CN109701035A - 一种新型乳腺癌分子诊断的荧光双亲肽自组装纳米胶束的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束，及其在乳腺癌荧光成像、光动力治疗与光热治疗中的应用。基于靶向复合双亲肽纳米胶束良好的生物相容性、包载物质的荧光成像、光动力治疗与光热治疗功能，有望在体内标记与示踪、生物医学影像和肿瘤的早期诊断与治疗等领域得到广泛应用，在生命健康与个性化医疗等方面产生良好的经济与社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型靶向整合素αvβ3的新型双亲肽自组装胶 束的制备工艺，及其特异性靶向乳腺癌整合素αvβ3的荧光成像和作 为潜在光动力与光热治疗剂的生物医学应用。
背景技术
荧光成像在生物检测和医学影像等领域广泛应用，是一种常见的 光学成像技术，样品具有极高的穿透性、灵敏度和选择性等优势，但 传统的有机染料同时存在一些致命缺陷，如性质不稳定，容易被光漂 白，不能长期使用等。因此，如何克服荧光染料在使用中的缺陷成为 当前研究的重点。
双亲肽具有类似天然磷脂分子的两亲特性、丰富的分子结构、独 特新颖的组装体结构以及特殊的生物学功能,是多肽自组装研究的 热点领域。两亲性多肽分子结构具有类似于表面活性剂的疏水链段和 亲水端,在疏水性链段间的疏水性作用力和亲水性多肽链段间的氢键 协同驱动下,多肽分子能够自组装形成规整有序的纳米/微米结构。
双亲肽所具有的脂肪族疏水尾通过疏水作用形成疏水性内核，可 包裹疏水性材料，亲水头具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽 序列，能特异性识别肿瘤细胞中高表达的整合素αvβ3。多肽作为天 然的优良组装分子,具有特殊的生物活性和良好的生物相容性,能够 赋予材料独特的生物学功能，易于合成和化学修饰也是多肽分子的突 出优势。同时，双亲肽对PH高敏感，当PH值小于4时，自组装成 球性纳米胶束的双亲肽会发生降解形成单个多肽序列。细胞经过吞饮 与受体内吞作用摄取复合双亲肽纳米胶束进入细胞后，酸性环境的溶 酶体视之为异物从而使之解体，复合双亲肽纳米胶束对PH高敏感性 有利于胶束内所包裹的活性物质在细胞内的释放。
随着纳米技术的不断发展，将纳米技术与高灵敏度的荧光分子相 结合，发展制备包载荧光分子的分子影像探针，将为克服上述问题提 供新的策略。近年来双亲肽纳米胶束以其毒性低、生物兼容性好、特 殊生物活性等优点日益受到关注。研究发现，荧光小分子经过双亲肽 纳米胶束包载后其荧光稳定性和结构稳定性都会有明显的提升。当荧 光双亲肽纳米探针表面RGD多肽配体特异性作用于病变区域高表达 的配体时，可通过所包裹的荧光探针来突出显示病变部位，从而提高 诊断的准确性与敏感性，这种靶向造影剂成为现今研究领域的热点。 整合素αVβ3是肿瘤组织最常用的靶标之一，它由αV亚基(CD51， 150000)和β3亚基(CD61，105000)组成，其中α链的胞膜外区能 特异性识别含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的多肽，介导整 合素与细胞外基质的黏附。整合素αVβ3在正常组织器官及成熟血管 内皮细胞中不表达或低表达，在多种肿瘤(包括肺癌、成胶质细胞瘤、 乳腺癌、骨肉瘤等)细胞表面和新生血管内皮细胞中有高表达，在肿 瘤的新生血管生成、侵袭和转移过程中起重要作用。特异性标记的外 源性RGD多肽进入体内后可与整合素αVβ3位点高选择性结合，从 而RGD多肽可以作为一种特异性配体靶向组织，并通过各种影像学 方法进行示踪。同时，
此外，光热治疗是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射 入活体内部，利用靶向性识别技术聚集在病灶附近，并在外部光源(一 般是近红外光)的照射下将光致热效应杀死癌细胞的一种治疗方法。 这种方法具有高效率、低痛苦、副作用小、作用时间短等优点，并且 治愈效果明显，用于光热治疗的材料无毒无害，因此在肿瘤治疗方面 具有非常广阔的应用前景。
