底物溶液、碱性试剂、右旋糖酐酶溶液的量符合步骤(4)的比例关系，优选底物溶液、碱性试剂、旋糖酐酶溶液的量与步骤(4)相同。
(6)测定碱性酶解液和碱性酶解空白溶液：
参照步骤(3)的方法进行MBTH反应，测得步骤(4)得到的碱性酶解液和步骤(5)得到的碱性酶解空白溶液反应后的吸光度值，从而获得酶解产生的还原端基浓度，进而得到右旋糖酐酶活力。
(二)本发明还提供上述测定右旋糖酐酶活力的方法，在测定牙膏和漱口水中右旋糖酐酶活力的应用。
1、测定牙膏中右旋糖酐酶活力：
首先需要充分提取牙膏中的右旋糖酐酶，精密称取一定量的牙膏，用缓冲溶液转移到组织匀浆器中，精细研磨，将该混合液转移至离心管中，在确保酶不失活的温度条件下离心，将上清液用缓冲溶液调整右旋糖酐酶的浓度及pH值，定容，配制成相当于牙膏浓度为0.1-100mg/mL的溶液，作为待测酶溶液，测定方法参照第(一)部分。样品中酶提取的加标回收率为100％-120％，证明样品处理方式可充分提取右旋糖酐酶，上述使用组织匀浆器的目的在于使牙膏中存在于稳定剂中的右旋糖酐酶充分解吸附。
作为优选，缓冲溶液的加入量为每1g牙膏需要加入0.01-10L缓冲液；作为优选，以3000-4000RCF进行离心，离心时间10-15min；作为优选，在4℃离心；作为优选，精密称取0.1-10g牙膏，配制浓度为0.1-100mg/mL的牙膏溶液。
2、测定漱口水中右旋糖酐酶活力：
精密称取一定量的漱口水，一次性加入大量的缓冲溶液，配制浓度为0.1-100mg/mL的漱口水溶液，该漱口水溶液即可作为右旋糖酐酶溶液用于酶活力测定。测定方法参照第(一)部分。上述一次性加入缓冲溶液的目的在于破坏右旋糖酐酶在漱口水中的被保护状态而彻底释放并溶解于缓冲溶液中。
作为优选，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中的酶解反应和MBTH反应可在金属浴中采用同一温度连续进行，实现高通量测定。此方法在酶解反应完成后不需要对金属浴进行升温，可直接加入MBTH溶液进行反应，显色完成后也不需要对金属浴进行降温才能再进行酶解，可连续进行酶活力测定，避免了繁琐的操作程序，可实现全自动化的样品检测。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明的底物精制方法简便、快速、高效，其制备成本远低于超滤、透析等膜分离法，高效率地解决了底物本底值高的问题，并且大幅度降低了检测成本。
2.本发明方法灵敏度高，用极低的酶浓度即可准确测得右旋糖酐酶的酶解初速度(本发明以37℃酶解30min为例，定量限为0.032mU/mL)，由于待测酶溶液的稀释倍数较高，酶溶液中的杂质，如牙膏、漱口液中的杂质对酶活力测定干扰较小，远优于DNS法(DNS法以37℃酶解30min为例，参考对比例中的四种DNS法，定量限为0.105-0.213mU/mL)，因此，特别适用于含酶量低的产品。
3.本发明方法与现有MBTH法(β-葡聚糖酶活力的测定方法)应用于右旋糖酐酶活力测定相比，获得的标准曲线截距更接近于坐标轴原点且显色产物更加稳定，从而提高了检测的灵敏度、准确性，为右旋糖酐酶活力的测定提供了更好的方法。
4.本发明方法操作简便，测定快速，可适用于大批量测定的高通量分析，同时可实现全自动化的工厂操作模式；
5.本发明为一种测定右旋糖酐酶活力的方法，不仅适用于酶制剂生产企业，同时将测定方法应用于含右旋糖酐酶的牙膏、漱口水，为牙膏、漱口水等含右旋糖酐酶抗龋齿产品提供了质量控制的方法。
附图说明
图1为底物(市售的普通级别的右旋糖酐)以实施例1-4的方法精制前后的右旋糖酐经MBTH反应后的本底值比较，1-6号分别为市售的不同厂家的右旋糖酐及右旋糖酐生产原料，其型号分别为70kDa、500kDa、200kDa、100kDa、70kDa以及医药级右旋糖酐生产原料，其浓度均为10mg/mL，以酶标板测定，本底值测定结果如下：
| 样品号 | 底物精制前 | 底物精制后 |
| 1 | 1.71 | 1.19 |
| 2 | 2.88 | 0.687 |
| 3 | 2.97 | 0.735 |
| 4 | 3.00 | 0.359 |
| 5 | 3.00 | 0.960 |
| 6 | 3.44 | 0.451 |
图2为醇沉后得到的精制底物的照片，左图为60％乙醇醇沉、离心后直接干燥所得底物为坚硬的凝胶固体，中图和右图分别为本发明经过60％乙醇醇沉和70％乙醇醇沉所得底物为松散固体，松散的固体有利于作为酶解底物配制溶液时易于溶解。
图3为不同配制方式所得相同浓度的底物溶液溶解情况，a为室温条件下直接溶解，溶液中含有大量不溶物；b为80℃加热1h溶解，溶液略显乳白色；c为本发明的底物溶解方式，先加碱溶，后用共轭酸调pH，溶液与b相比更加澄清透明。
图4为本发明碱溶后加共轭酸的溶解方式和80℃加热1h的溶解方式的酶质量浓度与吸光度的标准曲线，以酶标板测定，本发明在相同酶浓度下所对应的吸光度值较大，说明常规加热溶解底物使底物糊化微带乳白色，增加了底物溶液粘度，不利于酶解反应导致吸光度值偏低，说明本发明的底物溶解方式更有利于酶解反应。
