CN109690314B - 患有实体癌症的患者的分类方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及患有实体癌症的患者的分类方法，特别是涉及用于对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的方法和/或用于评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的方法。所述方法是基于对多种免疫应答标志物进行定量以及确定当与参比分布比较时与值对应的分布的百分位数。计算不同标志物的所确定的百分位数的平均值或中值并且将该值与所述平均或中值百分位数的参比值进行比较，其结果与存活期或响应性有关。

Description

患有实体癌症的患者的分类方法
技术领域
本发明涉及患有实体癌症的患者的分类方法，特别是涉及用于对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的方法和/或用于评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的方法。
背景技术
如Galon等(Cancer classification using the Immunoscore:a worldwidetask force(使用免疫评分进行癌症分类：全球专题研究组),J Transl Med.2012；10:205)所详细解释的那样，预测癌症的临床结果通常是通过对在原发肿瘤的手术切除期间所获得的组织样品进行组织病理学评价来实现的。传统的肿瘤分期(AJCC/UICC-TNM分类)汇总了关于肿瘤负荷(T)、引流和区域淋巴结中癌细胞的存在(N)以及转移证据(M)的数据。然而，现在认识到，临床结果在处于同一分期内的患者之间可以显著不同。目前的分类提供了有限的预后信息，并且不预测对治疗的响应。最近的文献已经提到了宿主免疫系统在控制肿瘤进展中的重要性。因此，有证据支持包括免疫生物标志物的概念，这体现为用于预测预后和对治疗的响应的工具。从大量人类癌症收集的越来越多的数据已经证实了免疫分类的影响，其具有预后价值，可以增加AJCC/UICC TNM分类的意义。因此，当务之急是开始将‘免疫评分’并入传统的分类中，从而提供必要的预后和潜在预测工具。将该参数作为癌症分类的生物标志物引入作为肿瘤常规诊断和预后评估的一部分将促进临床决策，包括患者治疗的合理分层。
许多专利申请已经描述了通过测量免疫生物标志物对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的方法和/或通过测量免疫生物标志物评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的方法。可以引用例如：WO2015007625、WO2014023706、WO2014009535、WO2013186374、WO2013107907、WO2013107900、WO2012095448、WO2012072750以及WO2007045996。所有这些方法都提供了良好的结果。如综述Galon等,Immunity 39,2013,11-26中所解释，预后免疫特征和预测免疫特征在很大程度上是重叠的。
本申请的发明人设法进一步提高用于对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的方法和用于评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的方法的准确度。
发明内容
本发明涉及一种用于对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)对指示所述患者针对所述癌症的免疫应答的状态的两种或更多种生物标志物进行定量，其中在从所述患者获得的肿瘤样品中对指示所述免疫应答的状态的每一种生物标志物进行定量；
b)将在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值与从患有所述癌症的患者的参比组对于所述两种或更多种生物标志物中的每一种所获得的值的分布进行比较；
c)对于在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值确定与在步骤a)中获得的值相对应的分布的百分位数；
d)计算所述百分位数的算术平均值或中值；以及
e)将在步骤d)中获得的所述百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定的参比算术平均值或预定的中值进行比较，预定的参比值与存活时间有关。
通常，所述存活时间是无病存活期(DFS)、无进展存活期(PFS)、疾病特异性存活期(DSS)或总存活期(OS)。
本发明还涉及一种用于评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)对指示所述患者针对所述癌症的免疫应答的状态的两种或更多种生物标志物进行定量，其中在从所述患者获得的肿瘤样品中对指示所述免疫应答的状态的每一种生物标志物进行定量；
b)将在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值与从患有所述癌症的患者的参比组对于所述两种或更多种生物标志物中的每一种所获得的值的分布进行比较；
c)对于在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值确定与在步骤a)中获得的值相对应的分布的百分位数；
d)计算所述百分位数的算术平均值或中值；以及
e)将在步骤d)中获得的所述百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定的参比算术平均值或预定的中值进行比较，预定的参比值与对所述抗肿瘤治疗的响应有关。
术语“算术平均值”应当被广义地理解并且涵盖样本的“经典”算术平均值，其是采样值的总和除以样本中项目的数量；以及加权算术平均值：
Figure BDA0001856837060000031
权重wi可以表示特定值对平均值的影响的可靠性的量度。
当对许多(通常多于5种、10种、15种、200种)生物标志物进行定量时，中值是特别适合的。
本发明的方法具有独特的和多个优势：
所述方法的表现非常显著并且具有强烈的判别能力，这是因为在这些方法中考虑的生物标志物具有重要的特定特征。
所考虑的生物标志物是免疫生物标志物。特别是，所述生物标志物是适应性免疫生物标志物。它们的基本特征之一是这些免疫生物标志物与复发时间、死亡前的时间、对治疗响应前的时间、对治疗响应的幅度以及患者对治疗作出响应的持续时间有关。
本发明的方法的优势之一是每一种生物标志物的强度、表达、密度、量的水平与长度、存活时间、延长的存活期以及对治疗的持续响应有关。
本发明的方法适用，这是因为所述生物标志物的水平越高或越低，则存活期越长或越短并且对治疗的响应越好或越差。
与所述方法的高性能相关的基本新颖要素之一是所述方法独立于患者的临床数据和随访。可以独立于患者的结果，基于所述生物标志物的原始数据和归一化的数据来计算平均百分位数。
全面的适应性免疫反应是通过一组生物标志物来表征的，当共富集时，所述生物标志物将患者的分层改善到存活期延长和对治疗的响应更好的类别中。
针对每一种生物标志物加权的所有生物标志物的百分位数值的平均值允许将患者非常准确地分层到风险类别中。
通常，患有所述癌症的患者的参比组包括至少：100名、200名、300名、400名、500名、1000名或2000名患者。
通常，本发明的方法适用于癌症起源的各种器官(如乳腺、结肠、直肠、肺、头颈部、膀胱、卵巢、前列腺)以及各种癌细胞类型(腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、黑色素瘤等)。
通常，经受上述方法的患者可以患有选自以下的实体癌症：肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如外周癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、骨癌(例如成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、多发性骨髓瘤)、脑癌和中枢神经系统癌(例如脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、神经节神经胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(例如原位导管癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位小叶癌、男性乳房发育症)、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌(例如子宫内膜腺癌、腺棘癌、乳头状浆液性腺癌、透明细胞)、食道癌、胆囊癌(粘液腺癌、小细胞癌)、胃肠道类癌肿瘤(例如绒毛膜癌、恶性葡萄胎)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肾癌(例如肾细胞癌)、喉癌和下咽癌、肝癌(例如血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节性增生症、肝细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔癌和鼻旁窦癌(例如嗅神经母细胞瘤、中线肉芽肿)、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤(例如胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、皮肤癌(例如黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌)、胃癌、睾丸癌(例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤生殖细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如滤泡癌、间变性癌、低分化癌、髓样甲状腺癌)、阴道癌、外阴癌以及子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。
在一个优选的实施方式中，所述癌症是结肠直肠癌。
如本文所用的术语“肿瘤组织样品”意指源自于患者的任何组织肿瘤样品。获得所述组织样品是用于体外评价的目的。在一些实施方式中，所述肿瘤样品可以由从患者切除的肿瘤产生。在一些实施方式中，所述肿瘤样品可以由在患者的原发肿瘤中进行或在患者的远离原发肿瘤的转移样品中进行的活检产生。举例来说，在患有结肠直肠癌的患者的肠中进行的内窥镜活检。通常，将肿瘤组织样品在福尔马林中固定并且包埋在刚性固定剂，如石蜡(蜡)或环氧树脂中，将其放置在模具中，随后硬化以产生容易切割的块。然后可以使用显微切片机来制备材料的薄切片，将其放置在载玻片上并且进行例如免疫组织化学(使用IHC自动装置，如
Figure BDA0001856837060000061
XT，用于获得染色的载片)。所述肿瘤组织样品可以用于微阵列中，其被称作组织微阵列(TMA)。TMA由石蜡块组成，其中多达1000个单独的组织核心以阵列形式排列以允许多重组织学分析。该技术允许在DNA、RNA或蛋白质水平上同时快速可视化组织标本中的分子靶标。TMA技术描述于WO2004000992；US8068988；Olli等,2001HumanMolecular Genetics；Tzankov等,2005,Elsevier；Kononen等,1198；Nature Medicine中。
在一些实施方式中，所述肿瘤组织样品包括(i)整体原发肿瘤(作为整体)；(ii)来自肿瘤中心的组织样品；(iii)来自直接围绕肿瘤的组织的组织样品，所述组织可以更具体地命名为肿瘤的“侵袭性边缘”；(iv)与肿瘤紧密相邻的淋巴岛；(v)位于最靠近肿瘤处的淋巴结；(vi)在手术前收集的肿瘤组织样品(例如用于在治疗后对患者进行随访)；以及(vii)远处转移。
如本文所用的“侵袭性边缘”具有它在本领域中的一般含义并且指的是肿瘤周围的细胞环境。在一些实施方式中，不论肿瘤组织样品是源自于肿瘤中心、肿瘤的侵袭性边缘、还是最靠近的淋巴结，所述肿瘤组织样品包括已经从肿瘤中心或从围绕肿瘤的侵袭性边缘去除的组织的碎片或切片，包括在手术肿瘤切除后或在收集用于活检的组织样品后，以用于进一步定量一种或几种生物标志物，特别是经由组织学或免疫组织化学方法、经由流式细胞术方法以及经由基因或蛋白质表达分析的方法，包括基因组学和蛋白质组学分析。当然，可以对肿瘤组织样品进行多种公知的收集后制备技术和储存技术(例如固定、储存、冷冻等)。所述样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定)、或包埋的(例如石蜡包埋)。在一些实施方式中，当在切除的肿瘤中对肿瘤引流淋巴结的数量进行定量时，所述肿瘤组织样品由所述切除的肿瘤产生并且包括肿瘤中心，以及任选地肿瘤的侵袭性边缘。在所述实施方式中，通常通过后面描述的免疫组织化学(IHC)对免疫适应性应答的标志物进行定量。在一些实施方式中，当通过成像对肿瘤引流淋巴结的数量进行定量和测定时，肿瘤组织样品由活检产生。在所述实施方式中，通常通过确定至少一种基因的表达水平来对免疫适应性应答的标志物进行定量。
通常，所述肿瘤样品可以选自(i)整体原发肿瘤(作为整体)；(ii)来自肿瘤中心的组织样品；(iii)来自直接围绕肿瘤的组织的组织样品，所述组织可以更具体地命名为肿瘤的“侵袭性边缘”；(iv)位于最靠近肿瘤处的淋巴结或由肿瘤诱导的三级淋巴结构；(v)在任何时间并且通常在手术前进行的肿瘤活检；以及(vi)远处转移。