同时，光动力治疗剂是一种光敏剂，将其注射入活体内部，利用 靶向性识别技术聚集在乳腺癌附近，在特定波长激光的照射下受到激 发，激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单 态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作 用，进而导致癌细胞受损甚至死亡的一种治疗方法。这种方法能够选 择性地杀伤局部原发和复发的肿瘤细胞，对健康组织基本没有损害或 损害较小，毒副反应少，对年老体弱，不能手术或需静脉化疗的患者 尤为适宜，尤其是对那些用传统治疗方法无效或危险的晚期肿瘤患者 有着良好的转化应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服常用荧光物质吲哚菁绿(单独使用)性 质不稳定、容易被光漂白、不能长期使用等缺点，以及为了实现双亲 肽纳米胶束的多功能应用(如生物成像、药物释放、肿瘤治疗等，而 提供一种具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束。
本发明的另一个目的是提供一种具有靶向整合素αvβ3的复合 双亲肽纳米胶束的制备工艺。
本发明的另一个目的是提供具有靶向整合素αvβ3的复合双亲 肽纳米胶束在乳腺癌新生血管荧光成像的应用。
本发明的另一个目的提供基于具有靶向整合素αvβ3的复合双 亲肽纳米胶束的光热治疗剂。
本发明的另一个目的是提供基于具有靶向整合素αvβ3的复合 双亲肽纳米胶束光动力治疗剂。
为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是以双亲肽为构 建基质，包载组分为荧光物质吲哚菁绿，表面具有特异性靶向多肽分 子。
进一步设置是所述具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶 束的直径为30～180纳米，电位为10～40毫伏。
优选的,多肽的序列为C18GR7RGDS。
实现本发明的第二个发明目的是技术方案包括以下步骤：
a.取双亲肽C18GR7RGDS溶解于超纯水，制得浓度为10毫克/毫升 的溶液；
b.取吲哚菁绿溶解于超纯水，制备浓度为2毫克/毫升的溶液；
c.将上述双亲肽溶液与吲哚菁绿溶液按体积比1:1～2：1充分混 合，放置于超声波清洗仪中，仪器参数设置为：温度25摄氏度、 时间20～40分钟、功率28千赫兹，得到复合双亲肽纳米胶束产 物；
d.将上述复合双亲肽纳米胶束转移至截留分子量为1000道尔顿的 透析袋，透析48～72小时即得具有靶向整合素αvβ3的复合双亲 肽纳米胶束。
实现本发明的第三个发明目的技术方案是一种靶向复合纳米荧 光探针，其为具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束，并用于 乳腺癌新生血管荧光成像。
实现本发明的第四个发明目的，用于光动力治疗的治疗剂，其为 所述的具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束。
实现本发明的第五个发明目的，用于光热治疗的治疗剂，其为所 述的具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束。
本发明所述具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束及选 择性构建方法对发展新型生物探针、拓展荧光造影剂的制备工艺、提 高荧光探针的生物利用率、实现肿瘤新生血管的早期分子诊断、光动 力治疗与光热治疗具有重要意义。
本发明得到复合双亲肽纳米胶束，其通用工艺与结构(如图1) 所示。表面电位表征及分布指数可由纳米粒度仪测量得到(如图2)。 如图2所示电位为10～40毫伏，正电荷的特性也有利于细胞对此复 合双亲肽纳米胶束的摄取。荧光探针的粒径大小可由纳米粒度仪测测 量得到(如图3)。如图3所示直径为30～180纳米，纳米级别的物 质更易通过细胞膜进入细胞。制成的靶向复合双亲肽纳米胶束具有良 好的生物相容性和安全性(如图4)，与非靶向对照组相比，靶向整 合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束可显著提高在乳腺癌中的荧光成 像的对比度与分辨率(如图5)。此外制成的靶向复合双亲肽纳米胶 束在热成像仪拍摄下，经808nm激光照射5分钟后温度明显升高(如 图6)，复合双亲肽纳米胶束在乳腺癌细胞中有良好的光热效应(如 图7)，并且复合双亲肽纳米胶束具有良好的光动力效应(如图8)。材料成像效果明显，具有较好的光热及光动力效应，从而确认该靶向 复合双亲肽纳米胶束在荧光成像，肿瘤细胞的早期诊断与光热治疗、 光动力治疗、荧光治疗药物的靶向富集等方面有广阔应用前景。