图5为底物配制时间与储存方式以酶标板测定对葡萄糖标准曲线的斜率(上图)、截距(下图)的影响，现配现用所得葡萄糖标准曲线斜率最高、截距更接近于0。
图6为本发明方法与现有技术DNS法(DNS-1、DNS-2、DNS-3、DNS-4)的葡萄糖标准曲线比较图，以比色皿测定，其中DNS-1为文献(常国炜,黎志德,黄曾慰,等.右旋糖酐酶酶学特性及热失活动力学研究[J].中国调味品,2021,46(5):84-88)右旋糖酐酶活力测定的DNS法；DNS-2为文献(邢明霞,王鹏博,许文廷,等.动力学法优化碱性果胶酶比活的测定方法[J].食品工业科技,2020,41(23):223-228)碱性果胶酶活力测定的DNS法；DNS-3为中华人民共和国国家标准(饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法GB/T 23874-2009、饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度GB/T 36861-2018)木聚糖酶和β-甘露聚糖酶活力测定的DNS法；DNS-4为中华人民共和国国家标准(林业生物质原料分析方法纤维素酶活力测定GB/T35808-2018)纤维素酶活力测定的DNS法；本发明方法与四种现有DNS法测定的葡萄糖标准曲线相比，不仅斜率大而且经过原点，方法灵敏度和准确度更高。
图7为本发明向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂后，反应体系中OH-浓度对葡萄糖标准曲线斜率(上图)、截距(下图)的影响，以酶标板测定，OH-浓度在0.01-0.2mol/L范围内均可绘制葡萄糖标准曲线，测定右旋糖酐酶活力，其中OH-浓度在0.1-0.2mol/L范围内斜率最大且截距最接近于0。
图8为本发明向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂后，反应体系中MBTH的浓度对葡萄糖标准曲线斜率(上图)、截距(下图)的影响，以酶标板测定，MBTH的浓度在0.3-4.5mmol/L范围内均可绘制葡萄糖标准曲线，测定右旋糖酐酶活力，其中MBTH的浓度在0.95-3.6mmol/L范围内斜率最大且截距最接近于0，且时间稳定性最好。
图9为本发明MBTH试剂中DTT浓度对葡萄糖标准曲线的斜率(上图)、截距(下图)的影响，以酶标板测定，DTT的浓度在0-1.6mmol/L范围均可绘制葡萄糖标准曲线，测定右旋糖酐酶活力，其中，DTT浓度为0时，该斜率最大且截距最接近于0。
图10为本发明MBTH试剂中DTT浓度与使用MBTH法现有技术β-葡聚糖酶活力的测定方法(DTT浓度为1mg/mL)相比，本发明方法绘制的葡萄糖标准曲线的斜率更大且截距更接近于0。
图11为本发明加入酸性铁试剂后的反应体系中Fe3+的摩尔浓度对葡萄糖标准曲线斜率(上图)、截距(下图)的影响，以酶标板测定，Fe3+的摩尔浓度在1-6mmol/L范围内均可绘制葡萄糖标准曲线，测定右旋糖酐酶活力，其中Fe3+的摩尔浓度在3-5mmol/L范围内斜率最大且截距最接近于0，且时间稳定性最好。
图12为不同可溶性铁盐的葡萄糖标准曲线的斜率(上图)、截距(下图)随时间的变化。三种可溶性铁盐均可应用于右旋糖酐酶活力测定。
图13为本发明向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂后，在反应体系中OH-浓度为0.07、0.1mol/L的条件下，加入酸性铁试剂，体系中剩余H+的浓度对葡萄糖标准曲线斜率(上图)、截距(下图)的影响，以酶标板测定，H+的浓度为0.02-0.3mol/L范围内均可绘制葡萄糖标准曲线，测定右旋糖酐酶活力，在剩余H+的浓度达到0.06mol/L后，截距基本稳定，斜率在剩余H+的浓度为0.06-0.1mol/L范围内保持稳定。
图14为本发明酶标板吸光度值测定前振板与不振板的斜率(上图)、截距(下图)的影响，与不振板相比，振板后测定的斜率较大，截距更接近于0，时间稳定性更好。
图15为本发明酶标板吸光度值测定波长对葡萄糖标准曲线的的斜率(上图)、截距(下图)的影响，其中，波长在590nm和610nm时，该截距接近于0，优于使用β-葡聚糖酶活力的测定方法的波长650nm。
图16将牙膏稀释、研磨、离心(在4℃条件下以4000RCF离心10min)、取上清所得到的溶液。图中1、2、3号样品(与实施例3的样品对应)分别为来源于不同公司的牙膏产品。左图的浓度分别为0.2mg/mL、2mg/mL、20mg/mL，溶液均澄清透明，可用于MBTH法测定酶活力(参见实施例3)，但无法用于DNS法测定酶活力；右图的浓度分别为2mg/mL、20mg/mL、200mg/mL，1号溶液澄清透明，2号溶液未完全溶解，3号溶液为不溶性乳液，只有在该浓度条件下才能以用于DNS法测定酶活力(参见对比例4)。若采用其它提取方式，如过滤会直接堵滤孔，多次离心会增加操作误差，同时增加了提取时间很难保证酶从保护基质中提取出来不会失活，而本发明对低含酶量或酶活力低的样品仍可适用。
