CN109731030B

CN109731030B - 一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法

Info

Publication number: CN109731030B
Application number: CN201910205133.5A
Authority: CN
Inventors: 董乐; 王文贤; 戴聪杰; 王芳
Original assignee: Quanzhou Normal University
Current assignee: Quanzhou Normal University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109731030A

Abstract

本发明公开一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法，该方法将红花羊蹄甲花65℃下干燥，粉碎过80目筛。称取红红花羊蹄甲花花粉，质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟得到红花羊蹄甲花原花青素提取液。将足量预处理过的AB‑8大孔树脂和红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB‑8大孔树脂分别用浓度为20%、50%、100%的乙醇依次进行洗脱。获得纯化的原花青素组分PC1、PC2、PC3。利用本发明方法制备的红花羊蹄甲花原花青素的抗氧化活性高、纯度高，且本发明补足了现有技术中关于红花羊蹄甲花制备原花青素的研究空白。

Description

一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法

技术领域

本发明涉及植物有效成分精制加工技术领域，具体是一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法。

背景技术

原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC，是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，具有极强的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷酸、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；是强有力的金属螯合剂，可螯合金属离子，在体内形成惰性化合物；保护和稳定维生素C，有助于维生素C的吸收和利用。原花青素分布广泛，存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中，种类丰富。是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，一般为红棕色粉末，溶于水和大多有机溶剂。

红花羊蹄甲（Bauhinia blakeana Dunn），别名洋紫荆、玲甲花，为豆科、羊蹄甲属乔木或直立灌木植物喜阳光和温暖、潮湿环境，不耐寒。树皮厚，近光滑，灰色至暗褐色。主要分布在中国南部，中南半岛、印度、斯里兰卡也有分布，是很好的园林绿化树种，常作行道树植路边。羊蹄甲以根、树皮，叶及花入药，根、树皮全年可采，叶及花夏季采，晒干，具有健脾燥湿、消炎止血等功效。

甲醇提取的红花羊蹄甲花原花青素含有蛋白质、黄酮类化合物、多糖等杂质，可利用大孔树脂进行吸附纯化，提高红花羊蹄甲花原花青素的含量和纯度。本发明采取超声波辅助甲醇提取法对红花羊蹄甲花原花青素进行提取，利用大孔树脂AB-8进行吸附纯化，对红花羊蹄甲花原花青素进行了清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法，该原花青素具有良好的DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种红花羊蹄甲花抗氧化原花青素的制备方法，包括以下步骤：（1）红花羊蹄甲花花粉制备；（2）红花羊蹄甲花原花青素提取；（3）红花羊蹄甲花原花青素的纯化；（4）红花羊蹄甲花原花青素的冷冻干燥。

所述步骤（1）中红花羊蹄甲花花粉的具体制备方法为：将红花羊蹄甲花挑选去除杂物，于65℃下干燥12小时，然后经高速粉碎机粉碎，过80目筛，装袋备用。

所述步骤（2）中红花羊蹄甲花原花青素提取的具体方法为：称取红花羊蹄甲花干燥粉，按照质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟，4000r/min离心20min，取上清液即为红花羊蹄甲花原花青素提取液。

所述步骤（3）红花羊蹄甲花原花青素的分离纯化的具体方法为：将足量预处理过的AB-8大孔树脂和红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB-8大孔树脂分别用浓度为20%v/v、50%v/v、100%v/v的乙醇依次进行洗脱。获得纯化的原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC组分PC1、PC2、PC3。

本发明的优点在于：

本发明采用超声辅助甲醇提取红花羊蹄甲花原花青素，选取AB-8大孔树脂对原花青素进行吸附，采用乙醇等梯度洗脱对原花青素进行纯化，获得的原花青素纯度高，安全性高。对获得的红花羊蹄甲花原花青素进行了清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定。

具体实施方式

下面根据优选实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明白。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例 1

1将红花羊蹄甲花挑选去除杂物，于65℃下干燥12小时，然后经高速粉碎机粉碎，过80目筛，装袋备用。

1.1红花羊蹄甲花花粉水分含量的测定

称量1.1124g干燥红花羊蹄甲花粉，烘至恒重，测得1.0515g。计算红花羊蹄甲花花粉水分含量值为5.47%。

2称取红花羊蹄甲花干燥粉，按照质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟，4000r/min离心20min，取上清液即为红花羊蹄甲花原花青素提取液。

2.1原花青素标准曲线的制作

取原花青素标准品10.000mg，用甲醇溶解，定容至25ml。准备6支10ml比色管，分别加入原花青素标准品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，再加入4wt%香草醛甲醇溶液3ml和浓盐酸1.5ml，用甲醇定容摇匀，显色20min后，以无水乙醇做参比，在波长为518nm处测定相应吸光值。以原花青素标准品的量为横坐标，以对应的吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