在一个优选的实施方式中，在肿瘤中心处和/或肿瘤的侵袭性边缘中对两种或更多种生物标志物进行定量。
在一个优选的实施方式中，在肿瘤中心处和/或肿瘤的侵袭性边缘中对两种或更多种生物标志物进行定量。
所述样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定)、或包埋的(例如石蜡包埋)。在一个具体的实施方式中，所述肿瘤样品由在患者的肿瘤中进行的活检产生。
实例是在患有结肠直肠癌或疑似患有结肠直肠癌的患者的肠中进行的内窥镜活检。
如本文所意指，“生物标志物”由任何可检测的、可测量的以及可定量的参数组成，所述参数指示了癌症患者针对肿瘤的免疫应答的状态。
生物标志物包括来自免疫系统的细胞在肿瘤部位处的存在或数量或密度。
生物标志物还包括由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质在肿瘤部位处的存在或量。
生物标志物还包括任何生物材料在肿瘤部位处的存在或量，所述生物材料指示了与提高宿主的特异性免疫应答相关的基因的表达水平。因此，生物标志物包括从编码由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)在肿瘤部位处的存在或量。
生物标志物因此包括由来自免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原，所述细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核白细胞/巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、NKT细胞以及NK-DC细胞，所述细胞被募集在肿瘤组织内或它的附近，包括在肿瘤的侵袭性边缘内以及最靠近的淋巴结中；或可替选地，编码所述表面抗原的mRNA。
说明性地，用作生物标志物的目标表面抗原包括CD3、CD4、CD8和CD45RO，它们由T细胞或T细胞子集表达。
举例来说，如果使用CD3抗原的表达或其mRNA的表达作为生物标志物，那么在根据本发明的方法的步骤a)对这种生物标志物进行的定量指示了涉及所有T淋巴细胞和NKT细胞的患者的适应性免疫应答的水平。
举例来说，如果使用CD8抗原的表达或其mRNA的表达作为生物标志物，那么在根据本发明的方法的步骤a)对这种生物标志物进行的定量指示了涉及细胞毒性T淋巴细胞的患者的适应性免疫应答的水平。
举例来说，如果使用CD45RO抗原的表达或其mRNA的表达作为生物标志物，那么在根据本发明的方法的步骤a)对这种生物标志物进行的定量指示了涉及记忆T淋巴细胞或记忆效应T淋巴细胞的患者的适应性免疫应答的水平。
仍是说明性地，用作生物标志物的蛋白质还包括由来自免疫系统的细胞特异性产生的溶细胞蛋白，如穿孔素、颗粒溶素以及颗粒酶-B。
许多专利申请已经描述了大量指示免疫应答状态的生物标志物，所述生物标志物可以用于本发明的方法中。
通常，可以使用以下文献中所述的指示免疫应答状态的生物标志物：WO2015007625、WO2014023706、WO2014009535、WO2013186374、WO2013107907、WO2013107900、WO2012095448、WO2012072750以及WO2007045996(全部通过引用并入本文)。
通常，可以对2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、31种、32种、33种、34种、35种、36种、37种、38种、39种、40种、41种、42种、43种、44种、45种、46种、47种、48种、49种以及50种不同的生物标志物的组合进行定量，优选地，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种生物标志物的组合，并且更优选地，2种、3种、4种、5种或6种生物标志物的组合。
在一个优选的实施方式中，指示免疫应答的状态的生物标志物是WO2007045996中所述的那些。
通常，可以使用的生物标志物是来自免疫系统的细胞的细胞密度。
在一个优选的实施方式中，所述两种或更多种生物标志物包括CD3+细胞的密度、CD8+细胞的密度、CD45RO+细胞的密度、GZM-B+细胞的密度和/或B细胞的密度。
在一个最优选的实施方式中，所述两种或更多种生物标志物包括CD3+细胞的密度和CD8+细胞的密度；CD3+细胞的密度和CD45RO+细胞的密度；CD3+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度；CD8+细胞的密度和CD45RO+细胞的密度；CD8+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度；或CD45RO+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度。
也可以测量B细胞的密度(参见WO2013107900和WO2013107907)。
也可以测量DC细胞的密度(参见WO2013107907)。
在一个优选的实施方式中，在肿瘤中心处和/或在肿瘤的侵袭性边缘中对来自免疫系统的细胞的密度进行定量。
在一个最优选的实施方式中，所述两种或更多种生物标志物包括肿瘤中心处CD3+细胞的密度、肿瘤中心处CD8+细胞的密度、侵袭性边缘中CD3+细胞的密度和侵袭性边缘中CD8+细胞的密度。
可以在“冷点”中，即在肿瘤样品中所述密度最低的区域中，或在对应于具有最低密度的2个至10个区域的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个“冷点”中测量所述密度。
也可以在“热点”中，即在其中所述密度最高的区域中，或在对应于具有最高密度的2个至10个区域的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个“热点”中测量所述密度。
还可以确定整个肿瘤样品上的平均密度。
通常，可以使用WO2013186374中所公开的方法对肿瘤样品中的免疫细胞进行定量。
如本文所用的术语“标志物”由任何可检测的、可测量的或可定量的参数组成，所述参数指示了受试者的适应性免疫应答的状态。当在(i)标志物的定量值的增加或降低与(ii)在患者中实际观测到的存活时间之间存在良好的统计相关性时，所述标志物成为用于执行本发明的方法的目的的“生物标志物”。为了计算所测试的每一种标志物的相关值并且因此确定所述标志物作为根据本发明的“生物标志物”的统计相关性，可以使用本领域技术人员已知的统计方法中的任一种。作为说明，可以使用利用卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)和/或使用对数秩检验的单变量分析和/或考克斯比例风险模型(Coxproportional-hazards model)的统计方法，如本文的实施例中所示。测定P值小于0.05，并且甚至优选地小于10-3、10-4、10-5、10-6或10-7(根据单变量分析和多变量分析(例如分别是对数秩检验和考克斯检验))的任何标志物构成可用于本发明的癌症预后方法中的“生物标志物”。在一些实施方式中，所述标志物包括来自免疫系统的细胞的存在或数量或密度。在一些实施方式中，所述标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或量。在一些实施方式中，所述标志物包括任何生物材料的存在或量，所述生物材料指示与提高宿主的特异性免疫应答相关的基因的水平。因此，在一些实施方式中，所述标志物包括从编码由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)的存在或量。在一些实施方式中，所述标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原，所述细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核白细胞/巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-DC细胞；或可替选地，编码所述表面抗原的mRNA。当使用超过一种生物标志物执行本发明的方法时，在步骤a)定量的不同的生物标志物的数量通常少于100种不同的标志物，并且在大部分的实施方式中，少于50种不同的标志物。使用本发明的方法获得准确的和可靠的预后所需的不同生物标志物的数量可以变化，特别是根据用于定量的技术的类型而变化。作为说明，当通过对目标蛋白质标志物进行原位免疫组织化学检测来执行本发明的方法时，特别是当在肿瘤中心(CT)处和在侵袭性边缘(IM)中都对所述标志物进行单独的定量时，使用少量生物标志物的组合可以发现高统计学显著性。作为说明，仅使用一种标志物或两种标志物的组合获得了高统计学显著性，如实施例中所公开的那样。进一步作为说明，当通过对目标基因标志物进行基因表达分析来执行本发明的方法时，使用少量生物标志物也发现了高统计学显著性。不希望受任何具体理论所束缚，本申请的发明人认为，当通过使用基因表达分析进行生物标志物定量，以及通过使用十种不同的生物标志物的组合，并且更优选地十五种不同生物标志物的组合，最优选地二十种不同生物标志物或更多种的组合来执行本发明的方法时，达到了高统计学相关性(P值低于10-3)。在一些实施方式中，确定1种；2种；3种；4种；5种；6种；7种；8种；9种；10种；11种；12种；13种；14种；15种；16种；17种；18种；19种；20种；21种；22种；23种；24种；25种；26种；27种；28种；29种；30种；31种；32种；33种；34种；35种；36种；37种；38种；39种；40种；41种；42种；43种；44种；45种；46种；47种；48种；49种；或50种标志物的水平。在本说明书中，各种目标生物标志物中的每一种的名称指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库中存在的，包括来自HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)的数据库。在本说明书中，各种目标生物标志物中的每一种的名称也可以指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库Genbank中存在的。通过这些国际公认的序列数据库，对应于本文所述的目标生物标志物中的每一种的核酸和氨基酸序列可以由本领域技术人员检索得到。
指示免疫应答状态的生物标志物可以包括WO2007045996的表9中所列的一种或多种基因或相应蛋白质的表达水平，它们是：18s、ACE、ACTB、AGTR1、AGTR2、APC、APOA1、ARF1、AXIN1、BAX、BCL2、BCL2L1、CXCR5、BMP2、BRCA1、BTLA、C3、CASP3、CASP9、CCL1、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCNB1、CCND1、CCNE1、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CD154、CD19、CD1a、CD2、CD226、CD244、PDCD1LG1、CD28、CD34、CD36、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40LG、CD5、CD54、CD6、CD68、CD69、CLIP、CD80、CD83、SLAMF5、CD86、CD8A、CDH1、CDH7、CDK2、CDK4、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CEACAM1、COL4A5、CREBBP、CRLF2、CSF1、CSF2、CSF3、CTLA4、CTNNB1、CTSC、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYP1A2、CYP7A1、DCC、DCN、DEFA6、DICER1、DKK1、Dok-1、Dok-2、DOK6、DVL1、E2F4、EBI3、ECE1、ECGF1、EDN1、EGF、EGFR、EIF4E、CD105、ENPEP、ERBB2、EREG、FCGR3A,、CGR3B、FN1、FOXP3、FYN、FZD1、GAPD、GLI2、GNLY、GOLPH4、GRB2、GSK3B、GSTP1、GUSB、GZMA、GZMB、GZMH、GZMK、HLA-B、HLA-C、HLA-MA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DPA1、HLA-DQA2、HLA-DRA、HLX1、HMOX1、HRAS、HSPB3、HUWE1、ICAM1、ICAM-2、ICOS、ID1、ifna1、ifna17、ifna2、ifna5、ifna6、ifna8、IFNAR1、IFNAR2、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IGF1、IHH、IKBKB、IL10、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL17、IL17R、IL17RB、IL18、IL1A、IL1B、IL1R1、IL2、IL21、IL21R、IL23A、IL23R、IL24、IL27、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL31RA、IL4、IL4RA、IL5、IL6、IL7、IL7RA、IL8、CXCR1、CXCR2、IL9、IL9R、IRF1、ISGF3G、ITGA4、ITGA7、整合素αE(抗原CD103、人类粘膜淋巴细胞、抗原1；α多肽)、基因hCG33203、ITGB3、JAK2、JAK3、KLRB1、KLRC4、