图17为在金属浴条件下酶解反应和MBTH反应同为55℃各30min所得到的酶质量浓度反应速率曲线，曲线呈线性，使用排枪加样，可用于全自动高通量测定。
图18为本发明MBTH法以酶标板测定右旋糖酐酶反应动力学曲线(上图，为零级反应)和酶质量浓度反应速率曲线(下图，该曲线呈线性)，不会因为稀释倍数的不同而影响测定的准确性。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例采用的主要仪器及试剂如下：
主要仪器：水浴恒温振荡器，SHZ-82型，常州智博瑞有限公司；FE2实验室pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；Bio-rad 680酶标仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计，SHIMADZU(岛津)；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；CT14RD离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司。
主要试剂：葡萄糖购自购自国药集团化学试剂有限公司；右旋糖酐70kDa购自国药集团化学试剂有限公司，右旋糖酐70kDa、100kDa、200kDa、500kDa购自西安欣禄生物科技优选公司，医药级右旋糖酐的生产原料购自陕西省微生物研究所；右旋糖酐酶购自中诺生物科技发展江苏有限公司；牙膏购自杭州白惜品牌管理有限公司，高露洁棕榄(中国)有限公司，康博士日化集团有限公司，杭州纳美智康科技有限公司，上海川美实业有限公司，日本狮王株式会社，薇美姿实业(广东)股份有限公司；漱口水购自杭州白惜品牌管理有限公司，康博士日化集团有限公司，日本狮王株式会社；3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐一水合物(MBTH)来自西格玛奥德里奇贸易有限公司；DL-二硫苏糖醇(DTT)来自西格玛奥德里奇贸易有限公司；氨基磺酸、FeNH4(SO4)2·12H2O、Fe(NO3)3·9H2O、FeCl3购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
酶活力按照如下公式计算：
式中：
U-右旋糖酐酶活力，μmoL/(mL·min)；
A-酶解液的吸光度值；
A0-酶解空白溶液的吸光度值；
b-葡萄糖标准曲线的截距；
k-葡萄糖标准曲线的斜率，mL/μmoL；
t-酶解时间，min。
实施例1-4的方法：
步骤(1)，将底物粉碎，使底物全部通过80目筛后，从中取1g底物于150mL 60％的乙醇中搅拌3h，4000RCF(6400rpm)离心15min，弃上清，加入25mL 95％乙醇，充分混匀，10min后再次加入相同体积95％的乙醇并重复此步骤共3次，3000RCF(5600rpm)离心15min，弃去上清液，再次加入25mL无水乙醇，3000RCF(5600rpm)离心15min，弃去上清液，向沉淀中加入50mL的丙酮，超声2min，静置1.5h，在高真空度的压力为-0.098MPa下35℃减压旋蒸至样品干燥，得到精制底物。
步骤(2)，向处理好的0.1g精制底物中加入0.4mol/L的NaOH溶液4mL，搅拌溶解底物，加入0.2mol/L的丁二酸溶液4mL，混匀，继续向底物溶液中加入0.1mol/L的丁二酸溶液调pH至5.5，补加0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制成浓度为10mg/mL的右旋糖酐溶液，该溶液现配现用；向0.1g右旋糖酐酶中加入pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制右旋糖酐酶溶液。
步骤(3)，取步骤(2)中的右旋糖酐溶液与0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液等体积混合，配制浓度为0-100μg/mL(0-0.5mmol/L)的葡萄糖标准溶液。分别向1mL上述不同浓度的葡萄糖标准溶液中加入1mL 0.5mol/L的NaOH溶液，混匀，再加入1mL新鲜配制的1.5mg/mL(6.4mmol/L)的MBTH溶液，此时反应体系中OH-的浓度为0.17mol/L，MBTH的初始浓度为2.1mmol/L。于80℃水浴加热13min后，趁热加入2mL硝酸铁试剂(由终浓度为10mmol/L的硝酸铁，0.05mol/L氨基磺酸，0.45mol/L盐酸组成)，此时体系变成酸性，反应体系中H+浓度为0.1mol/L，Fe3+的初始浓度为4mmol/L，室温冷却后显色50min，从中取200μL于酶标板上，振板后使用酶标仪于波长590nm处测定葡萄糖的吸光度值，每个浓度做三个平行样，根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应葡萄糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。