曲线方程：y = 0.7310x – 0.0014，R² = 0.9986

2.2红花羊蹄甲花原花青素含量的测定

取样液1ml加入10ml比色管，再加入4wt%香草醛甲醇溶液3ml和浓盐酸1.5ml，摇匀，用甲醇定容，以无水乙醇做参比，在波长为518nm处测定相应吸光值，代入标准曲线算出红花羊蹄甲花原花青素的含量为6.452mg/g。

采用静态吸附法，将用常规方法（乙醇浸泡24h→用乙醇洗至流出液与水1：5不浑浊→用水洗至无醇味→5%HCl浸泡2-4h→水洗至中性→2%NaOH浸泡2-4h→水洗至中性）预处理过的AB-8大孔树脂与红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，使提取液刚好浸没树脂，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB-8大孔树脂分别用浓度为20%、50%、100%的乙醇依次进行洗脱。获得纯化的原花青素（proantho Cyanidin，PC）简称PC组分PC1、PC2、PC3。分别对PC1、PC2、PC3三个组分冷冻干燥。

实施例2

1红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除DPPH自由基

样品组：在试管中加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液，3mL的不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，充分混匀，暗处放置30min后，以95%的乙醇作参比在517nm波长处测定吸光值Ai。

对照组：在试管中加入2mL 95%的乙醇，3mL的不同浓度红花羊蹄甲花提取液，以相同条件处理后测定其吸光值 Ax。

空白组：在试管中加入2mL 0.2mmol/L DPPH溶液，3mL 95%的乙醇，以相同条件处理后测定其吸光值 Ao。

2红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除羟自由基

在试管中加入1ml蒸馏水，1mL 0.75mmol/L FeSO₄溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml双氧水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值Ap。

在试管中加入1ml蒸馏水，1mL 0.75mmol/L FeSO₄溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml蒸馏水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值Ab。

在试管中加入1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，1mL 0.75mmol/L FeSO₄溶液，1ml 0.75mmol/L 邻二氮菲，2mL 0.2mol/L pH7.4的PBS溶液，混匀，再加入1ml双氧水，37℃水浴60min，冷却至室温，以蒸馏水作为参比，在536nm波长下测其吸光度值As。

3红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除超氧阴离子自由基

调零组：在试管中加入2.4ml的PBS溶液，1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，0.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min。

空白组：在试管中加入1.5ml，0.05mol/L pH7.8的PBS溶液，0.3ml，6.4mol/L的Met溶液，0.3ml 0.03mmol/L的核黄素溶液，1.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min，以调零组做参比在560nm波长处测定吸光值Ao。

样品组：在试管中加入1.5ml，0.05mol/L pH7.8的PBS溶液，0.3ml，6.4mol/L的Met溶液，0.3ml，0.03mmol/L的核黄素溶液，1ml不同浓度的红花羊蹄甲花提取液，0.6ml去离子水，在40W日光灯箱中照射20min，以调零组做参比在560nm波长处测定吸光值Ai。

清除率（%）=（Ao—Ai）/ Ao×100%

对获得的红花羊蹄甲花原花青素及纯化组分PC1、PC2、PC3进行清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的测定结果以IC₅₀值（μg/mL）表示见表1。

表1清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基

*在所配制样品浓度下清除率不到50%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种红花羊蹄甲花原花青素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）红花羊蹄甲花花粉制备；（2）红花羊蹄甲花原花青素提取；（3）红花羊蹄甲花原花青素的纯化；（4）红花羊蹄甲花原花青素的冷冻干燥；

所述步骤（1）中红花羊蹄甲花花粉的具体制备方法为：将红花羊蹄甲花挑选去除杂物，于65℃下干燥12小时，然后经高速粉碎机粉碎，过80目筛，装袋备用；

所述步骤（2）中红花羊蹄甲花原花青素提取的具体方法为：称取红花羊蹄甲花干燥粉，按照质量体积比1:10的比例加入甲醇，于超声功率480w超声辅助提取20分钟，再50℃恒温浸提50分钟，4000r/min离心20min，取上清液即为红花羊蹄甲花原花青素提取液；

所述步骤（3）红花羊蹄甲花原花青素的分离纯化的具体方法为：将足量预处理过的AB-8大孔树脂和红花羊蹄甲花原花青素提取液混合均匀，振荡吸附24小时，滤掉液体的AB-8大孔树脂分别用浓度为20%v/v、50%v/v、100%v/v的乙醇依次进行洗脱；获得纯化的原花青素组分PC1、PC2、PC3。