KLRF1、KLRG1、KRAS、LAG3、LAIR2、LEF1、LGALS9、LILRB3、LRP2、LTA、SLAMF3、MADCAM1、MADH3、MADH7、MAF、MAP2K1、MDM2、MICA、MICB、MKI67、MMP12、MMP9、MTA1、MTSS1、MYC、MYD88、MYH6、NCAM1、NFATC1、NKG7、NLK、NOS2A、P2X7、PDCD1、PECAM、CXCL4、PGK1、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PLAT、PML、PP1A、CXCL7、PPP2CA、PRF1、PROM1、PSMB5、PTCH、PTGS2、PTP4A3、PTPN6、PTPRC、RAB23、RAC/RHO、RAC2、RAF、RB1、RBL1、REN、Drosha、SELE、SELL、SELP、SERPINE1、SFRP1、SIRPβ1、SKI、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、SMAD2、SMAD4、SMO、SMOH、SMURF1、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SOD1、SOD2、SOD3、SOS1、SOX17、CD43、ST14、STAM、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、STK36、TAP1、TAP2、TBX21、TCF7、TERT、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF11A、TNFRSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、OX-40、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10、TNFSF6、TOB1、TP53、TSLP、VCAM1、VEGF、WIF1、WNT1、WNT4、XCL1、XCR1、ZAP70以及ZIC2。
在本说明书中，目标基因中的每一种的名称指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库中存在的，包括来自HUGO基因命名委员会的数据库。在本说明书中，目标基因中的每一种的名称也可以指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列数据库Genbank中存在的。通过这些国际公认的序列数据库，本文所述的目标基因中的每一种的核酸可以由本领域技术人员检索得到。
在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的生物标志物是WO2014023706(通过引用并入本文)中所述的那些：
在该实施方式下，在本发明的方法中评估了代表人类适应性免疫应答的单个基因和代表人类免疫抑制应答的单个基因(一对基因)的表达水平EL1。优选的是，使用每一种的一个至三个基因并且更优选地使用每一种的一个或两个基因。每一种的有限数量的基因提供良好和可靠的结果并且容易实施。特别是，单个参比值对于这两个基因中的每一个就足够了。基因数量越多，则参比值越复杂。下文给出了确定参比值的实例。
使用比一对或两对基因更多的基因是更难实施的并且更昂贵和耗时的，然而，提供了其他优势。举例来说，如果对一个基因的表达水平的评估是错误的，那么总体结果通过保留相同种类(人类适应性免疫应答或免疫抑制应答)的其他基因而被补偿。
如本文所用的表述“代表适应性免疫应答的基因”指的是由细胞表达的任何基因，所述细胞是肿瘤中适应性免疫应答的参与者或促进肿瘤中适应性免疫应答的建立。适应性免疫应答也被称作“获得性免疫应答”，包括T细胞亚型的抗原依赖性刺激、B细胞激活以及抗体产生。举例来说，适应性免疫应答的细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、T记忆T细胞、Th1细胞和Th2细胞、激活的巨噬细胞和激活的树突状细胞、NK细胞以及NKT细胞。因此，代表适应性免疫应答的基因通常可以选自用于Th1适应性免疫、用于细胞毒性应答或用于记忆应答的共调节基因的簇，并且可以编码Th1细胞表面标志物、白细胞介素(或白细胞介素受体)或趋化因子或(趋化因子受体)。
在一个具体的实施方式中，代表适应性免疫应答的基因选自：
-由以下组成的趋化因子和趋化因子受体的家族：CXCL13、CXCL9、CCL5、CCR2、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCL2以及CX3CL1；
-由以下组成的细胞因子的家族：IL15；
-由以下组成的TH1家族：IFNG、IRF1、STAT1、STAT4以及TBX21；
-由以下组成的淋巴细胞膜受体的家族：ITGAE、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CD247、CD69以及ICOS；
-由以下组成的细胞毒性分子的家族：GNLY、GZMH、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM以及PRF1；
以及激酶LTK。
在表1中报告了优选的此类基因或相应的蛋白质，这是因为它们提供了如下文在表5中所示的关于患者对治疗的响应的最佳结果：
CCL5
CCR2
CD247
CD3E
CD3G
CD8A
CX3CL1
CXCL11
GZMA
GZMB
GZMH
GZMK
IFNG
IL15
IRF1
ITGAE
PRF1
STAT1
TBX21
表1
如本文所用的表述“代表免疫抑制应答的基因”指的是由细胞表达的任何基因，所述细胞是肿瘤中免疫抑制应答的参与者或促进肿瘤中免疫抑制应答的建立。举例来说，所述免疫抑制应答包括
-T细胞亚型的抗原依赖性刺激的共抑制：基因CD276、CTLA4、PDCD1、CD274、TIM-3或VTCN1(B7H4)；
-巨噬细胞和树突状细胞的失活以及NK细胞的失活：基因TSLP、CD1A或VEGFA；
-癌症干细胞标志物的表达、分化和/或肿瘤发生：PROM1、IHH；
-肿瘤环境中产生的免疫抑制蛋白的表达：基因PF4、REN、VEGFA。
举例来说，免疫抑制应答的细胞包括未成熟的树突状细胞(CD1A)、调节性T细胞(Treg细胞)以及表达IL17A基因的Th17细胞。
因此，代表适应性免疫应答的基因通常可以选自共调节的适应性免疫基因，而免疫抑制基因可以代表免疫细胞(例如树突状细胞)的失活并且可以促进免疫抑制应答的诱导。
在一个具体的实施方式中，代表免疫抑制应答的基因或相应的蛋白质选自下表2中所报告的基因：
Figure BDA0001856837060000181
表2
所述基因是优选的，这是因为它们提供了关于患者对治疗的响应的最佳结果。
在用于实施本发明的优选的条件下，代表适应性免疫应答的基因选自：GNLY、CXCL13、CX3CL1、CXCL9、ITGAE、CCL5、GZMH、IFNG、CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、LTK、PRF1、STAT1、CD69、CD247、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2以及TBX21，并且代表免疫抑制应答的基因选自：PF4、REN、VEGFA、TSLP、IL17A、PROM1、IHH、CD1A、CTLA4、PDCD1、CD276、CD274、TIM-3以及VTCN1(B7H4)。
由于当将一个适应性基因和一个免疫抑制基因组合时，一些基因被更经常发现是显著的，因此最优选的基因是：
-代表适应性免疫应答的基因：CD3G、CD8A、CCR2以及GZMA；
-代表免疫抑制应答的基因：REN、IL17A、CTLA4以及PDCD1。
在用于实施本发明的进一步优选的条件下，代表适应性免疫应答的基因和代表免疫抑制应答的基因分别选自上表1和表2的基因。
两对基因(总共4个基因)的优选组合是
-CCR2、CD3G、IL17A和REN；以及
-CD8A、CCR2、REN和PDCD1。
被选用于本发明的方法中的基因的精确选择可以取决于对于患者所考虑的治疗的类型。举例来说，当使用药物的治疗被考虑用于患者时，所述药物如通过激活免疫系统起作用的单克隆抗体，如伊匹单抗(Ipilimumab)(也被称为MDX-010或MDX-101，作为
Figure BDA0001856837060000191
出售)，用于免疫抑制应答的选自CX3CL1、IL15、CD247、CD3G、CD8A、PRF1、CCL5和TBX21，优选地CX3CL1和IL15的基因以及用于适应性免疫应答的基因CTLA4将是优选的。
当诸如抑制血管内皮生长因子A(VEGF-A)的抗体，如作为
Figure BDA0001856837060000192
出售的贝伐单抗(bevacizumab)的治疗被考虑用于患者时，用于适应性免疫应答的选自IL15和GZMA的基因以及用于免疫抑制应答的基因VEGFA将是优选的。
当诸如靶向PD-1的抗体，如BMS-936558的治疗被考虑用于患者时，类似的考虑适用于例如基因对GZMA-PDCD1(也被命名为CD279)。
在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的生物标志物是WO2014009535(通过引用并入本文)中所述的那些：
指示免疫应答状态的生物标志物可以包括以下一种或多种基因的表达水平：CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、PRF1、STAT1、CD69、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21。
在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的生物标志物是WO2012095448(通过引用并入本文)中所述的那些：
指示免疫应答状态的生物标志物可以包括以下一种或多种基因的表达水平：GZMH、IFNG、CXCL13、GNLY、LAG3、ITGAE、CCL5、CXCL9、PF4、IL17A、TSLP、REN、IHH、PROM1以及VEGFA。
在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的生物标志物是WO2012072750(通过引用并入本文)中所述的那些：
指示免疫应答状态的生物标志物可以包括miRNA簇的表达水平，所述miRNA簇包括：miR.609、miR.518c、miR.520f、miR.220a、miR.362、miR.29a、miR.660、miR.603、miR.558、miR519b、miR.494、miR.130a、或miR.639。
用于对生物标志物进行定量的一般方法
可以使用本领域技术人员已知的用于对本文所涵盖的细胞类型、蛋白质类型或核酸类型生物标志物进行定量的方法中的任一种来执行本发明的癌症预后方法。因此，可以容易地应用本领域公知的用于检测和定量样品中的蛋白质或核酸的标准和非标准(新兴)技术中的任一种。
本发明的生物标志物的表达可以通过用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的各种公知方法中的任一种来评估。这些方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定，核酸杂交方法，核酸逆转录方法，以及核酸扩增方法。
在一个优选的实施方式中，标志物的表达是使用与标志物蛋白质或其片段特异性结合的抗体(例如放射性标记抗体、发色团标记抗体、荧光团标记抗体、聚合物骨架抗体或酶标记抗体)、抗体衍生物(例如与底物缀合或与蛋白质-配体对{例如生物素-链霉亲和素}的蛋白质或配体缀合的抗体)或抗体片段(例如单链抗体、分离的抗体高变结构域等)评估的，所述标志物蛋白质或其片段包括已经经历它的正常翻译后修饰的全部或一部分的标志物蛋白质。
在某些实施方式中，生物标志物或生物标志物组可以使用本领域已知的免疫组织化学方法中的任一种来定量。
通常，为了进一步分析，首先将肿瘤的一个薄切片与针对一种目标生物标志物的标记抗体一起温育。在洗涤之后，通过适当的技术揭示与所述目标生物标志物结合的标记抗体，所述技术取决于由标记抗体携带的标记的种类，例如放射性标记、荧光标记或酶标记。可以同时进行多重标记。
免疫组织化学通常包括以下步骤：i)使用福尔马林固定肿瘤组织样品；ii)将所述肿瘤组织样品包埋在石蜡中；iii)将所述肿瘤组织样品切成切片用于染色；iv)将所述切片与对目标免疫检查点蛋白具有特异性的结合配偶体一起温育；v)冲洗所述切片；vi)将所述切片与通常生物素化的二抗一起温育；以及vii)通常使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物来揭示抗原-抗体复合物。因此，首先将肿瘤组织样品与对目标免疫检查点蛋白具有特异性的结合配偶体一起温育。在洗涤之后，通过适当的技术揭示与目标免疫检查点蛋白结合的标记抗体，这取决于由标记抗体携带的标记的种类，例如放射性标记、荧光标记或酶标记。可以同时进行多重标记。可替选地，本发明的方法可以使用与扩增系统(以增强染色信号)和酶分子偶联的二抗。这样的偶联的二抗是可商购获得的，例如从丹科公司(Dako)的EnVision系统。可以使用复染色，例如苏木精和伊红，DAPI，Hoechst。其他染色法可以使用对于本领域技术人员来说显而易见的任何合适的方法或系统来完成，包括自动化系统、半自动化系统或手动系统。