步骤(4)，将0.5mL待测右旋糖酐酶溶液(用0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液)加入到试管中于水浴摇床中预热5min，加入0.5mL预热至相应温度的步骤(2)中的10mg/mL的右旋糖酐底物溶液进行酶解反应，酶解时间为30min，迅速加入1mL 0.5mol/L的NaOH溶液，并立即充分混匀，终止酶反应，得到碱性酶解液。
步骤(5)，将0.5mL的右旋糖酐酶溶液加入到试管中于水浴摇床中预热5min，再继续保温30min，迅速加入1mL 0.5mol/L的NaOH溶液于试管中，并立即充分混匀，补加0.5mL与步骤(4)相同的经过预热的右旋糖酐溶液，充分混匀，得到酶解空白。
步骤(6)，向步骤(4)中的碱性酶解液和步骤(5)中的酶解空白，加入与步骤(3)中相同的MBTH溶液1mL，于80℃水浴加热13min后，趁热加入与步骤(3)相同的硝酸铁试剂2mL，室温冷却50min后从中各取200μL于酶标板上，振板后在波长590nm处测定吸光度值。
步骤(7)，将步骤(6)中测得的吸光度值带入步骤(3)中的标准对应关系曲线中，分别获得相当于葡萄糖浓度的碱性酶解液和酶解空白的还原糖浓度，从而计算出单位时间内还原糖浓度的增加值，进而计算出右旋糖酐酶活力。右旋糖酐酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于葡萄糖的量为一个酶活力单位。
实施例1：
采用实施例1-4的方法中步骤(1)-(7)，在55℃下酶解。
表1实施例1右旋糖酐酶活力测定结果
实施例2：
采用实施例1-4的方法中步骤(1)-(7)，在37℃下酶解。
表2实施例2右旋糖酐酶活力测定结果
实施例1-2表明，右旋糖酐酶活力可在37-55℃的范围内被准确测定。
实施例3：
选取三种市售的右旋糖酐酶含量高、中、低的牙膏，使用本发明测定酶活力。
分别精密称取高、中、低右旋糖酐酶含量的牙膏0.1g、0.2g、2g，加入10mL缓冲溶液，用组织匀浆器粉碎，于4℃、4000RCF(6400rpm)离心10min，弃下层沉淀，取上清液备用，重复上述步骤三次，将上清液配制浓度为0.4mg/mL、4mg/mL、40mg/mL的牙膏溶液。
采用实施例1-4的方法中步骤(1)-(7)，在37℃下酶解。
表3实施例3牙膏中右旋糖酐酶活力测定结果
实施例3表明，对于市售的牙膏，无论含右旋糖酐酶量高或低，本发明在人体温度37℃的条件下均可测定。
实施例4：
精密称取0.1g漱口水，一次性加入0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液，充分搅拌，配制浓度为0.4mg/mL的漱口水溶液。
采用实施例1-4的方法中步骤(1)-(7)，在37℃下酶解。
表4实施例4漱口水中右旋糖酐酶活力测定结果
实施例4表明，对于市售的漱口水，本发明在人体温度37℃的条件下，能够准确测定右旋糖酐酶活力。
实施例5：
步骤(1)，将底物粉碎，使底物全部通过60目筛后，从中取1g底物于170mL 35％的乙醇中搅拌5h，2500RCF(5100rpm)离心20min，弃上清，加入25mL 80％乙醇，充分混匀，10min后再次加入相同体积80％的乙醇并重复此步骤共5次，4000RCF(6400rpm)离心10min，弃去上清液，再次加入25mL无水乙醇，4000RCF(6400rpm)离心20min，弃去上清液，向沉淀中加入100mL的丙酮，超声1min，静置1h，在高真空度的压力为-0.093MPa下40℃减压旋蒸至样品干燥，得到精制底物。
步骤(2)，向处理好的0.1g精制底物中加入0.1mol/L的KOH溶液4mL，搅拌溶解底物，加入0.1mol/L的乙酸溶液4mL，混匀，继续向底物溶液中加入0.05mol/L的乙酸溶液调pH至5.5，补加0.05mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，配制成浓度为2mg/mL的右旋糖酐溶液，该溶液现配现用；向0.1g右旋糖酐酶中加入pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制浓度为0.2μg/mL右旋糖酐酶溶液。
步骤(3)，取步骤(2)中的右旋糖酐溶液与0.05mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液等体积混合，配制浓度为0-100μg/mL(0-0.5mmol/L)的葡萄糖标准溶液。分别向1mL上述不同浓度的葡萄糖标准溶液中加入1mL 0.06mol/L的NaOH溶液，混匀，再加入1mL新鲜配制的3.2mg/mL(13.5mmol/L)的MBTH溶液，此时反应体系中OH-的浓度为0.02mol/L，MBTH的初始浓度为4.5mmol/L。于100℃水浴加热5min后，趁热加入2mL硫酸铁铵试剂(由终浓度为2.5mmol/L的硫酸铁铵，0.1mol/L氨基磺酸组成)，此时体系变成酸性，反应体系中H+浓度为0.03mol/L，Fe3+的初始浓度为1mmol/L，室温冷却后显色70min，从中取200μL于酶标板上，振板后使用酶标仪于波长610nm处测定葡萄糖的吸光度值，每个浓度做三个平行样，根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应葡萄糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。