有益效果
将此发明所涉及的靶向乳腺癌整合素αVβ3的复合双亲肽作为 荧光成像、光动力及光热治疗材料，不仅可以丰富乳腺癌无创(或微 创)治疗方案，而且对于开发新型肿瘤诊疗模式、减小目前临床治疗 的副作用、降低对于正常组织伤害、提高癌症诊疗效率与精准性具有 重要意义，同时对于促进所述双亲肽作为新型乳腺癌靶向诊疗的临床 转化具有重要的实用价值。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1为本发明所涉及的靶向复合双亲肽纳米胶束的通用结构与 工艺；
图2为新型靶向复合双亲肽纳米胶束荧光探针的电位表征图；
图3为新型靶向复合双亲肽纳米胶束荧光探针的粒径表征图；
图4为新型靶向复合双亲肽纳米胶束荧光探针在乳腺癌细胞中毒 性效果图；
图5a为靶向复合双亲肽纳米胶束应用于乳腺癌细胞中在激光共 聚焦扫描显微镜下的靶向效果图；
图5b为靶向复合双亲肽纳米胶束应用于乳腺癌细胞中在流式细 胞计数仪测量下的靶向效果图；
图6为靶向复合双亲肽纳米胶束在808纳米激光照射5分钟前后 的红外热成像效果；
图7a为靶向复合双亲肽纳米胶束应用于乳腺癌MDA-MB231细胞 在808纳米激光照射5分钟前后的光热效应效果图；
图7b为靶向复合双亲肽纳米胶束应用于乳腺癌MCF-7细胞在808 纳米激光照射5分钟前后的光热效应效果图；
图8为不同浓度复合双亲肽纳米胶束子与相应浓度吲哚菁绿在 808纳米激光照射5分钟前后的光动力效应效果图；
图9为复合双亲肽纳米胶束子与等浓度吲哚菁绿应用于乳腺癌 MDA-MB231细胞在808纳米激光照射5分钟前后的光动力效应效果 图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行 进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工 程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
本发明所采用的制备原料均为商品获得。
实施例1：取2毫升双亲肽序列C18GR7RGDS溶液(宁波康贝生化 有限公司，型号：817870，批号：17040701))(10毫克/毫升)和1 毫升亚甲基蓝溶液(2毫克/毫升)混匀，将混合溶液避光放置于超 声波清洗仪，条件设置为25摄氏度、30分钟、28千赫兹。超纯水清 洗截留分子量为1000道尔顿透析袋，随后将该混合溶液转移至透析 袋，放入盛有超纯水透析液的烧杯并使之浮于透析液中，该透析液体 积为2000毫升，PH值为7.4，放入磁子置于磁力搅拌仪上，室温下 转速为120转，透析2小时时发现透析液颜色变蓝，透析袋中混合溶 液变透明，继续透析至48小时，紫外分光光度计测量透析袋溶液， 未发现亚甲基蓝的特征性吸收峰，说明亚甲基蓝未包裹进双亲肽纳米 胶束。这也说明，用本发明合成的双亲肽序列很难包裹亚甲基蓝而形 最终的产物。
实施例2：取2毫升双亲肽C18GR7RGDS溶液(10毫克/毫升)和 1毫升姜黄素(2毫克/毫升，溶于醋酸)混匀，将混合溶液避光放置 于超声波清洗仪，条件设置为25摄氏度、30分钟、28千赫兹。超纯 水清洗截留分子量为1000道尔顿透析袋，随后将该混合溶液转移至 透析袋，放入盛有超纯水透析液的烧杯并使之浮于透析液中，该透析 液体积为2000毫升，PH值为7.4，放入磁子置于磁力搅拌仪上，室 温下转速为120转，透析3小时时发现透析袋内出现黄色沉淀析出， 随着透析时间增加，黄色沉淀物也逐渐增加，混合液中通过透析袋进 入纯水，姜黄素不溶于水便析出。这也说明，本发明的双亲肽序列不 能很好的包裹姜黄素。
实施例3：取2毫升双亲肽C18GR7RGDS溶液(宁波康贝生化有限 公司，型号：817870，批号：17040701)(10毫克/毫升)和1毫升 吲哚菁绿溶液(2毫克/毫升，)混匀，将混合溶液避光放置于超声波 清洗仪，条件设置为25摄氏度、30分钟、28千赫兹。超纯水清洗截 留分子量为1000道尔顿透析袋，随后将该混合溶液转移至透析袋， 放入盛有超纯水透析液的烧杯并使之浮于透析液中，该透析液体积为 2000毫升，PH值为7.4，放入磁子置于磁力搅拌仪上，室温下转速 为120转，每4小时更换一次透析水，透析48小时，即得荧光双亲 肽自组装纳米胶束。经过测试，发现绝大部分的吲哚菁绿被成功包裹 进本发明的多肽序列里；形成了自组装纳米胶束。