举例来说，一个或多个标记可以与抗体连接，从而容许检测靶蛋白(即生物标志物)。示例性标记包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、酶、以及其组合。可以与一级和/或二级亲和配体缀合的标记的非限制性实例包括荧光染料或金属(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那、咪唑)以及生物发光蛋白(例如虫荧光素、虫荧光素酶)、半抗原(例如生物素)。多种有用的其他荧光剂和发色团描述于Stryer L(1968)Science 162:526-533；以及Brand L和Gohlke J R(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868中。亲和配体也可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S或125I)以及粒子(例如金)标记。不同类型的标记可以使用各种化学方法如胺反应或硫醇反应与亲和配体缀合。然而，可以使用除胺和硫醇以外的其他反应性基团，例如醛、羧酸以及谷氨酰胺。用于检测目标蛋白质的各种酶促染色方法是本领域已知的。举例来说，可以使用不同的酶，如过氧化物酶、碱性磷酸酶；或不同的发色团，如DAB、AEC或坚牢红(Fast Red)将酶促相互作用可视化。在一些实施方式中，所述标记是量子点。举例来说，量子点(Qdot)在日益增长的一系列应用中变得越来越有用，所述应用包括免疫组织化学、流式细胞术以及基于板的测定，并且因此可以与本发明结合使用。Qdot纳米晶体具有独特的光学特性，包括用于灵敏度和定量的极亮信号；用于成像和分析的高光稳定性。需要单个激发源，并且不断增长的缀合物的范围使得它们可用于广泛的基于细胞的应用。Qdot生物缀合物的特征在于量子产率与可用的最亮的传统染料相当。此外，这些基于量子点的荧光团吸收的光是传统染料的10倍-1000倍。来自基础Qdot量子点的发射是窄的和对称的，这意味着与其他颜色的重叠被减到最低限度，从而引起向相邻的检测通道中渗透的最小化和衰减的串扰，而不管可以同时使用更多颜色的事实。在其他实例中，抗体可以与能够经由标记的结合配偶体或抗体进行检测的肽或蛋白质缀合。在间接IHC测定中，二抗或第二结合配偶体是为检测第一结合配偶体的结合所必需的，因为所述第一结合配偶体没有被标记。
在一些实施方式中，将所得的染色标本各自使用用于观察可检测信号并且采集图像如染色的数字图像的系统来成像。用于图像采集的方法是本领域技术人员公知的。举例来说，一旦样品已经被染色，就可以使用任何光学或非光学成像装置来检测染色或生物标志物标记，例如直立式光学显微镜或倒置光学显微镜、扫描共聚焦显微镜、照相机、扫描或隧道电子显微镜、扫描探针显微镜以及成像红外检测器。在一些实例中，可以拍摄数码图像。然后可以使用所获得的图像来定量或半定量确定样品中免疫检查点蛋白的量，或对于目标标志物呈阳性的细胞的绝对数量，或对于目标标志物呈阳性的细胞的表面。适于与IHC一起使用的各种自动化样品处理、扫描以及分析系统是本领域可获得的。这些系统可以包括样品(如上面放置有组织切片的载片)的自动化染色和显微镜扫描、计算机化图像分析、连续切片比较(以控制样品的取向和尺寸上的变化)、数字报告生成以及存档和跟踪。细胞成像系统是可商购获得的，其将常规的光学显微镜与数字图像处理系统组合以对细胞和组织包括免疫染色的样品进行定量分析。参见例如CAS-200系统(BD公司(Becton,Dickinson&Co.))。具体来说，可以手动或通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术来进行检测。使用这样的软件，例如，可以基于包括例如染色质量或染色强度的因素，使用本领域技术人员已知的程序对图像进行配置、校准、标准化和/或验证(参见例如公开的美国专利公开号US20100136549)。可以基于样品的染色强度对图像进行定量或半定量分析和评分。定量或半定量组织化学指的是对已经历组织化学的样品进行扫描和评分以鉴定和定量指定的生物标志物(即免疫检查点蛋白)的存在的方法。定量或半定量方法可以使用成像软件来检测染色密度或染色的量或使用通过人眼检测染色的方法，其中受过训练的操作人员以数字对结果进行分级。举例来说，图像可以使用像素计数算法和组织识别模式(例如AperioSpectrum软件、自动化定量分析平台(
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平台)或带有Ilastic和Calopix软件的Tribvn)以及测量或定量或半定量染色程度的其他标准方法来定量分析；参见例如美国专利号8,023,714；美国专利号7,257,268；美国专利号7,219,016；美国专利号7,646,905；公开的美国专利公开号US20100136549和20110111435；Camp等(2002)Nature Medicine,8:1323-1327；Bacus等(1997)Analyt Quant Cytol Histol,19:316-328。可以计算强阳性染色(如棕色染色)与总染色面积的总和的比率并且评分。对所检测的生物标志物(即免疫检查点蛋白)的量进行定量并且作为阳性像素的百分比和/或评分给出。举例来说，所述量可以被定量为阳性像素的百分比。在一些实例中，所述量被定量为染色面积的百分比，例如阳性像素的百分比。举例来说，与总染色面积相比，样品可以具有至少或约至少或约0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的阳性像素。举例来说，所述量可以被定量为对于目标标志物呈阳性的细胞的绝对数量。在一些实施方式中，给予样品以评分，所述评分是样品的组织化学染色的强度或量的数值表示，并且代表样品中存在的靶生物标志物(例如免疫检查点蛋白)的量。光密度或百分比面积值可以例如在整数尺度上被给予比例评分。
因此，在一些实施方式中，本发明的方法包括以下步骤，所述步骤在于i)提供组织切片的一个或多个免疫染色切片，所述切片是通过自动化载片染色系统、通过使用能够与生物标志物选择性相互作用的结合配偶体而获得的；ii)通过高分辨率扫描拍摄对步骤i)的载片进行数字化；iii)在数字图像上检测组织切片的切片；iv)提供带有具有相同表面的均匀分布单元的尺寸参比网格，所述网格适合于待分析的组织切片的尺寸；以及v)检测、定量和测量每一个单元中染色细胞的强度或绝对数量。
多重组织分析技术特别可用于对肿瘤组织样品中的几种免疫检查点蛋白进行定量。这样的技术应当容许从单个肿瘤组织样品中测量至少五种或至少十种或更多种生物标志物。此外，对于所述技术有利的是，保持生物标志物的位置并且能够区分癌细胞和非癌细胞中生物标志物的存在。这些方法包括例如以下文献中所教导的分层免疫组织化学(L-IHC)、分层表达扫描(LES)或多重组织免疫印迹法(MTI)：美国专利号6,602,661、美国专利号6,969,615、美国专利号7,214,477以及美国专利号7,838,222；美国公开号2011/0306514(通过引用并入本文)；以及Chung和Hewitt,Meth Mol Biol,Prot Blotting Detect(蛋白质印迹检测),Kurlen和Scofield编著,536:139-148,2009，每一篇参考文献教导了可以利用在分层和印迹的膜、纸、过滤器等上制作组织切片的多达8个、多达9个、多达10个、多达11个或更多个图像。可用于进行L-IHC/MTI过程的包被膜可从20/20GeneSystems公司(马里兰州的罗克维尔(Rockville,MD))获得。
在一些实施方式中，L-IHC方法可以对多种组织样品中的任一种进行，无论所述组织样品是新鲜的还是保存的。所述样品包括核心针活检，其在病理科常规地被固定在10％正常缓冲福尔马林中并且被处理。从组织块上切下标准5μm厚的组织切片放在用于L-IHC的带电(charged)载片上。因此，L-IHC使得能够测试组织切片中的多种标志物，这是通过获得从组织切片转移到多个生物亲和包被膜的分子的拷贝以基本上产生组织“图像”的拷贝而进行的。在石蜡切片的情况下，如本领域已知的那样将组织切片脱石蜡，例如使切片暴露于二甲苯或二甲苯替代物，如NEO-
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和分级乙醇溶液。可以用蛋白酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等处理切片。然后，将一叠膜衬底放置在组织切片上，所述膜基质包括例如多片10μm厚的包被的聚合物主链，其具有0.4μm直径的孔隙以引导组织分子如蛋白质通过该堆叠。流体和组织分子的移动被配置成基本上垂直于膜表面。可以使切片、膜、隔离纸、吸水纸、重物等的夹层暴露于热以促进分子从组织移动到膜堆叠中。组织的蛋白质的一部分被捕捉在所述堆叠的生物亲和包被膜(可从马里兰州罗克维尔的20/20GeneSystems公司获得)中的每一个上。因此，每一个膜包括组织的拷贝并且可以使用标准免疫印迹技术针对不同的生物标志物进行探测，这使得如在单个组织切片上进行的标志物特征的开放式扩大成为可能。由于蛋白质的量在所述堆叠中更远离组织的膜上可以是更低的，这可能出现在例如组织样品中分子的量不同、从组织样品释放的分子的迁移性不同、分子对膜的结合亲和力不同、转移长度不同等，因此可以在程序中包括值的归一化、运行控制、评估组织分子的转移水平等以校正膜内、膜之间以及膜当中发生的变化并且使得能够直接比较膜内、膜之间以及膜当中的信息。因此，可以使用例如用于定量蛋白质的任何手段来确定每个膜的总蛋白，如使用标准试剂和方法将可用分子如蛋白质进行生物素化，然后通过使膜暴露于标记的亲和素或链霉亲和素来揭示结合的生物素；蛋白质染色，如Blot fastStain、丽春红(Ponceau Red)、亮蓝染色等，如本领域已知的那样。
在一些实施方式中，本发明的方法利用多重组织印记(MTI)技术来测量生物标志物，其中所述方法通过允许多种生物标志物，在一些情况下，至少六种生物标志物来保存珍贵的活检组织。
在一些实施方式中，存在替选性的多重组织分析系统，其也可以用作本发明的一部分。一种这样的技术是基于质谱的选择反应监测(SRM)测定系统(可从OncoPlexDx公司(马里兰州的罗克维尔)获得的“Liquid Tissue”)。该技术描述于美国专利号7,473,532中。
在一些实施方式中，本发明的方法利用由通用电气全球研究中心(GE GlobalResearch)(纽约州的尼什卡纳(Niskayuna,NY))开发的多重IHC技术。该技术描述于美国公开号2008/0118916和2008/0118934中。在那里，对含有多种靶标的生物样品进行连续分析，包括以下步骤：使荧光探针与样品结合，继而检测信号，然后使探针失活，继而使探针与另一靶标结合，检测并且失活，并且继续该过程直到所有靶标都已经被检测为止。
在一些实施方式中，当使用荧光(例如荧光团或量子点)时，可以进行多重组织成像，其中可以使用多光谱成像系统来测量信号。多光谱成像是其中收集图像的每一个像素处的光谱信息并且使用光谱图像处理软件分析所得数据的技术。举例来说，所述系统可以在不同的波长拍摄一系列图像，所述图像是电子的和连续可选择的，然后使用被设计用于处理这样的数据的分析程序加以利用。所述系统因此能够同时从多种染料获得定量信息，即使是在所述染料的光谱高度重叠时或在它们在样品中共定位或存在于同一点处时，前提条件是光谱曲线是不同的。当被更高能量的光激发时，许多生物材料自动发荧光或发射更低能量的光。该信号可以产生更低对比度的图像和数据。没有多光谱成像能力的高灵敏度照相机仅增加自发荧光信号以及荧光信号。多光谱成像可以不混合或分离出来自组织的自发荧光并且从而增加可实现的信噪比。简单地说，可以通过以下步骤进行定量：i)提供从患者获得的肿瘤组织微阵列(TMA)；ii)然后将TMA样品用对一种或多种目标免疫检查点蛋白具有特异性的抗抗体染色；iii)将TMA载片用上皮细胞标志物进一步染色以有助于肿瘤和基质的自动化分割；iv)然后使用多光谱成像系统扫描TMA载片；v)使用自动化图像分析软件(例如珀金埃尔默技术公司(Perkin Elmer Technology))处理扫描的图像，所述软件允许经由强大的图案识别算法来检测、定量以及分割特定组织。通常事先训练机器学习算法以分割肿瘤和基质并且鉴定标记的细胞。
确定从患者获得的肿瘤样品中基因的表达水平可以通过一组本领域公知的技术来实现。
通常，基因的表达水平是通过确定由该基因产生的mRNA的量来评估的。
用于确定mRNA的量的方法是本领域公知的。举例来说，首先根据标准方法，例如使用裂解酶或化学溶液提取或通过核酸结合树脂，遵循制造商的说明书提取样品(例如从患者制备的细胞或组织)中所含的核酸。然后通过杂交(例如RNA印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)来检测由此提取的mRNA。优选的是，定量或半定量RT-PCR是优选的。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。
其他扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)以及基于核酸序列的扩增(NASBA)、定量新一代RNA测序(NGS)。
包含至少10个核苷酸并且表现出与本文的目标mRNA具有序列互补性或同源性的一种或多种核酸可用作杂交探针或扩增引物。应当了解的是，这些核酸不必是与具有相当尺寸的同源区完全相同的，但是通常具有至少约80％的同一性，更优选地具有85％的同一性并且甚至更优选地具有90％-95％的同一性。在某些实施方式中，将有利的是，将核酸与适当的手段如可检测的标记组合使用，以用于检测杂交。多种适当的指示剂是本领域已知的，包括荧光配体、放射性配体、酶配体或其他配体(例如亲和素/生物素)。