步骤(4)，将0.5mL待测右旋糖酐酶溶液(用0.05mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液)加入到试管中于30℃水浴摇床中预热5min，加入0.5mL预热至相应温度的步骤(2)中的0.1mg/mL的右旋糖酐底物溶液进行酶解反应，酶解时间为20min，迅速加入1mL0.06mol/L的NaOH溶液，并立即充分混匀，终止酶反应，得到碱性酶解液。
步骤(5)，将0.5mL的右旋糖酐酶溶液加入到试管中于水浴摇床中预热5min，再继续保温20min，迅速加入1mL 0.06mol/L的NaOH溶液于试管中，并立即充分混匀，补加0.5mL与步骤(4)相同的经过预热的右旋糖酐溶液，充分混匀，得到酶解空白。
步骤(6)，向步骤(4)中的碱性酶解液和步骤(5)中的酶解空白，加入与步骤(3)中相同的MBTH溶液1mL，于100℃水浴加热5min后，趁热加入与步骤(3)相同的硝酸铁试剂2mL，室温冷却70min后从中各取200μL于酶标板上，振板后在波长610nm处测定吸光度值。
步骤(7)，将步骤(6)中测得的吸光度值带入步骤(3)中的标准对应关系曲线中，分别获得相当于葡萄糖浓度的碱性酶解液和酶解空白的还原糖浓度，从而计算出单位时间内还原糖浓度的增加值，进而计算出右旋糖酐酶活力。右旋糖酐酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于葡萄糖的量为一个酶活力单位。
表5实施例5右旋糖酐酶活力测定结果
| 平行样 | 1 | 2 |
| 反应体系中酶浓度(μg/mL) | 0.10 | 0.10 |
| 酶解液与酶解空白溶液吸光度之差 | 0.151 | 0.152 |
| 酶解产生的还原端基的浓度(μmol/mL) | 0.0864 | 0.0871 |
| 酶活力(U/mg) | 43.2 | 43.5 |
实施例6：
步骤(1)，将底物粉碎，使底物全部通过60目筛后，从中取1g底物于130mL 70％的乙醇中搅拌3h，2500RCF(5100rpm)离心10min，弃上清，加入20mL无水乙醇，充分混匀，10min后再次加入相同体积的无水乙醇并重复此步骤共2次，4000RCF(6400rpm)离心5min，弃去上清液，再次加入20mL无水乙醇，4000RCF(6400rpm)离心5min，弃去上清液，向沉淀中加入40mL的丙酮，超声2min，静置2h，在高真空度的压力为-0.09MPa下25℃减压旋蒸至样品干燥，得到精制底物。
步骤(2)，向处理好的0.1g精制底物中加入1mol/L的NaOH溶液1mL，搅拌溶解底物，加入1mol/L的乙酸溶液1mL，再加入水稀释至20mL,混匀，继续向底物溶液中加入0.1mol/L的乙酸溶液调pH至5.5，补加0.1mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容，配制成浓度为10mg/mL的右旋糖酐溶液，该溶液现配现用；向0.3g右旋糖酐酶中加入pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制浓度为0.3μg/mL右旋糖酐酶溶液。
步骤(3)，取步骤(2)中的右旋糖酐溶液与0.1mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液等体积混合，配制浓度为0-100μg/mL(0-0.5mmol/L)的葡萄糖标准溶液。分别向1mL上述不同浓度的葡萄糖标准溶液中加入1mL 0.6mol/L的KOH溶液，混匀，再加入1mL新鲜配制的0.2mg/mL(0.9mmol/L)的MBTH溶液，此时反应体系中OH-的浓度为0.2mol/L，MBTH的初始浓度为0.3mmol/L。于50℃水浴加热120min后，趁热加入2mL硫酸铁铵试剂(由终浓度为15mmol/L的氯化铁，0.42mol/L硫酸组成)，此时体系变成酸性，反应体系中H+浓度为0.05mol/L，Fe3+的初始浓度为6mmol/L，室温冷却后显色180min，从中取200μL于酶标板上，振板后使用酶标仪于波长590nm处测定葡萄糖的吸光度值，每个浓度做三个平行样，根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应葡萄糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。
步骤(4)，将0.5mL待测右旋糖酐酶溶液(用0.1mol/L，pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液)加入到试管中于60℃水浴摇床中预热5min，加入0.5mL预热至相应温度的步骤(2)中的10mg/mL的右旋糖酐底物溶液进行酶解反应，酶解时间为30min，迅速加入1mL 0.6mol/L的KOH溶液，并立即充分混匀，终止酶反应，得到碱性酶解液。
步骤(5)，将0.5mL的右旋糖酐酶溶液加入到试管中于水浴摇床中预热5min，再继续保温30min，迅速加入1mL 0.06mol/L的KOH溶液于试管中，并立即充分混匀，补加0.5mL与步骤(4)相同的经过预热的右旋糖酐溶液，充分混匀，得到酶解空白。
步骤(6)，向步骤(4)中的碱性酶解液和步骤(5)中的酶解空白，加入与步骤(3)中相同的MBTH溶液1mL，于50℃水浴加热120min后，趁热加入与步骤(3)相同的氯化铁试剂2mL，室温冷却180min后从中各取200μL于酶标板上，振板后在波长590nm处测定吸光度值。
步骤(7)，将步骤(6)中测得的吸光度值带入步骤(3)中的标准对应关系曲线中，分别获得相当于葡萄糖浓度的碱性酶解液和酶解空白的还原糖浓度，从而计算出单位时间内还原糖浓度的增加值，进而计算出右旋糖酐酶活力。右旋糖酐酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于葡萄糖的量为一个酶活力单位。
表6实施例6右旋糖酐酶活力测定结果
| 平行样 | 1 | 2 |
| 反应体系中酶浓度(μg/mL) | 0.15 | 0.15 |
| 酶解液与酶解空白溶液吸光度之差 | 0.141 | 0.142 |
| 酶解产生的还原端基的浓度(μmol/mL) | 0.255 | 0.257 |
| 酶活力(U/mg) | 56.7 | 57.1 |
实施例7：
步骤(1)，将底物粉碎，使底物全部通过100目筛后，从中取1g底物于160mL 70％
的乙醇中搅拌4h，4000RCF(6400rpm)离心5min，弃上清，加入25mL 90％乙醇，充分混匀，10min后再次加入相同体积90％的乙醇并重复此步骤共5次，4000RCF(6400rpm)离心10min，弃去上清液，再次加入25mL无水乙醇，4000RCF(6400rpm)离心10min，弃去上清液，向沉淀中加入60mL的丙酮，超声5min，静置2h，在高真空度的压力为-0.095MPa下30℃减压旋蒸至样品干燥，得到精制底物。
步骤(2)，向处理好的0.1g精制底物中加入0.4mol/L的NaOH溶液4mL，搅拌溶解底物，加入0.2mol/L的丁二酸溶液4mL，混匀，继续向底物溶液中加入0.1mol/L的丁二酸溶液调pH至5.5，补加0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制成浓度为4mg/mL的右旋糖酐溶液，该溶液现配现用；向0.1g右旋糖酐酶中加入pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液定容，配制浓度为0.1μg/mL右旋糖酐酶溶液。
步骤(3)，取步骤(2)中的右旋糖酐溶液与0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液等体积混合，配制浓度为0-100μg/mL(0-0.5mmol/L)的葡萄糖标准溶液。分别向1mL上述不同浓度的葡萄糖标准溶液中加入1mL 0.5mol/L的NaOH溶液，混匀，再加入1mL新鲜配制的1.8mg/mL(10.8mmol/L)的MBTH溶液，此时反应体系中OH-的浓度为0.17mol/L，MBTH的初始浓度为3.6mmol/L。于80℃水浴加热13min后，趁热加入2mL硫酸铁铵试剂(由终浓度为7.5mmol/L的硫酸铁铵，0.55mol/L盐酸组成)，此时体系变成酸性，反应体系中H+浓度为0.1mol/L，Fe3+的初始浓度为3mmol/L，室温冷却后显色50min，从中取200μL于酶标板上，振板后使用酶标仪于波长590nm处测定葡萄糖的吸光度值，每个浓度做三个平行样，根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应葡萄糖吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。
步骤(4)，将0.5mL待测右旋糖酐酶溶液(用0.1mol/L，pH为5.5的丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液)加入到试管中于37℃水浴摇床中预热5min，加入0.5mL预热至相应温度的步骤(2)中的5mg/mL的右旋糖酐底物溶液进行酶解反应，酶解时间为60min，迅速加入1mL0.5mol/L的NaOH溶液，并立即充分混匀，终止酶反应，得到碱性酶解液。
步骤(5)，将0.5mL的右旋糖酐酶溶液加入到试管中于水浴摇床中预热5min，再继续保温60min，迅速加入1mL 0.5mol/L的NaOH溶液于试管中，并立即充分混匀，补加0.5mL与步骤(4)相同的经过预热的右旋糖酐溶液，充分混匀，得到酶解空白。
步骤(6)，向步骤(4)中的碱性酶解液和步骤(5)中的酶解空白，加入与步骤(3)中相同的MBTH溶液1mL，于80℃水浴加热13min后，趁热加入与步骤(3)相同的硝酸铁试剂2mL，室温冷却50min后从中各取200μL于酶标板上，振板后在波长590nm处测定吸光度值。
步骤(7)，将步骤(6)中测得的吸光度值带入步骤(3)中的标准对应关系曲线中，分别获得相当于葡萄糖浓度的碱性酶解液和酶解空白的还原糖浓度，从而计算出单位时间内还原糖浓度的增加值，进而计算出右旋糖酐酶活力。右旋糖酐酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应液中，每分钟产生1μmol相当于葡萄糖的量为一个酶活力单位。
表7实施例7右旋糖酐酶活力测定结果
| 平行样 | 1 | 2 |
| 反应体系中酶浓度(μg/mL) | 0.05 | 0.05 |
| 酶解液与酶解空白溶液吸光度之差 | 0.463 | 0.465 |
| 酶解产生的还原端基的浓度(μmol/mL) | 0.139 | 0.140 |
| 酶活力(U/mg) | 46.4 | 46.6 |
对比例1(相较于实施例1)：
采用β-葡聚糖酶活力的测定方法，在55℃下酶解。
表8对比例1右旋糖酐酶活力测定结果
通过实施例1与对比例1的对比可以看出，DTT浓度为0，测定波长590nm，测定前振板减小表面张力时，萄糖标准曲线的斜率最大且截距最接近于0，时间稳定性好(参见图7、图8、图9)，因此，本发明的测定方法的准确度更高。
对比例2-4使用的DNS法：
DNS-1：常国炜,黎志德,黄曾慰,等.右旋糖酐酶酶学特性及热失活动力学研究[J].中国调味品,2021,46(5):84-88；
DNS-2：邢明霞,王鹏博,许文廷,等.动力学法优化碱性果胶酶比活的测定方法[J].食品工业科技,2020,41(23):223-228，235；
DNS-3：GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法、GB/T36861-2018饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度；
DNS-4：GB/T 35808-2018林业生物质原料分析方法纤维素酶活力测定。
表9四种DNS方法
对比例2(相较于实施例1)：
采用DNS-1、DNS-2、DNS-3、DNS-4的方法，底物处理、溶液配制酶解过程根据实施例方法在55℃下酶解。
表10对比例2右旋糖酐酶活力测定结果
对比例3(相较于实施例2)：
采用DNS-1、DNS-2、DNS-3、DNS-4的方法，底物处理、溶液配制酶解过程根据实施例方法在37℃下酶解。
表11对比例3右旋糖酐酶活力测定结果
通过对比例2-3与实施例1-2的实验数据对比表明，右旋糖酐酶在37-55℃的范围使用本发明在不同酶浓度下测定时，酶活力数据相对标准偏差较小，测定时不会因配制的酶浓度不同产生不同的实验结果，且测定时酶用量小，更加节约成本。
对比例4(相较于实施例3)：
选取三种市售的右旋糖酐酶含量高、中、低的牙膏，使用本发明测定酶活力。
分别精密称取高、中、低右旋糖酐酶含量的牙膏1g、2g、20g，加入10mL缓冲溶液，用组织匀浆器粉碎，于4℃、4000RCF(6400rpm)离心10min，弃下层沉淀，取上清液备用，重复上述步骤三次，将上清液配制浓度为4mg/mL、40mg/mL、400mg/mL的供试品溶液。
采用DNS-1、DNS-2、DNS-3、DNS-4的方法，底物处理、溶液配制酶解过程根据实施例方法在37℃下酶解。
表12对比例4牙膏中右旋糖酐酶活力测定结果
通过对比例4与实施例3的实验数据对比表明，对于市售的含右旋糖酐酶量低的牙膏，本发明在能够准确测定酶活力，而DNS法因灵敏度低无法获得能用于酶活力测定的酶溶液(参见附图10)；相比于DNS法，本发明能够使用少量样品进行测定，不会因样品量大增加提取的酶溶液中牙膏基质的浓度而对测定结果产生干扰。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)精制底物：
a.将右旋糖酐粉碎，制成右旋糖酐粉末；
b.将右旋糖酐粉末分散于35％-70％的乙醇溶液中，充分搅拌，离心，弃去上清液，可重复该步骤数次，将右旋糖酐粉末中的小分子物质除去；
c.采用浓度递增的乙醇溶液对步骤b得到的沉淀进行逐级脱水，所采用的乙醇溶液的浓度为80％-100％；
d.将丙酮加入到步骤c得到的沉淀中，超声后静置，在高真空度条件下减压旋蒸，得到干燥的精制底物，所述的高真空度是指其压力≤-0.089MPa；
如果右旋糖酐的重均分子量≥70kDa且最小分子量大于10kDa，则可直接作为精制底物使用，省略上述精制步骤；
(2)配制底物溶液及右旋糖酐酶溶液：将步骤(1)的精制底物加入到浓度为0.1-1mol/L强碱溶液中，充分混匀使其溶解，加入酸调pH至待测pH值，用待测pH值的缓冲溶液定容，从而得到底物溶液；用同一所述缓冲溶液配制右旋糖酐酶溶液；
(3)绘制葡萄糖吸光度值与葡萄糖浓度的标准对应关系曲线：
用步骤(2)配制的底物溶液，配制一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液，所述一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液中的底物的浓度相同，并且葡萄糖浓度范围在0-0.5mmol/L；
向所述一系列浓度梯度的葡萄糖标准溶液中加入碱性试剂得到碱性葡萄糖标准溶液，所述碱性葡萄糖标准溶液中的碱性试剂的浓度相同，加入新鲜配制的MBTH试剂，体系中OH-浓度在0.01-0.2mol/L范围内，MBTH的初始浓度范围为0.3-4.5mmol/L，DTT的初始浓度范围为0-1.6mmol/L，在50-100℃条件下反应5-180min，再加入酸性铁试剂，反应体系变成酸性，体系中其H+浓度为0.02-0.3mol/L，Fe3+的初始浓度范围为1-6mmol/L，发生显色反应，显色稳定后在580-680nm波长下测定吸光度值，根据每组葡萄糖浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；
所述的MBTH试剂是由MBTH和DTT配制而成的水溶液，或者只由MBTH配制而成的水溶液；所述的酸性铁试剂是由可溶性Fe3+盐和强酸配制而成的水溶液；
(4)右旋糖酐酶的酶解反应：向右旋糖酐酶溶液中加入步骤(2)配制的底物溶液，保证所得溶液中底物的浓度与步骤(2)葡萄糖标准溶液中底物的浓度相同，然后进行酶解反应，再加入碱性试剂，终止酶解反应，得到碱性酶解液，所述碱性酶解液中碱性试剂的浓度与步骤(2)碱性葡萄糖标准溶液中碱性试剂的浓度相同；
(5)制备碱性酶解空白溶液；
(6)测定碱性酶解液和碱性酶解空白溶液：参照步骤(3)的方法进行MBTH反应，测定步骤(4)得到的碱性酶解液和步骤(5)得到的碱性酶解空白溶液的吸光度值，从而获得酶解产生的还原端基浓度，进而得到右旋糖酐酶活力。
2.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述步骤(1)以2500-4000RCF离心，离心时间5-20min；步骤b中，加入60％-70％乙醇，步骤c中，加入90％-100％乙醇，步骤d中，高真空度的压力范围为-0.09MPa--0.098MPa，维持旋蒸温度在25-40℃范围内。
3.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，步骤(2)中的强碱溶液、步骤(3)中的碱性试剂为NaOH溶液或KOH溶液。
4.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述待测测pH值的缓冲溶液为丁二酸-丁二酸钠缓冲溶液或乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述步骤(3)酸性铁试剂中的可溶性Fe3+盐为硝酸铁、氯化铁、硫酸铁铵中的至少一种，强酸为氨基磺酸、硫酸及盐酸中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，向碱性葡萄糖标准溶液中加入新鲜配制的MBTH试剂后，体系中OH-浓度范围为0.1-0.2mol/L，MBTH的初始浓度范围为0.95-3.6mmol/L，DTT的初始浓度为0mmol/L；
再加入酸性铁试剂后，体系中H+浓度范围为0.06-0.1mol/L，Fe3+的初始浓度范围为3-5mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述步骤(3)葡萄糖与MBTH反应时间为5-120min。
8.根据权利要求1所述的一种测定右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，所述步骤(3)加入酸性铁试剂后的显色时间为50-180min，在该显色时间内于590-650nm下测定吸光度值。
9.测定牙膏中右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，首先处理样品，使其所含有的右旋糖酐酶在可定量测定的范围内，然后根据权利要求1的方法测定其酶活力，具体方法如下：
将精密称取的牙膏样品，用缓冲溶液转移到组织匀浆器中，精细研磨，将该混合液转移至离心管中，在确保酶不失活的温度条件下离心，将上清液定容，配制成相当于牙膏浓度为0.1-100mg/mL的溶液，作为待测酶溶液。
10.测定漱口水中右旋糖酐酶活力的方法，其特征在于，首先处理样品，使其所含有的右旋糖酐酶在可定量测定的范围内，然后根据权利要求1的方法测定其酶活力，具体方法如下：
精密称取一定量的漱口水，一次性加入大量的缓冲溶液，配制浓度为0.1-100mg/mL的漱口水溶液，该漱口水溶液即可作为右旋糖酐酶溶液用于酶活力测定。
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