用紫外可见分光光度计标准曲线法测得复合双亲肽纳米胶束中 吲哚菁绿的浓度为287微克/毫升。用纳米粒度仪测量表面电位为 29.1±6.66毫伏(图2a)，粒径大小为135.7±17.2纳米(图3a)。 复合双亲肽稳定性好，且正电荷有利于细胞的摄取。
乳腺癌MDA-MB231(αvβ3阳性)细胞铺于96孔板，每孔1×104个细胞，37摄氏度孵育48小时，细胞长满后，加入用L-15培养基 配置的不同浓度复合双亲肽纳米胶束(按照本实施例子合成的)与相 应浓度吲哚菁绿(对照)，培养24小时后吸出培养基，CCK8法处理 后用酶标仪于450纳米处检测细胞存活率。如(图4)所示，随着吲 哚菁绿浓度增加，复合双亲肽纳米胶束对细胞的毒性作用低于纯吲哚 菁绿的趋势越明显，且当复合双亲肽纳米胶束中吲哚菁绿浓度高达 80微克每毫升时，细胞存活率仍为93％，浓度为40微克每毫升时， 细胞存活率为99％,此浓度可用作后续试验的适宜浓度。以上说明复 合双亲肽纳米胶束有良好的生物相容性。。
将浓度为40微克每毫升的复合双亲肽纳米胶束与乳腺癌 MDA-MB231(αvβ3阳性)细胞及乳腺癌MCF-7(αvβ3阴性)细胞共 同孵育，激光共聚焦显微镜观察(图5a)结果所示，MDA-MB231(αvβ3阳性)细胞荧光信号明显强于MCF-7(αvβ3阴性)细胞，说明复合 双亲肽纳米胶束RGD多肽能特异性识别整合素αvβ3，从而显示强荧 光信号。同时流式细胞仪定量测试，乳腺癌MDA-MB231(αvβ3阳性) 细胞及乳腺癌MCF-7(αvβ3阴性)细胞对复合双亲肽纳米胶束的摄取阳性率分别为99.55％、56.12％，MDA-MB231细胞靶向性强，MCF-7 细胞阳性率56.12％可能跟肿瘤的EPR效应有关。制成的靶向复合荧 光双亲肽纳米胶束造影材料具有良好的生物相容性和安全性，可以实 现靶向示踪。
实施例4：取3毫升双亲肽C18GR7RGDS溶液(10毫克/毫升)和 2毫升吲哚菁绿溶液(2毫克/毫升)混匀，将混合溶液避光放置于超 声波清洗仪，条件设置为25摄氏度、40分钟、28千赫兹。超纯水清 洗截留分子量为1000道尔顿透析袋，随后将该混合溶液转移至透析袋，放入盛有超纯水透析液的烧杯并使之浮于透析液中，该透析液体 积为2000毫升，PH值为7.4，放入磁子置于磁力搅拌仪上，室温下 转速为120转，每4小时更换一次透析水，将透析60小时，即得荧 光双亲肽自组装纳米胶束。用紫外可见分光光度计标准曲线法测得复合双亲肽纳米胶束中吲哚菁绿的浓度277微克/毫升。用纳米粒度仪 测量表面电位为：26.2±7.4毫伏(图2b)，粒径大小为159.4±25.6 纳米(图3b)。制成的靶向复合双亲肽纳米胶束、相应浓度纯吲哚菁 绿、超纯水经能量为3瓦每平方厘米的808纳米激光照射5分钟， 用红外热成像仪拍摄，结果(图6)所示超纯水温度升高6.3摄氏度， 复合材料温度升高51.4摄氏度，纯吲哚菁绿温度升高58.7摄氏度， 验证了吲哚菁绿作为光敏剂具有良好的光热效应，且双亲肽包裹吲哚 菁绿后其光热效应没有明显降低，可应用于肿瘤的治疗。乳腺癌MDA-MB231(αvβ3阳性)细胞、腺癌MCF-7(αvβ3阴性)细胞铺于 96孔板，每孔1×104个细胞，37摄氏度，二氧化碳浓度为5％的条件 下孵育48小时，细胞长满后，加入用L-15/DMEM培养基配置的不同 浓度复合双亲肽纳米胶束与相应浓度吲哚菁绿，孵育4小时后，经能 量为1.5瓦每平方厘米的808纳米激光照射5分钟，继续孵育20小 时，CCK8法处理后酶标仪450纳米检测细胞存活率。结果(图7a, 图7b)所示，激光照射后的MDA-MB231细胞存活率在吲哚菁绿40微 克每毫升时都明显降低(复合纳米材料组细胞存活率更低)，对于 MCF-7细胞复合纳米胶束也有明显的光热效应，可用于乳腺癌肿瘤的 光热治疗。
实施例5：取1毫升双亲肽C18GR7RGDS溶液(10毫克/毫升)和 1毫升吲哚菁绿溶液(2毫克/毫升)混匀，将混合溶液避光放置于超 声波清洗仪，条件设置为25摄氏度、20分钟、28千赫兹。超纯水清 洗截留分子量为1000道尔顿透析袋，随后将该混合溶液转移至透析袋，放入盛有超纯水透析液的烧杯并使之浮于透析液中，该透析液体 积为2000毫升，PH值为7.4，放入磁子置于磁力搅拌仪上，室温下 转速为120转，透析72小时，即得荧光双亲肽自组装纳米胶束。用 紫外可见分光光度计标准曲线法测得复合双亲肽纳米胶束中吲哚菁 绿的浓度382微克/毫升。用纳米粒度仪测量为：17.2±4.77毫伏(图 2c)，粒径大小为42.98±10.2纳米(图3c)。