探针通常包含具有10个至1000个核苷酸的长度的单链核酸，例如10个至800个，更优选地15个至700个，通常20个至500个核苷酸的长度。引物通常是更短的单链核酸，其具有10个至25个核苷酸的长度，被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对与它们杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选地在高严格度杂交条件(对应于最高的解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5×SCC或6×SCC。SCC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)下杂交。
在上述扩增和检测方法中可以用作引物或探针的核酸可以被组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定扩增是否发生所需的组分。试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及关于扩增和检测特定序列的说明书。
在一个具体的实施方式中，本发明的生物标志物的表达可以通过用数字寡核苷酸条形码标记生物标志物(在它的DNA、RNA或蛋白质中)并且对条形码的数量进行测量或计数来评估。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA并且对所述RNA进行扩增以及与特异性探针杂交，更特别是借助于定量或半定量RT-PCR。
使用公开的方法制备的探针可以用于核酸检测，如原位杂交(ISH)程序(例如荧光原位杂交(FISH)、发色原位杂交(CISH)以及银原位杂交(SISH))或比较基因组杂交(CGH)。
原位杂交(ISH)涉及在中期或间期染色体制备物(如被封片在载片上的细胞或组织样品)的背景下使含有靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)的样品与可与所述靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)特异性杂交或对所述靶核酸序列具有特异性的标记探针接触。任选地对载片进行预处理例如以去除石蜡或可能干扰均匀杂交的其他材料。例如通过加热以使双链核酸变性来处理样品和探针。将探针(被配制成合适的杂交缓冲液)和样品在一定的条件下和足够的时间内组合，以容许发生杂交(通常达到平衡状态)。洗涤染色体制备物以去除过量的探针，并且使用标准技术对染色体靶标的特异性标记进行检测。
举例来说，可以使用荧光素标记的亲和素或亲和素-碱性磷酸酶来检测生物素化的探针。对于荧光染料检测，可以直接检测所述荧光染料，或可以将样品与例如异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的亲和素一起温育。如果需要的话，FITC信号的放大可以通过与生物素缀合的山羊抗亲和素抗体一起温育，洗涤并且再次与FITC缀合的亲和素一起温育来实现。为了通过酶活性进行检测，可以将样品与例如链霉亲和素一起温育，洗涤，与生物素缀合的碱性磷酸酶一起温育，再次洗涤并且预平衡(例如在碱性磷酸酶(AP)缓冲液中)。对于原位杂交程序的一般描述，参见例如美国专利号4,888,278。
用于FISH、CISH以及SISH的许多程序是本领域已知的。举例来说，用于进行FISH的程序描述于美国专利号5,447,841；美国专利号5,472,842；以及美国专利号5,427,932；以及例如Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986；Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988；以及Lichter等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988中。CISH描述于例如Tanner等,Am.J.Pathol.157:1467-1472,2000和美国专利号6,942,970中。另外的检测方法提供于美国专利号6,280,929中。
许多试剂和检测方案可以结合FISH程序、CISH程序以及SISH程序使用以提高灵敏度、分辨率或其他所期望的特性。如上文所述，当进行FISH时，用荧光团(包括荧光染料和QUANTUM
Figure BDA0001856837060000301
)标记的探针可以直接光学检测。可替选地，探针可以用非荧光分子，如半抗原(如以下非限制性实例：生物素、地高辛、DNP以及各种噁唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、脲、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物以及其组合)、配体或其他可间接检测的部分标记。然后可以通过使样品(例如与探针结合的细胞或组织样品)与对所选择的半抗原或配体具有特异性的标记的检测试剂如抗体(或受体或其他特异性结合配偶体)接触来检测用这些非荧光分子标记的探针(以及与它们结合的靶核酸序列)。所述检测试剂可以用荧光团(例如QUANTUM
Figure BDA0001856837060000302
)或用另外的可间接检测的部分标记，或可以与可用荧光团标记的一种或多种另外的特异性结合剂(例如二抗或特异性抗体)接触。
在其他实例中，探针或特异性结合剂(如抗体，例如一抗、受体或其他结合剂)用能够将荧光组合物或发色组合物转化成可检测的荧光信号、有色信号或其他可检测的信号(例如SISH中可检测的金属粒子的沉积)的酶标记。如上文所示，酶可以直接或经由接头间接与相关探针或检测试剂连接。合适的试剂(例如结合试剂)和化学物质(例如接头和连接化学物质)的实例描述于美国专利申请公开号2006/0246524、2006/0246523以及2007/0117153中。
本领域技术人员应当了解的是，通过适当地选择标记的探针-特异性结合剂对，可以产生多重检测方案以有助于在单个测定中(例如在单个细胞或组织样品上或在超过一个细胞或组织样品上)检测多个靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)。举例来说，对应于第一靶序列的第一探针可以用第一半抗原如生物素标记，而对应于第二靶序列的第二探针可以用第二半抗原如DNP标记。在使样品暴露于所述探针之后，可以通过使样品与第一特异性结合剂(在这种情况下，是亲和素，其用第一荧光团标记，例如第一光谱特征的QUANTUM
Figure BDA0001856837060000311
其例如在585mn处发射)和第二特异性结合剂(在这种情况下，是抗DNP抗体或抗体片段，其用第二荧光团(例如第二光谱特征的QUANTUM
Figure BDA0001856837060000312
其例如在705mn处发射)标记)接触来检测结合的探针。另外的探针/结合剂对可以使用其他光谱特征的荧光团添加到多重检测方案中。可以设想直接和间接(一个步骤、两个步骤或更多个步骤)的许多变化，所有这些变化都适用于所公开的探针和测定的背景。
探针通常包含具有10个至1000个核苷酸的长度的单链核酸，例如10个至800个，更优选地15个至700个，通常20个至500个核苷酸的长度。引物通常是更短的单链核酸，其具有10个至25个核苷酸的长度，被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对与它们杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选地在高严格度杂交条件(对应于最高的解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5×SCC或6×SCC。SCC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)下杂交。
用于上述扩增和检测方法中的核酸引物或探针可以被组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定扩增是否发生所需的组分。所述试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及关于扩增和检测特定序列的说明书。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA并且对所述RNA进行扩增以及与特异性探针杂交，更特别是借助于定量或半定量RT-PCR。
在另一个优选的实施方式中，通过DNA芯片分析来确定表达水平。这样的DNA芯片或核酸微阵列由与基底化学连接的不同核酸探针组成，所述基底可以是微芯片、载玻片或微球尺寸的珠粒。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针包含核酸，如cDNA或寡核苷酸，其可以是约10个至约60个碱基对。为了确定表达水平，将来自测试受试者的、任选地首先经受逆转录的样品进行标记并且在杂交条件下与微阵列接触，从而引起与探针序列互补的靶核酸之间的复合物形成，所述探针序列与微阵列表面连接。然后检测标记的杂交复合物并且可以定量或半定量。标记可以通过各种方法，例如通过使用放射性标记或荧光标记来实现。微阵列杂交技术的许多变体对于本领域技术人员而言是可用的(参见例如Hoheisel,NatureReviews,Genetics,2006,7:200-210的综述)。
基因的表达水平可以被表示为绝对表达水平或归一化的表达水平。这两种类型的值都可以用于本发明的方法中。当使用定量PCR作为评估表达水平的方法时，基因的表达水平优选地被表示为归一化的表达水平，这是因为在实验开始时的小差异在多个循环之后可能产生巨大差异。
通常，通过将基因的表达与对于确定患者的癌症分期无关的基因，例如组成型表达的看家基因的表达相比较，来校正所述基因的绝对表达水平以将表达水平归一化。用于归一化的合适的基因包括看家基因，如肌动蛋白基因ACTB、核糖体18S基因、GUSB、PGK1以及TFRC。该归一化允许将一个样品，例如患者样品的表达水平与另一个样品的表达水平相比较，或比较来自不同来源的样品。
在本说明书中，目标基因中的每一种的名称指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库中存在的，包括来自HUGO基因命名委员会的数据库。在本说明书中，目标基因中的每一种的名称也可以指的是相应基因的国际公认名称，如在国际公认的基因序列数据库Genbank中存在的。经由这些国际公认的序列数据库，本文所述的目标基因中的每一种的核酸可以由本领域技术人员检索获取。
本发明的癌症预后方法可以使用基因的组合进行，前提条件是所述组合包含代表适应性免疫应答的至少一个基因和代表免疫抑制应答的至少一个基因。可以用于本发明的方法中的基因的数量仅受在执行所述方法时实际可获得的不同目标生物基因的数量的限制。因此，在一个实施方式中，对2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个以及50个不同基因的组合进行定量，优选地，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个基因的组合并且更优选地，2个、3个、4个、5个或6个基因的组合。然而，达到高统计学相关性(例如P值低于10-3)所需的组合基因的数量将取决于用于定量基因的组合的技术。用作代表适应性免疫应答的基因的基因数量和用作代表免疫抑制应答的基因的基因数量可以是相同的或不同的。
在实施本发明的优选条件下，使用大致平衡数量的每一种(适应性免疫应答和免疫抑制应答)的基因，例如每一种2个，或每一种3个，或一种5个和另一种6个。
确定从患者获得的肿瘤样品中基因的表达水平可以通过一组本领域公知的技术来实现。
通常，基因的表达水平是通过确定由该基因产生的mRNA的量来评估的。本申请的主题因此是一种用于筛选患有上文所定义的癌症的患者的方法，所述方法包括确定代表人类适应性免疫应答的一个或几个基因的表达水平ELA或代表人类免疫抑制应答的一个或几个基因的表达水平ELI，这是通过确定对应于所述基因的mRNA的量来进行的。
用于确定mRNA的量的方法是本领域公知的。举例来说，首先根据标准方法，例如使用裂解酶或化学溶液提取或通过核酸结合树脂，遵循制造商的说明书提取样品(例如从患者制备的细胞或组织)中所含的核酸。然后通过杂交(例如RNA印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)来检测由此提取的mRNA。优选的是，定量或半定量RT-PCR是优选的。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。
其他扩增方法包括连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)以及基于核酸序列的扩增(NASBA)、定量新一代RNA测序(NGS)。
包含至少10个核苷酸并且表现出与本文的目标mRNA具有序列互补性或同源性的一种或多种核酸可用作杂交探针或扩增引物。应当了解的是，这些核酸不必是与具有相当尺寸的同源区完全相同的，但是通常具有至少约80％的同一性，更优选地具有85％的同一性并且甚至更优选地具有90％-95％的同一性。在某些实施方式中，将有利的是，将核酸与适当的手段如可检测的标记组合使用，以用于检测杂交。多种适当的指示剂是本领域已知的，包括荧光配体、放射性配体、酶配体或其他配体(例如亲和素/生物素)。
探针通常包含具有10个至1000个核苷酸的长度的单链核酸，例如10个至800个，更优选地15个至700个，通常20个至500个核苷酸的长度。引物通常是更短的单链核酸，其具有10个至25个核苷酸的长度，被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对与它们杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选地在高严格度杂交条件(对应于最高的解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5×SCC或6×SCC。SCC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)下杂交。
在上述扩增和检测方法中可以用作引物或探针的核酸可以被组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定扩增是否发生所需的组分。试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及关于扩增和检测特定序列的说明书。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA并且对所述RNA进行扩增以及与特异性探针杂交，更特别是借助于定量或半定量RT-PCR。
使用公开的方法制备的探针可以用于核酸检测，如原位杂交(ISH)程序(例如荧光原位杂交(FISH)、发色原位杂交(CISH)以及银原位杂交(SISH))或比较基因组杂交(CGH)。
原位杂交(ISH)涉及在中期或间期染色体制备物(如被封片在载片上的细胞或组织样品)的背景下使含有靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)的样品与可与所述靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)特异性杂交或对所述靶核酸序列具有特异性的标记探针接触。任选地对载片进行预处理例如以去除石蜡或可能干扰均匀杂交的其他材料。例如通过加热以使双链核酸变性来处理样品和探针。将探针(被配制成合适的杂交缓冲液)和样品在一定的条件下和足够的时间内组合，以容许发生杂交(通常达到平衡状态)。洗涤染色体制备物以去除过量的探针，并且使用标准技术对染色体靶标的特异性标记进行检测。
举例来说，可以使用荧光素标记的亲和素或亲和素-碱性磷酸酶来检测生物素化的探针。对于荧光染料检测，可以直接检测所述荧光染料，或可以将样品与例如异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的亲和素一起温育。如果需要的话，FITC信号的放大可以通过与生物素缀合的山羊抗亲和素抗体一起温育，洗涤并且再次与FITC缀合的亲和素一起温育来实现。为了通过酶活性进行检测，可以将样品与例如链霉亲和素一起温育，洗涤，与生物素缀合的碱性磷酸酶一起温育，再次洗涤并且预平衡(例如在碱性磷酸酶(AP)缓冲液中)。对于原位杂交程序的一般描述，参见例如美国专利号4,888,278。
用于FISH、CISH以及SISH的许多程序是本领域已知的。举例来说，用于进行FISH的程序描述于美国专利号5,447,841；美国专利号5,472,842；以及美国专利号5,427,932；以及例如Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986；Pinkel等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988；以及Lichter等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988中。CISH描述于例如Tanner等,Am.J.Pathol.157:1467-1472,2000和美国专利号6,942,970中。另外的检测方法提供于美国专利号6,280,929中。
许多试剂和检测方案可以结合FISH程序、CISH程序以及SISH程序使用以提高灵敏度、分辨率或其他所期望的特性。如上文所述，当进行FISH时，用荧光团(包括荧光染料和QUANTUM
Figure BDA0001856837060000361
)标记的探针可以直接光学检测。可替选地，探针可以用非荧光分子，如半抗原(如以下非限制性实例：生物素、地高辛、DNP以及各种噁唑、吡唑、噻唑、硝基芳基、苯并呋咱、三萜、脲、硫脲、鱼藤酮、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物以及其组合)、配体或其他可间接检测的部分标记。然后可以通过使样品(例如与探针结合的细胞或组织样品)与对所选择的半抗原或配体具有特异性的标记的检测试剂如抗体(或受体或其他特异性结合配偶体)接触来检测用这些非荧光分子标记的探针(以及与它们结合的靶核酸序列)。所述检测试剂可以用荧光团(例如QUANTUM
Figure BDA0001856837060000371
)或用另外的可间接检测的部分标记，或可以与可用荧光团标记的一种或多种另外的特异性结合剂(例如二抗或特异性抗体)接触。
在其他实例中，探针或特异性结合剂(如抗体，例如一抗、受体或其他结合剂)用能够将荧光组合物或发色组合物转化成可检测的荧光信号、有色信号或其他可检测的信号(例如SISH中可检测的金属粒子的沉积)的酶标记。如上文所示，酶可以直接或经由接头间接与相关探针或检测试剂连接。合适的试剂(例如结合试剂)和化学物质(例如接头和连接化学物质)的实例描述于美国专利申请公开号2006/0246524、2006/0246523以及2007/0117153中。
本领域技术人员应当了解的是，通过适当地选择标记的探针-特异性结合剂对，可以产生多重检测方案以有助于在单个测定中(例如在单个细胞或组织样品上或在超过一个细胞或组织样品上)检测多个靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)。举例来说，对应于第一靶序列的第一探针可以用第一半抗原如生物素标记，而对应于第二靶序列的第二探针可以用第二半抗原如DNP标记。在使样品暴露于所述探针之后，可以通过使样品与第一特异性结合剂(在这种情况下，是亲和素，其用第一荧光团标记，例如第一光谱特征的QUANTUM
Figure BDA0001856837060000372
其例如在585mn处发射)和第二特异性结合剂(在这种情况下，是抗DNP抗体或抗体片段，其用第二荧光团(例如第二光谱特征的QUANTUM
Figure BDA0001856837060000381
其例如在705mn处发射)标记)接触来检测结合的探针。另外的探针/结合剂对可以使用其他光谱特征的荧光团添加到多重检测方案中。可以设想直接和间接(一个步骤、两个步骤或更多个步骤)的许多变化，所有这些变化都适用于所公开的探针和测定的背景。
探针通常包含具有10个至1000个核苷酸的长度的单链核酸，例如10个至800个，更优选地15个至700个，通常20个至500个核苷酸的长度。引物通常是更短的单链核酸，其具有10个至25个核苷酸的长度，被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对与它们杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选地在高严格度杂交条件(对应于最高的解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5×SCC或6×SCC。SCC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)下杂交。
用于上述扩增和检测方法中的核酸引物或探针可以被组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定扩增是否发生所需的组分。所述试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及关于扩增和检测特定序列的说明书。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA并且对所述RNA进行扩增以及与特异性探针杂交，更特别是借助于定量或半定量RT-PCR。
在另一个优选的实施方式中，通过DNA芯片分析来确定表达水平。这样的DNA芯片或核酸微阵列由与基底化学连接的不同核酸探针组成，所述基底可以是微芯片、载玻片或微球尺寸的珠粒。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针包含核酸，如cDNA或寡核苷酸，其可以是约10个至约60个碱基对。为了确定表达水平，将来自测试受试者的、任选地首先经受逆转录的样品进行标记并且在杂交条件下与微阵列接触，从而引起与探针序列互补的靶核酸之间的复合物形成，所述探针序列与微阵列表面连接。然后检测标记的杂交复合物并且可以定量或半定量。标记可以通过各种方法，例如通过使用放射性标记或荧光标记来实现。微阵列杂交技术的许多变体对于本领域技术人员而言是可用的(参见例如Hoheisel,NatureReviews,Genetics,2006,7:200-210的综述)。
基因的表达水平可以被表示为绝对表达水平或归一化的表达水平。这两种类型的值都可以用于本发明的方法中。当使用定量PCR作为评估表达水平的方法时，基因的表达水平优选地被表示为归一化的表达水平，这是因为在实验开始时的小差异在多个循环之后可能产生巨大差异。
通常，通过将基因的表达与对于确定患者的癌症分期无关的基因，例如组成型表达的看家基因的表达相比较，来校正所述基因的绝对表达水平以将表达水平归一化。用于归一化的合适的基因包括看家基因，如肌动蛋白基因ACTB、核糖体18S基因、GUSB、PGK1以及TFRC。该归一化允许将一个样品，例如患者样品的表达水平与另一个样品的表达水平相比较，或比较来自不同来源的样品。
抗肿瘤治疗
本发明的方法因此允许尤其限定目前为止从未被鉴定的一组新的患者，即他们的癌症将通过抗癌治疗被成功治疗的患者。
抗癌治疗可以由放疗、化疗或免疫治疗组成。治疗可以由辅助治疗(即在原发肿瘤的手术切除之后的治疗)或新辅助治疗(即在原发肿瘤的手术切除之前的治疗)组成。
本发明因此涉及化疗剂、放疗剂或免疫治疗剂，优选地是后者，其用于治疗I期-III期癌症患者，所述患者根据本发明的上述方法已经被认为是对于抗肿瘤治疗的良好响应者。
术语“化疗剂”指的是有效抑制肿瘤生长的化合物。化疗剂的实例包括烷基化剂，如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)以及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)以及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺以及三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(carnptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利斯他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)以及比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189以及CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estrarnustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺、氧化二氯甲基二乙胺盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷尼司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，特别是卡奇霉素(11和卡奇霉素211，参见例如AgnewChem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(canninomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-(吡咯啉-1-基)-多柔比星以及脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idanrbicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalarnycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、紫菜霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptomgrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、多西菌定(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素剂，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophospharnide glycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0001856837060000421
雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogennanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(特别是T-2毒素、疣疱菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)以及蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobromtol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(
Figure BDA0001856837060000422
新泽西州普林斯顿的百时美施贵宝肿瘤学公司(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.].))以及多西他赛(doxetaxel)(
Figure BDA0001856837060000423
法国安东尼的罗纳-普朗克罗雷尔公司(Rhone-PoulencRorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述物质中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)以及托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素剂，如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)以及戈舍瑞林(goserelin)；以及上述物质中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
如本文所用的术语“免疫治疗剂”指的是间接或直接增强、刺激或增加身体针对癌细胞的免疫应答和/或减少其他抗癌治疗的副作用的化合物、组合物或治疗。免疫治疗因此是直接或间接刺激或增强免疫系统对癌细胞的应答和/或减轻可能已经由其他抗癌剂引起的副作用的治疗。免疫治疗在本领域中也被称作免疫疗法、生物治疗、生物响应调节剂治疗以及生物疗法。本领域已知的常见的免疫治疗剂的实例包括但不限于细胞因子、癌症疫苗、单克隆抗体以及非细胞因子佐剂。可替选地，免疫治疗性治疗可以由向患者给药一定量的免疫细胞(T细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞……)组成。
免疫治疗剂可以是非特异性的，即总体上加强免疫系统以使人体更有效对抗癌细胞的生长和/或扩散，或它们可以是特异性的，即靶向癌细胞本身，免疫治疗方案可以组合使用非特异性免疫治疗剂和特异性免疫治疗剂。
非特异性免疫治疗剂是刺激或间接改善免疫系统的物质。非特异性免疫治疗剂已经单独作为用于治疗癌症的主要疗法使用，以及在主要疗法之外使用，在这种情况下，非特异性免疫治疗剂充当佐剂以增强其他疗法(例如癌症疫苗)的有效性。非特异性免疫治疗剂在该后一种背景下还可以发挥减少其他疗法的副作用的功能，例如由某些化疗剂诱导的骨髓抑制。非特异性免疫治疗剂可以作用于关键的免疫系统细胞并且引起二次应答，如细胞因子和免疫球蛋白的产生增加。可替选地，所述药剂本身可以包含细胞因子。非特异性免疫治疗剂一般被分类为细胞因子或非细胞因子佐剂。
许多细胞因子已被应用于治疗癌症，作为被设计成加强免疫系统的一般非特异性免疫治疗或作为与其他疗法一起提供的佐剂。合适的细胞因子包括但不限于干扰素、白细胞介素以及集落刺激因子。
本发明所考虑的干扰素(IFN)包括常见类型的IFN，即IFN-α(IFN-a)、IFN-β(IFN-beta)以及IFN-γ(IFN-y)。IFN可以直接作用于癌细胞，例如通过减慢它们的生长、促进它们发育成具有更正常的行为的细胞和/或增加它们的抗原产生，从而使得所述癌细胞更容易被免疫系统识别和破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如通过减慢血管生成、加强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞以及巨噬细胞。重组IFN-α可作为Roferon(罗氏制药公司(Roche Pharmaceuticals))和Intron A(先灵公司(Schering Corporation))商购获得。IFN-α单独使用或与其他免疫治疗剂或化疗剂组合使用在治疗各种癌症方面已经显示出功效，所述癌症包括黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、肾癌(包括转移性肾癌)、乳腺癌、前列腺癌以及宫颈癌(包括转移性宫颈癌)。
本发明所考虑的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-11以及IL-12。可商购获得的重组白细胞介素的实例包括
Figure BDA0001856837060000441
(IL-2；Chiron公司)和
Figure BDA0001856837060000442
(IL-12；惠氏制药公司(Wyeth Pharmaceuticals))。Zymogenetics公司(华盛顿州的西雅图(Seattle,Wash.))目前正测试一种重组形式的IL-21，其也被考虑用于本发明的组合中。白细胞介素单独或与其他免疫治疗剂或化疗剂的组合在治疗各种癌症方面已经显示出功效，所述癌症包括肾癌(包括转移性肾癌)、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、卵巢癌(包括复发性卵巢癌)、宫颈癌(包括转移性宫颈癌)、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌以及前列腺癌。
白细胞介素与IFN-α的组合在治疗各种癌症方面也已经显示出良好的活性(Negrier等,Ann Oncol.2002 13(9):1460-8；Touranietal,J.Clin.Oncol.2003 21(21):398794)。
本发明所考虑的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭(filgrastim))、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭(sargramostim))以及促红细胞生成素(阿法依泊汀(epoetin alfa)、达依泊汀(darbepoietin))。用一种或多种生长因子治疗可以有助于在接受传统化疗的患者中刺激新血细胞的产生。因此，用CSF治疗可以有助于减少与化疗相关的副作用并且可以允许使用更高剂量的化疗剂。各种重组集落刺激因子是可商购获得的，例如
Figure BDA0001856837060000451
(G-CSF；安进公司(Amgen))、Neulasta(培非司亭(pelfilgrastim)；安进公司)、Leukine(GM-CSF；伯列克斯公司(Berlex))、Procrit(促红细胞生成素；Ortho Biotech公司)、Epogen(促红细胞生成素；安进公司)、Arnesp(促红细胞生成素)。集落刺激因子在治疗癌症方面已经显示出功效，所述癌症包括黑色素瘤、结肠直肠癌(包括转移性结肠直肠癌)以及肺癌。
适用于本发明的组合中的非细胞因子佐剂包括但不限于左旋咪唑(Levamisole)、氢氧化铝(明矾)、卡介苗(Calmette-Guerin bacillus)(ACG)、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's Adjuvant，IFA)、QS-21、DETOX、匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpethemocyanin，KLH)以及二硝基苯基(DNP)。非细胞因子佐剂与其他免疫治疗剂和/或化疗剂的组合已经显示出针对各种癌症的功效，所述癌症包括例如结肠癌和结肠直肠癌(左旋咪唑)；黑色素瘤(BCG和QS-21)；肾癌以及膀胱癌(BCG)。
除了具有特异性或非特异性靶标之外，免疫治疗剂也可以是主动的，即刺激身体自身的免疫应答，或它们可以是被动的，即包含在体外产生的免疫系统组分。
被动特异性免疫治疗通常涉及使用对癌细胞表面上存在的特定抗原具有特异性或对特定细胞生长因子具有特异性的一种或多种单克隆抗体。单克隆抗体可以通过多种方式用于治疗癌症，例如增强受试者对特定类型的癌症的免疫应答；通过靶向特定细胞生长因子，如参与血管生成的那些，或当与诸如化疗剂、放射性粒子或毒素的药剂连接或缀合时通过增强其他抗癌剂向癌细胞的递送，来干扰癌细胞的生长。
适用于包括在本发明的组合中的目前用作癌症免疫治疗剂的单克隆抗体包括但不限于利妥昔单抗(rituximab)
Figure BDA0001856837060000461
曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0001856837060000462
替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)
Figure BDA0001856837060000463
托西莫单抗(tositumomab)
Figure BDA0001856837060000464
西妥昔单抗(cetuximab)(C-225、
Figure BDA0001856837060000465
)、贝伐单抗
Figure BDA0001856837060000466
吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)
Figure BDA0001856837060000467
阿仑单抗(alemtuzumab)
Figure BDA0001856837060000468
以及BL22。单克隆抗体用于治疗广泛的癌症，包括乳腺癌(包括晚期转移性乳腺癌)、结肠直肠癌(包括晚期和/或转移性结肠直肠癌)、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、黑色素瘤以及脑瘤。其他实例包括抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体或抗B7H6抗体。
单克隆抗体可以单独使用或与其他免疫治疗剂或化疗剂组合使用。
主动特异性免疫治疗通常涉及使用癌症疫苗。已经开发了癌症疫苗，其包含完整的癌细胞、癌细胞的部分或源自于癌细胞的一种或多种抗原。癌症疫苗单独或与一种或多种免疫治疗剂或化疗剂的组合正在被研究用于治疗几种类型的癌症，包括黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌以及肺癌。非特异性免疫治疗剂可与癌症疫苗组合用于增强身体的免疫应答。
免疫治疗性治疗可以由过继性免疫治疗组成，如由Nicholas P.Restifo,MarkE.Dudley和Steven A.Rosenberg“Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing theT cell response(用于癌症的过继性免疫治疗：利用T细胞应答)”,Nature ReviewsImmunology,第12卷,2012年4月所述。在过继性免疫治疗中，将患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞在体外分离，通过诸如IL-2的淋巴因子激活或用肿瘤坏死基因渗出，并且重新给药(Rosenberg等,1988；1989)。激活的淋巴细胞最优选地是患者自身的细胞，其先从血液或肿瘤样品中分离并且在体外激活(或“扩增”)。这种形式的免疫治疗已经产生了几例黑色素瘤和肾癌消退的病例。
如本文所用的术语“放疗剂”意指本领域技术人员已知的有效治疗或缓解癌症的任何放疗剂，但不限于此。举例来说，放疗剂可以是诸如在近距离放疗或放射性核素治疗中施用的那些药剂的药剂。这些方法可以任选地还包括施用一种或多种另外的癌症治疗，诸如但不限于化疗和/或另外的放疗。
在一个优选的实施方式中，抗肿瘤治疗是使用检查点阻断癌症免疫治疗剂的治疗。
如本文所用的表述“检查点阻断癌症免疫治疗剂”或“免疫检查点抑制剂”(这两种表述将可互换使用)具有它在本领域中的一般含义并且指的是抑制免疫抑制性检查点蛋白的功能的任何化合物。抑制包括降低功能和完全阻断。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。许多免疫检查点抑制剂是已知的并且类似于这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂，在(不久的)将来可以开发替选性免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂包括肽、抗体、核酸分子以及小分子。具体来说，施用本发明的免疫检查点抑制剂以用于增强受试者的CD8+T细胞的增殖、迁移、持续和/或细胞毒性活性，特别是受试者的CD8+T细胞的肿瘤浸润。如本文所用的“CD8+T细胞”具有它在本领域中的一般含义并且指的是在其表面上表达CD8的T细胞的子集。它们是MHC I类限制性的，并且充当细胞毒性T细胞。“CD8+T细胞”也被称作CD8+T细胞，被称作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员并且是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的相关识别元件。免疫检查点抑制剂增强T CD8细胞杀伤活性的能力可以通过本领域公知的任何测定来确定。通常，所述测定是体外测定，其中使CD8+T细胞与靶细胞(例如由CD8+T细胞识别和/或裂解的靶细胞)接触。举例来说，本发明的免疫检查点抑制剂可以就使CD8+T细胞引起的特异性裂解增加超过约20％，优选地至少约30％、至少约40％、至少约50％或更多的特异性裂解的能力来选择，所述特异性裂解是使用与本发明的免疫检查点抑制剂接触的CD8+T细胞或CD8T细胞系以相同的效应细胞:靶细胞比获得的。用于经典细胞毒性测定的方案的实例是常规的。
通常，检查点阻断癌症免疫治疗剂是阻断由激活的T淋巴细胞表达的免疫抑制受体，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和程序性细胞死亡蛋白1(PDCD1，最常被称为PD-1)，或由NK细胞表达的免疫抑制受体，如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族的各种成员的药剂；或阻断这些受体的主要配体，如PD-1配体CD274(最常被称为PD-L1或B7-H1)的药剂。
通常，检查点阻断癌症免疫治疗剂是抗体。
在一些实施方式中，检查点阻断癌症免疫治疗剂是选自以下的抗体：抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗PDL2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗IDO1抗体、抗TIGIT抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体以及抗B7H6抗体。
抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；以及7,605,238中。一种抗CDLA-4抗体是替西木单抗(tremelimumab)(ticilimumab，CP-675,206)。在一些实施方式中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也被称为10D1、MDX-D010)，其是结合CTLA-4的完全人类单克隆IgG抗体。
PD-1抗体和PD-L1抗体的实例描述于美国专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149；以及PCT公开专利申请号WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400以及WO2011161699中。在一些实施方式中，PD-1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在某些其他实施方式中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，如纳武单抗(nivolumab)(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)，其是结合PD-1并且阻断PD-1被它的配体PD-Ll和PD-L2激活的完全人类IgG4抗体；派姆单抗(lambrolizumab)(MK-3475或SCH 900475)，其是针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，其是结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。
其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)抑制剂，如IMP321——一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone等,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。
其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，如B7-H3抑制剂和B7-H4抑制剂。特别是，抗B7-H3抗体MGA271(Loo等,2012,Clin.Cancer Res.7月15日(18)3834)。
还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等,2010,J.Exp.Med.207:2175-86；以及Sakuishi等,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。如本文所用的术语“TIM-3”具有它在本领域中的一般含义并且指的是含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域分子3。TIM-3的天然配体是半乳糖凝集素9(Gal9)。因此，如本文所用的术语“TIM-3抑制剂”指的是可以抑制TIM-3的功能的化合物、物质或组合物。举例来说，所述抑制剂可以抑制TIM-3的表达或活性，调节或阻断TIM-3信号转导通路和/或阻断TIM-3与半乳糖凝集素-9的结合。对TIM-3具有特异性的抗体是本领域公知的并且通常是WO2011155607、WO2013006490以及WO2010117057中所述的那些。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，优选地是IDO1抑制剂。IDO抑制剂的实例描述于WO2014150677中。IDO抑制剂的实例包括但不限于1-甲基-色氨酸(IMT)、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-丙氨酸)、6-硝基-色氨酸、6-氟-色氨酸、4-甲基-色氨酸、5-甲基色氨酸、6-甲基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、5-羟基-色氨酸、吲哚3-甲醇、3,3'-二吲哚基甲烷、表没食子儿茶素没食子酸酯、5-Br-4-Cl-吲哚氧基1,3-二乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛(acemetacin)、5-溴-色氨酸、5-溴吲哚氧基二乙酸酯、3-氨基-萘甲酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、4-苯基咪唑、芸苔宁(brassinin)衍生物、硫代海因(thiohydantoin)衍生物、β-咔啉衍生物或芸苔抗毒素(brassilexin)衍生物。优选的是，IDO抑制剂选自1-甲基-色氨酸、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、3-氨基-萘甲酸以及β-[3-苯并(b)噻吩基]-丙氨酸或其衍生物或前药。
在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)抗体。
在一个优选的实施方式中，检查点阻断癌症免疫治疗剂是CTLA4阻断抗体，如伊匹单抗；或PD-1阻断抗体，如纳武单抗或派姆单抗；或其组合。
将通过以下附图和实施例进一步说明本发明。这些实施例和附图不应当以任何方式被解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1是用于实施本发明的系统的示意图。
图2是图示了用于实施本发明的程序的一个实施例的流程图。
图3示出了百分位数的5个预定参比算术平均值的卡普兰-迈耶曲线。
实施例
根据算法评分方法分析患有I期/II期/III期结肠直肠癌的患者(n＝539)的参比组。使用CD3抗体和CD8抗体对整个载片肿瘤进行染色。使用数字病理学和图像分析软件，确定肿瘤的侵袭性边缘(IM)和肿瘤的核心(中心)(CT)。对CT区域和IM区域中CD3和CD8的密度进行定量(细胞数/mm2)。对所有密度或所有标志物的分布进行绘图并且报告于表中。推导相应的百分位数(即以5％的步长间距)。在下表中所示的实施例中，计算4个密度生物标志物值的平均值，每一种生物标志物的权重是1。该群组的卡普兰迈耶曲线示于图3上，5组类别(I0、I1、I2、I3、I4)分别对应于0％-10％、10％-25％、25％-75％、75％-95％、95％-100％的平均百分位数值。
在下表中是计算假设患者的百分位数的算术平均值的实施例的说明：
Figure BDA0001856837060000511
Figure BDA0001856837060000521
假设患者的百分位数的算术平均值将是约47.5。所述假定患者将被分类为属于组I2。
已经使用21种生物标志物和使用15种生物标志物进行了相同类型的实验，所述21种生物标志物是以下21个基因的表达水平：CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、PRF1、STAT1、CD69、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21，所述15种生物标志物是以下15个基因的表达水平：GZMH、IFNG、CXCL13、GNLY、LAG3、ITGAE、CCL5、CXCL9、PF4、IL17A、TSLP、REN、IHH、PROM1以及VEGFA。
已经通过计算百分位数的中值获得了非常准确的结果。
参考文献：
在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开中。

Claims (14)

1.两种或更多种生物标志物在制备用于通过包括以下步骤的方法对患有实体癌症的患者的存活时间进行预后的试剂盒或装置中的用途：
a)对所述两种或更多种生物标志物进行定量，其中所述两种或更多种生物标志物指示所述患者针对所述癌症的免疫应答的状态，并且在从所述患者获得的肿瘤样品中对每一种生物标志物进行定量；
b)将在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值与从患有所述癌症的患者的参比组对于所述两种或更多种生物标志物中的每一种所获得的值的分布进行比较；
c)对于在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值确定与在步骤a)中获得的值相对应的分布的百分位数；
d)计算所述百分位数的算术平均值或中值；以及
e)将在步骤d)中获得的所述百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定的参比算术平均值或预定的中值进行比较，预定的参比值与存活时间有关；
其中所述两种或更多种生物标志物包括来自免疫系统的细胞的细胞密度。
2.两种或更多种生物标志物在制备用于通过包括以下步骤的方法评估患有实体癌症的患者对抗肿瘤治疗的响应性的试剂盒或装置中的用途：
a)对所述两种或更多种生物标志物进行定量，其中所述两种或更多种生物标志物指示所述患者针对所述癌症的免疫应答的状态，并且在从所述患者获得的肿瘤样品中对每一种生物标志物进行定量；
b)将在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值与从患有所述癌症的患者的参比组对于所述两种或更多种生物标志物中的每一种所获得的值的分布进行比较；
c)对于在步骤a)中对于所述两种或更多种生物标志物所获得的每一个值确定与在步骤a)中获得的值相对应的分布的百分位数；
d)计算所述百分位数的算术平均值或中值；以及
e)将在步骤d)中获得的所述百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定的参比算术平均值或预定的中值进行比较，预定的参比值与对所述抗肿瘤治疗的响应有关；
其中所述两种或更多种生物标志物包括来自免疫系统的细胞的细胞密度。
3.权利要求1或2的用途，其中所述实体癌症是结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、膀胱癌、卵巢癌或前列腺癌。
4.权利要求3的用途，其中所述实体癌症是结肠直肠癌。
5.权利要求1或2的用途，其中所述两种或更多种生物标志物包括CD3+细胞的密度、CD8+细胞的密度、CD45RO+细胞的密度、GZM-B+细胞的密度、B细胞的密度和/或DC细胞的密度。
6.权利要求5的用途，其中所述两种或更多种生物标志物包括CD3+细胞的密度和CD8+细胞的密度；CD3+细胞的密度和CD45RO+细胞的密度；CD3+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度；CD8+细胞的密度和CD45RO+细胞的密度；CD8+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度；或CD45RO+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度。
7.权利要求1至6任一项的用途，其中在所述肿瘤的中心处和/或在所述肿瘤的侵袭性边缘中对所述来自免疫系统的细胞的密度进行定量。
8.权利要求7的用途，其中所述两种或更多种生物标志物包括所述肿瘤的中心处CD3+细胞的密度、所述肿瘤的中心处CD8+细胞的密度、所述侵袭性边缘中CD3+细胞的密度和所述侵袭性边缘中CD8+细胞的密度。
9.权利要求1至8任一项的用途，其中在所述肿瘤样品中所述密度最低的区域中测量所述密度。
10.权利要求1至8任一项的用途，其中在所述肿瘤样品中所述密度最高的区域中测量所述密度。
11.权利要求1至10任一项的用途，其中所述两种或更多种生物标志物还包括以下一种或多种基因的表达水平：CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、PRF1、STAT1、CD69、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21。
12.权利要求1至10任一项的用途，其中所述两种或更多种生物标志物还包括以下一种或多种基因的表达水平：GZMH、IFNG、CXCL13、GNLY、LAG3、ITGAE、CCL5、CXCL9、PF4、IL17A、TSLP、REN、IHH、PROM1和VEGFA。
13.权利要求1至10任一项的用途，其中所述两种或更多种生物标志物还包括代表人类适应性免疫应答的至少一种基因的表达水平和代表人类免疫抑制应答的至少一种基因的表达水平。
14.权利要求13的用途，其中所述代表人类适应性免疫应答的至少一种基因选自：
Figure FDA0003629526080000031
Figure FDA0003629526080000041
并且所述代表人类免疫抑制应答的至少一种基因选自：
CD274 CTLA4 IHH IL17A PDCD1 PF4 PROM1 REN TIM-3 TSLP VEGF
。
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