配置不同浓度复合双 亲肽纳米胶束与相应浓度吲哚菁绿2毫升，每组均加入20微升DPBF (1,3-二苯基异苯并呋喃)，紫外可见光分光光度计461纳米处测OD 值，然后用能量为1.5瓦每平方厘米的808纳米激光照射5钟，紫 外可见分光光度计461纳米下测量OD值。结果(图8)所示，复合 纳米胶束的OD值比吲哚菁绿降低明显。因DPBF(1,3-二苯基异苯并 呋喃)被氧化后其在461纳米处的吸收峰会降低，可用来量化光照后 光敏剂产生的活性氧ROS，从而可知复合纳米胶束产生的活性氧更多。 另在细胞中DCFH-DA(2’，7’-二氯荧光素二乙酯)被氧化后转化为有 明显荧光性质的DCF(2’，7’-二氯荧光素)，故用其表征细胞内活性 氧ROS的产生。遂将复合双亲肽纳米胶束及等浓度的吲哚菁绿与乳腺 癌MDA-MB231细胞共孵育4小时，加入10微摩尔溶于无血清培养基 的DCFH-DA培养20分钟，用能量为1.5瓦每平方厘米的808纳米激 光照射5分钟，激光共聚集显微镜在不同通道拍摄观察细胞内ROS产 生的情况。结果(图9)所示吲哚菁绿与复合纳米胶束经激光照射后 均产生明显荧光信号，证明有活性氧ROS产生。复合双亲肽纳米胶束 有良好的光动力效应，可用于乳腺癌的光动力治疗。
同时,将所制备的复合双亲肽纳米胶束(实施例子3-5)避光密 封保存于-4摄氏度冰箱，30天后仍为均一溶液，纳米粒度仪表征。 而且进行与实施例子3-5同样的实验，发现效果初次实验一样，说明 本发明制定的复合双亲肽纳米胶束比较稳定，特性几乎没有改变。
Claims (7)
1.一种具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于：以表面具有乳腺癌特异性靶向双亲肽为构建基质，包载组分为荧光物质吲哚菁绿。
2.根据权利要求1所述的具有乳腺癌靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于：靶向基团为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列的C18-GRRRRRRRRGDS(C18GR7RGDS)双亲肽。
3.根据权利要求2所述的一种具有乳腺癌靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于：所述具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束的直径为30～180纳米，电位为10～40毫伏。
4.一种制备如权利要求1-3之一所述的复合双亲肽纳米胶束的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：
a.取双亲肽C18GR7RGDS溶解于超纯水，制备浓度为10毫克/毫升的溶液；
b.取吲哚菁绿溶解于超纯水，制备浓度为2毫克/毫升的溶液；
c.将上述双亲肽溶液与吲哚菁绿溶液按体积比1：1～2：1充分混合，避光放置于超声波清洗仪中，仪器参数设置为：温度25摄氏度、时间20～40分钟、功率28千赫兹，得到复合双亲肽纳米胶束产物；
d.将上述复合双亲肽纳米胶束转移至截留分子量1000道尔顿的透析袋，透析48～72小时即得具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束。
5.一种如权利要求1-3之一所述的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于所述的具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束运用于乳腺癌荧光成像。
6.一种如权利要求1-3之一所述的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于所述的具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束作为新型光热治疗剂。
7.一种制备如权利要求1-3之一所述的复合双亲肽纳米胶束，其特征在于所述的具有靶向整合素αvβ3的复合双亲肽纳米胶束作为新型光动力治疗剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190503 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |