CN109688810B - 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 - Google Patents
具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109688810B CN109688810B CN201780052153.2A CN201780052153A CN109688810B CN 109688810 B CN109688810 B CN 109688810B CN 201780052153 A CN201780052153 A CN 201780052153A CN 109688810 B CN109688810 B CN 109688810B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- human
- por
- mouse
- mice
- liver
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims description 111
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title claims description 22
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title claims description 22
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 title description 26
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title description 18
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 115
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000003908 liver function Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 162
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 119
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 79
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 49
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 48
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 32
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 29
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 25
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 24
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 22
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 17
- 102100029640 UDP-glucose 6-dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 15
- 108030001662 UDP-glucose 6-dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 13
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 12
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 238000012246 gene addition Methods 0.000 claims description 11
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 10
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 claims description 10
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 claims description 10
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 10
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 9
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004820 blood count Methods 0.000 claims description 3
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 35
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 33
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 4
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 62
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 42
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 22
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 21
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 20
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 description 19
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 description 19
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 17
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 17
- 101150094145 FAH gene Proteins 0.000 description 16
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 16
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 150000004924 Gefitinib derivatives Chemical class 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 101100334119 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) fahA gene Proteins 0.000 description 13
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150050063 UGDH gene Proteins 0.000 description 12
- AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N atazanavir Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)[C@@H](O)CN(CC=1C=CC(=CC=1)C=1N=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)(C)C)C1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-GASGPIRDSA-N 0.000 description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 12
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 12
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 101150000435 GSS gene Proteins 0.000 description 10
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N Atazanavir Natural products C=1C=C(C=2N=CC=CC=2)C=CC=1CN(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC(O)C(NC(=O)C(NC(=O)OC)C(C)(C)C)CC1=CC=CC=C1 AXRYRYVKAWYZBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010019625 Atazanavir Sulfate Proteins 0.000 description 9
- 229960003277 atazanavir Drugs 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 9
- 229930182851 human metabolite Natural products 0.000 description 9
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 8
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 8
- 230000022814 xenobiotic metabolic process Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 101150067427 por gene Proteins 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 6
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 6
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N nitisinone Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(C(F)(F)F)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O OUBCNLGXQFSTLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 6
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 5
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 5
- 150000008134 glucuronides Chemical class 0.000 description 5
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 229960001721 nitisinone Drugs 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 4
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- YJYPHIXNFHFHND-UHFFFAOYSA-N agomelatine Chemical compound C1=CC=C(CCNC(C)=O)C2=CC(OC)=CC=C21 YJYPHIXNFHFHND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002629 agomelatine Drugs 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 3
- 102100039205 Cytochrome P450 3A4 Human genes 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 101100404276 Mus musculus Por gene Proteins 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 3
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 3
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001853 liver microsome Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 3
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 3
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 108010026925 Cytochrome P-450 CYP2C19 Proteins 0.000 description 2
- 102100029363 Cytochrome P450 2C19 Human genes 0.000 description 2
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 2
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 2
- 101000611053 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-2 Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100040400 Proteasome subunit beta type-2 Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 101001010097 Shigella phage SfV Bactoprenol-linked glucose translocase Proteins 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N Uridine diphospho-D-glucuronic acid Natural products O1C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)C(O)C(O)C1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O HDYANYHVCAPMJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M deoxycholate Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-M 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 210000005161 hepatic lobe Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- LYOKOJQBUZRTMX-UHFFFAOYSA-N 1,3-bis[[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(trifluoromethyl)propan-2-yl]oxy]-2,2-bis[[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(trifluoromethyl)propan-2-yl]oxymethyl]propane Chemical compound FC(F)(F)C(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)OCC(COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)(COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F LYOKOJQBUZRTMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 1
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010074922 Cytochrome P-450 CYP1A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010020070 Cytochrome P-450 CYP2B6 Proteins 0.000 description 1
- 102100026533 Cytochrome P450 1A2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038739 Cytochrome P450 2B6 Human genes 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100029115 Fumarylacetoacetase Human genes 0.000 description 1
- 102000016354 Glucuronosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010092364 Glucuronosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101100118545 Holotrichia diomphalia EGF-like gene Proteins 0.000 description 1
- 101000592466 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001061851 Homo sapiens V(D)J recombination-activating protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 102100033190 Proteasome subunit beta type-4 Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 101150030875 RAB7A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150075516 RAG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101100166144 Staphylococcus aureus cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007271 Substance Withdrawal Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000032001 Tyrosinemia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 102100029591 V(D)J recombination-activating protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108700029631 X-Linked Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 208000013228 adenopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 1
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 231100001129 embryonic lethality Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108010022687 fumarylacetoacetase Proteins 0.000 description 1
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940097042 glucuronate Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010224 hepatic metabolism Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 108700026460 mouse core Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- NCYVXEGFNDZQCU-UHFFFAOYSA-N nikethamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CN=C1 NCYVXEGFNDZQCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011251 protective drug Substances 0.000 description 1
- 101150071858 psmB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150110928 psmb4 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- -1 sulfate ester metabolite of troglitazone Chemical class 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 201000007972 tyrosinemia type I Diseases 0.000 description 1
- HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N udp-glucuronic acid Chemical compound O([P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)[C@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HDYANYHVCAPMJV-USQUEEHTSA-N 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 230000002034 xenobiotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric animals, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
- A01K67/027—New breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knockout animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
- C12N9/0042—NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
- C12Y106/02004—NADPH-hemoprotein reductase (1.6.2.4), i.e. NADP-cytochrome P450-reductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/206—Animal model comprising tissue-specific expression system, e.g. tissue specific expression of transgene, of Cre recombinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01022—UDP-glucose 6-dehydrogenase (1.1.1.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
- C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
- C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)
Abstract
本公开内容提供包含人肝细胞的嵌合非人动物、用于制备包含人肝细胞的嵌合非人动物的方法和利用包含人肝细胞的嵌合非人动物筛选和鉴定可能影响人肝功能和任何其他身体功能的任何类型药物(一般地为小分子药物)的代谢物的方法。
Description
与相关申请的交叉参考
本申请要求2016年6月27日递交的美国临时申请第62/355,102号和2017年5月23日递交的美国临时申请第62/509,942号的优先权和益处。这些申请中每个的全部内容整体引入本文作为参考。
序列表的引入作为参考
2017年6月20日创建并且大小为67 KB的文本文件名“KARL-001-WO_ST25”的内容特此整体引入作为参考。
发明背景
在开发中仅有十分之一的药物被批准用于临床使用。大多数由于在人中无效或毒性而在临床试验期间失败。缺乏准确预测人异生素代谢的实验动物模型是重大限制，这危及人类生命并推动了药物开发成本。因此，迫切需要开发更好的临床前工具。本公开内容通过提供人肝嵌合非人动物模型和使用人肝嵌合非人动物模型来预测人特异性药物代谢的方法解决本领域的这些需要。
发明概述
本公开内容提供用于制备包含人肝细胞的嵌合非人动物的方法，所述方法包括：(a)提供包含NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因减少或缺失，从而导致Por蛋白表达减少或缺乏的非人动物；和(b)将人肝细胞移植到非人动物内。
非人动物可包含减少或缺失Por基因，从而导致Por蛋白表达减少或缺乏。减少或缺失的Por基因可为Por基因的条件性击倒或敲除。减少或缺失的Por基因可为突变、转基因、用外源性物质处理或体细胞基因组工程的结果，包括CRISPR (规律间隔成簇短回文重复序列)系统。体细胞基因组工程包含指导RNA (gRNA)和Caspase 9 (Cas9)。
非人动物可包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的(floxed)等位基因，并且其中非人动物被提供了足以产生Por基因条件性敲除的Cre重组酶。包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的非人动物可被提供至少第一剂编码Cre重组酶的病毒。非人动物可被提供至少第二剂编码Cre重组酶的病毒。使包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的非人动物与表达Cre重组酶的转基因非人动物品系杂交。
在一个方面，本公开内容的方法包括(a)给包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的非人动物提供第一剂编码Cre重组酶的病毒；(b)将人肝细胞移植到所述非人动物内；和(c)给所述非人动物提供第二剂编码Cre重组酶的病毒。步骤(a)和(b)可序贯或同时发生。
非人动物可进一步包含至少一种另外的编码参与药物代谢的酶的基因的减少或缺失。所述至少一种另外的酶可为II相药物酶。在一个方面，非人动物可进一步包含UDP-葡糖6-脱氢酶(UGDH)基因的减少或缺失、谷胱甘肽合成酶(GSS)基因的减少或缺失或其组合。
UGDH基因的减少或缺失可导致UGDH蛋白的表达减少或缺乏。GSS基因的减少或缺失可导致GSS蛋白的表达减少或缺乏。减少或缺失的UGDH基因可为UGDH基因的条件性击倒或敲除。减少或缺失的GSS基因可为GSS基因的条件性击倒或敲除。减少或缺失的UGDH或GSS基因可为突变、转基因、用外源性物质处理或体细胞基因组工程的结果，包括CRISPR (规律间隔成簇短回文重复序列)系统。体细胞基因组工程包含指导RNA (gRNA)和Caspase 9(Cas9)。
非人动物可选自灵长类动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊和猪。在优选方面，非人动物为小鼠。
包含减少或缺失Por基因的非人动物可选自(i) FRG (Fah -/- /Rag2 -/- /Il2rg -/- )非人动物，(ii) 转基因尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)非人动物，其在诱导型启动子，优选地在肝局限性清蛋白启动子下超表达uPA，(iii) 胸苷激酶-NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull (TK-NOG)非人动物，其为在肝局限性启动子控制下具有胸苷激酶转基因表达的免疫缺陷NOG非人动物，(iv) 在肝中表达诱导型Caspase 8的非人动物，和(v) 在肝中表达诱导型Caspase9的非人动物。
本公开内容还提供通过本文公开的任何方法制备的嵌合非人动物、其后代或其一部分，其具有包含人肝细胞的嵌合肝。
嵌合非人动物可为免疫缺陷的。嵌合非人动物基本上缺乏自体肝细胞。人肝细胞可占大于约1%的人嵌合状态的任何百分比，例如嵌合非人动物的嵌合肝中所有肝细胞的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。“非人动物”可为两栖动物、爬行动物、禽类或非人哺乳动物。非人动物可为例如任何非人哺乳动物，例如灵长类动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。在优选方面，非人动物为小鼠。
在一个方面，本公开内容提供用于制备包含人肝细胞的嵌合非人动物的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 给非人动物提供第一剂编码Cre重组酶的病毒或Cre转基因动物，所述非人动物允许其肝被人肝细胞重新住入（repopulate）并包含通过基因组工程或用外源性试剂击倒产生的非功能性NADPH-P450氧化还原酶，例如基因组工程工具如CRISPR/Cas9或NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因，从而产生Por基因的条件性敲除；(b) 将人肝细胞移植到所述非人动物内；和(c) 给所述非人动物提供第二剂编码Cre重组酶的病毒。嵌合非人动物可基本上缺乏自体或内源性肝细胞而是包含人肝细胞。步骤(a)和(b)可序贯或同时发生。任何包含突变和/或转基因的允许其肝被人肝细胞重新住入的非人动物都可与NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的在序列两侧加上loxP位点的或缺失的等位基因或者Por蛋白的功能失活组合使用。在一些方面，包含突变和/或转基因的允许其肝被人肝细胞重新住入的非人动物为(i) FRG (Fah -/- /Rag2 -/- / Il2rg -/- )非人动物，(ii) 转基因uPA非人动物，其在诱导型启动子和/或优选地在肝局限性清蛋白启动子下于肝中超表达尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，(iii) TK-NOG非人动物，其为在肝局限性清蛋白启动子控制下具有胸苷激酶转基因表达的免疫缺陷NOG非人动物，(iv) 在肝中表达诱导型Caspase 8的非人动物，或(v) 在肝中表达诱导型Caspase 9的非人动物，(vi) 在肝细胞特异性清蛋白启动子(alb-TRECK)控制下表达人肝素结合的表皮生长因子样受体(HB-EGF)样受体的非人动物。“非人动物”可为两栖动物、爬行动物、禽类或非人哺乳动物。
在一个方面，本公开内容提供用于制备基本上缺乏鼠肝细胞而是包含人肝细胞的嵌合小鼠的方法，所述方法包括以下步骤：(a) 给小鼠提供第一剂编码Cre重组酶的病毒或Cre转基因小鼠，所述小鼠允许其肝被人肝细胞重新住入并包含通过由CRISPR/Cas9介导的缺失的基因组工程或用外源性试剂或NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因击倒产生的非功能性NADPH-P450氧化还原酶，从而产生Por基因的条件性敲除；(b) 将人肝细胞移植到所述小鼠内；和(c) 给小鼠提供第二剂编码Cre重组酶的病毒。步骤(a)和(b)可序贯或同时发生。任何允许其肝被人肝细胞重新住入的小鼠都可与NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因或者Por基因(分别为蛋白质)的体细胞基因缺失或减少或失活组合使用。在一些方面，允许其肝被人肝细胞重新住入的小鼠为(i) FRG (Fah -/- /Rag2 -/- /Il2rg -/- )小鼠，(ii) 转基因uPA小鼠，其在诱导型启动子，优选地在肝局限性清蛋白启动子下超表达尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，(iii) TK-NOG小鼠，其为在肝局限性清蛋白启动子控制下具有胸苷激酶转基因表达的超免疫缺陷NOG小鼠，(iv) 在肝中表达诱导型Caspase 8的小鼠，(v) 在肝中表达诱导型Caspase 9的小鼠，或(vi) 在肝细胞特异性清蛋白启动子(alb-TRECK)控制下表达人肝素结合的表皮生长因子样受体(HB-EGF)样受体的小鼠。
本公开内容还提供用于筛选和鉴定可能影响人肝功能以及身体任何其他功能的任何类型药物(一般地为小分子药物)的代谢物的方法，包括：(a) 将测试物质施用给本公开内容的嵌合非人动物；(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合非人动物的一个或多个值；和(c) 与在未施用测试物质的嵌合非人动物或没有Por基因缺失的嵌合非人动物或没有人嵌合状态的非人动物中测量的一个或多个值相比较，选择导致(b)中测量的一个或多个值增加或减少的测试物质。优选地，所述一个或多个值选自但不限于测试物质的代谢物、人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、谷丙转氨酶(ALT)水平、谷草转氨酶(AST)水平和总胆红素水平、肌酸酐、血尿素氮(BUN)、肌钙蛋白、血细胞计数、TSH及人和非人器官中病理学的组织学评估。“非人动物”可为两栖动物、爬行动物、禽类或非人哺乳动物。非人动物可为例如任何非人哺乳动物，例如灵长类动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，非人动物为小鼠。
本公开内容进一步提供用于筛选影响人肝功能的物质的方法，包括：(a) 将测试物质施用给本公开内容的嵌合小鼠；(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合小鼠的一个或多个值；和(c) 与在未施用测试物质的嵌合小鼠中测量的一个或多个值相比较，选择导致(b)中测量的一个或多个值增加或减少的测试物质。优选地，所述一个或多个值选自测试物质的代谢物、人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平、人和非人器官中病理学的组织学评估。
本公开内容还提供用于评价测试物质对人肝细胞的毒性的方法，包括：(a) 将测试物质施用给本公开内容的嵌合非人动物；(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合非人动物的一个或多个指标；和(c) 与在未施用测试物质的嵌合非人动物中测量的一个或多个指标相比较，使用(b)中测量的一个或多个指标评价测试物质对人肝细胞的影响。优选地，所述一个或多个指标选自测试物质的代谢物、人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平、人和非人器官毒性的组织学评估的任何一种或多种的增加或减少。“非人动物”可为两栖动物、爬行动物、禽类或非人哺乳动物。非人动物可为例如任何非人哺乳动物，例如灵长类动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选地，非人动物为小鼠。
在整个说明书中，单词 “包含（comprising）”或变化形式例如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”将被理解为意味着包括所陈述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤组，但不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤组。
约可理解为在所陈述的值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%内。除非从上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
尽管本公开内容已连同其详述一起进行描述，但是前述描述是用来举例说明而不是限制本公开内容的范围的，本公开内容的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修饰在以下权利要求的范围内。
本文参考的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利及公开或未公开的美国专利申请都引入作为参考。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请都特此引入作为参考。本文引用的由登记号指示的Genbank和NCBI提交序列（submissions）特此引入作为参考。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献都特此引入作为参考。
附图简述
该专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用时由主管局提供。
以上和进一步特征将根据以下连同附图一起进行的详述而更清楚地理解。
图1A-D显示PIRF品系的产生和鼠P450 (Por)氧化还原酶的缺失。图1A为PIRF品系中缺失的和转基因基因座的图示。图1B为显示静脉内注射表达CRE重组酶的腺病毒(Adeno-Cre)时Por mRNA的qPCR的图表。图1C为Por的一系列免疫染色照片，显示了具有较高中枢周围(cv)和较低门管周围（periportal）(pv)表达的跨肝腺泡梯度。注射Adeno-Cre 时几乎检测不到Por。图1D为蛋白质印迹的照片，显示Por蛋白几乎完全消失。
图2A-E显示缺失鼠P450氧化还原酶(Por)时PIRF品系的人源化和基因表达谱分析。图2A为一系列免疫染色照片，显示注射Adeno-Cre (2.2x1010 pfu/小鼠)一次(1x)或两次(2x)之后人源化PIRF和FRG小鼠的鼠Por (mPor)和人细胞核(hNuc)。使用DAPI在合并的照片进行对比染色。图2B为显示来自有或没有Por缺失的嵌合肝的鼠和人转录组学实验概要的示意图。图2C为显示来源于PIRF模型的肝的鼠细胞色素mRNA的图表。图2D为显示来源于PIRF模型的肝的人细胞色素mRNA的图表。图2E为显示人源化的Por缺失PIRF (Hu-PIRF2x)小鼠与最初的同基因人肝细胞的主要药物代谢性人细胞色素的比较基因表达的图表。基因表达已针对3种分别鼠和人的管家基因(PSMB2、PSMB4和RAB7A resp. Rab7 25 )标准化。PIRF：Por c/c /Il2rg -/- /Rag2 -/- , Fah -/- FRG；Fah -/- /Rag2 -/- /Il2rg -/- 。
图3A-E显示在人源化PIRF小鼠中的异生素代谢。图3A为在静脉内注射吉非替尼（gefitinib）之后24小时内在鼠粪便中使用质谱分析法显示在非人源化PIRF小鼠的鼠P450氧化还原酶(Por)缺失时选择丰富和减少的吉非替尼代谢物的图表。图3B为显示吉非替尼代谢物和已知修饰的示意图。图3C为显示鼠Por缺失的人肝嵌合PIRF (Hu-PIRF 2x)小鼠和对照组显示出最丰富的人代谢物M4的图表。图3D为显示鼠Por缺失的人肝嵌合PIRF (Hu-PIRF 2x)小鼠和对照组显示出人特异性代谢物M28的图表。PIRF：Por c/c /Il2rg -/- /Rag2 -/- , Fah -/- ；FRG；Fah -/- /Rag2 -/- /Il2rg -/- 。*使用非参数Mann-Whitney检验，p <0.05。图3E为显示注射逆转录病毒治疗剂阿扎那韦（atazanavir）之后30分钟PIRF肝匀浆质谱分析法分析的图表。显示了主要人代谢物(M15)。来自阿扎那韦或吉非替尼的代谢物总体丰度在每个样品设定为100%。数据表示为平均值。PIRF：Por c/c /Il2rg -/- /Rag2 -/- /Fah -/- ；FRG：Fah -/- /Rag2 -/- / Il2rg -/- 。*使用非参数Mann-Whitney检验，p <0.05。
图4A-B显示本公开内容示例性探针的示意图。图4A为显示靶向载体和修饰的Por基因座的设计的示意图。图4B为用3种探针进行DNA印迹法的照片，显示ESC的正确靶向。
图5显示来自POR-lacZ等位基因的β-半乳糖苷酶(lacZ)表达。杂合小鼠胚胎和肝的X-gal染色显示来自Por-lacZ等位基因的半乳糖苷酶表达。
图6A显示Il2 rg、Rag2和Fah基因的示意图，显示出gRNA位置(以颜色表示)和用于对小鼠进行基因型分型的引物。图6B显示从基因型分型获得的PCR产物的电泳凝胶。泳道1：使用外部(Fw和Rv)引物的PCR条带。对于Rag2和Fah杂合子，可检测到野生型(箭标)和缺失的(箭头)等位基因。Il2 rg为X连锁的基因，并且没有产生起始（founder）杂合子雌性。Il2 rg、Rag2和Fah的纯合子小鼠分别显示460 bp、530 bp和200 bp的单个缺失等位基因条带。泳道2：使用位于两个gRNA位点之间的外部(Fw或Rev)和内部(Int)引物之一的PCR条带。仅杂合子具有由野生型等位基因形成的清晰PCR条带。Fah和Rag2纯合子显示多个非特异性条带，而Il2 rg纯合子不产生任何条带。
图7A和7B显示Il2-rg、Rag2和Fah基因中的基因组缺失谱。图7A为显示经测序以确定DNA缺失的CRISPR/Cas9注射的条件性Por-/-小鼠受精卵的示意图。图7B为显示经测序以确定氨基酸缺失的CRISPR/Cas9注射的条件性Por-/-小鼠受精卵的示意图。
图8显示使用表达CRE重组酶的腺病毒缺失Por基因时PIRF小鼠肝中的脂质表型。注射腺病毒之后两周，肝细胞开始积累脂质。先前已证实了油红O染色的肝的Por基因(未显示)的分别有效缺失(上图)和表达(下图)。
图9显示非人源化PIRF小鼠中Por表达性肝细胞的克隆扩充。小鼠静脉内注射表达CRE重组酶的腺病毒，从而缺失Por基因(POR fl/fl )。
图10显示用于在人源化和非人源化对照小鼠中进行药物研究的实验方案。在进行药物研究之前，将人源化(Hu)和非人源化PIRF和FRG小鼠注射一次(1x，在移植人肝细胞之前)或两次(2x，在达到高度人嵌合状态之前和之后)。注射的腺病毒表达CRE-重组酶，其导致PIRF中Por基因缺失，但在FRG 品系(对照)中则没有。橙色：鼠药物代谢；白色：抑制的鼠药物代谢；蓝色：人药物代谢。
图11A和11B显示POR的条件性KO也可使用携带CRE重组酶表达盒(清蛋白启动子)的转基因动物产生。图11A显示POR可用对照组以免疫荧光进行检测，其中仅一个等位基因携带在序列两侧加上loxP位点的POR序列，另一个等位基因为野生型POR (POR c/+ )。在图11B中，两个POR等位基因均为在序列两侧加上loxP位点的(POR c/c )，从而导致POR基因的几乎完全缺失和几乎检测不到POR蛋白。POR (绿色)和细胞核(蓝色，DAPI)。
图12描绘人源化PIRF小鼠中P450氧化还原酶的表达。图12A为条形图，显示分别针对人和鼠Gapdh标准化的人和鼠特异性Por的qPCR。图12B为蛋白质印迹图像，显示来自相同人源化小鼠的肝样品的鼠Por和β-肌动蛋白。
图13描绘鼠P450氧化还原酶(Por)缺失时的吉非替尼代谢物。图13A为显示通过腺病毒递送CRE缺失的条形图。图13B为显示通过使Por c/c 与Alb-Cre小鼠杂交从而产生Alb- Cre/Por c/c 品系的条形图。
图14描绘通过使Por c/c 与Alb-Cre转基因小鼠杂交来缺失鼠P450氧化还原酶。图14A为显示完全Por缺失的共焦免疫染色图像。图14B为蛋白质印迹图像，显示来自对照POR c /c 小鼠和3种不同Alb-Cre/Porc/c小鼠的Por蛋白肝样品。图14C为显示鼠Por mRNA水平的qPCR的条形图。
图15为显示粪便中吉非替尼代谢物M28的条形图。
图16为一对条形图，显示hu-PIRF-2x小鼠和对照组的(A)血清和(B)尿中的吉非替尼代谢物M28。
图17为靶向ESC的DNA印迹图像。图17A显示使用5'探针，图17B显示使用3'探针且图17C显示使用新霉素探针。
图18为显示来自注射Adeno-CRE的PIRF小鼠的鼠Por和Gadph的蛋白质印迹图像。
图19A-B为显示来自人源化PIRF小鼠(a)和Por c/c 和(b)Por c/c /Alb-CRE小鼠的鼠Por和Gadph的蛋白质印迹图像。
图20为用腺病毒转导之后4周肝叶的H＆E染色，显示出大泡和微泡脂肪变性。左图为右侧方框区域的更高放大倍数。
图21A-B显示用于通过人源化小鼠中药物代谢酶的基因组工程进行肝特异性缺失的基因治疗载体设计。A. 两载体设计：在腺病毒载体(Ad)中CMV启动子控制下的酿脓链球菌（S. pyogenes）Cas9和表达靶向药物代谢酶的sgRNA和相同构建体上共表达GFP的腺伴随病毒(AAV)。图21B. 单载体设计：金黄色葡萄球菌（S. aureus）Cas9和sgRNA可在相同AAV载体(4.85 kb)上递送。HA，HA表位。
图22显示通过体细胞基因组工程在人源化小鼠中同时缺失鼠P450氧化还原酶(Por)和参与药物代谢的其他鼠酶。人源化FRG小鼠(鼠血清中的人清蛋白> 2 mg/ml)已注射了表达sgRNA的腺伴随病毒(AAV，血清型8)，所述sgRNA靶向鼠Por、UDP-葡糖6-脱氢酶(Ugdh)或谷胱甘肽合成酶(Gss)基因的早期外显子(参见基因治疗载体设计，图21)。在注射表达Cas9的腺病毒(7x109 pfu/Ad/小鼠)之前1周已注射了AAV (2x1011 GC/AAV/小鼠)。对照小鼠仅已注射腺病毒载体(下面行)。显示了代表性人源化区域的连续切片，其具有针对人特异性前清蛋白(Pre-ALB) (运甲状腺素蛋白)、Por、Ugdh、Gss、hALB和GFP的免疫染色，后者由AAV基因治疗载体表达(参见基因治疗载体设计，图21)。条代表50 μm。ALB，清蛋白。
图23显示通过CRISPR/Cas9的por基因组缺失：野生型和人源化FRG小鼠(鼠血清中的人清蛋白> 2 mg/ml)注射了表达sgRNA的两种腺伴随病毒(AAV，血清型8)，所述sgRNA靶向鼠Por的连续早期外显子以及金黄色葡萄球菌Cas9(参见基因治疗载体设计，图21)。注射AAV (2x1011 GC/AAV/小鼠)。对照小鼠仅注射表达Cas9的腺病毒载体(7x109 pfu/Ad/小鼠)。显示了跨越两个附近靶向位点的区域的PCR扩增。在两个靶向位点两者处进行CRISPR/Cas9介导的DNA切割时导致por基因缺失，从而导致产生较小的PCR扩增子。
图24显示具有转基因Alb-CRE和缺失参与药物代谢的其他鼠酶的人源化PIRF小鼠。Por通过CRE的表达缺失，但是不是腺病毒CRE，而是该PIRF小鼠在鼠基因组内携带Alb-CRE序列。人源化之后，小鼠注射了表达sgRNA的腺伴随病毒(AAV，血清型8)，所述sgRNA靶向早期外显子UDP-葡糖6-脱氢酶(Ugdh)或谷胱甘肽合成酶(Gss)基因(参见基因治疗载体设计，图21)。在注射表达Cas9的腺病毒(7x109 GE/Ad/小鼠)之前1周注射AAV (2x1011 GE/AAV/小鼠)。显示了代表性人源化区域的连续切片，其具有针对人特异性前清蛋白(Pre-ALB) (运甲状腺素蛋白)、Por、Ugdh或Gss的免疫染色。条代表50 μm。ALB，清蛋白。
图25A-D显示在具有和不具有Por和Ugdh缺失的人源化和非人源化FRG小鼠肝中检测到的曲格列酮（troglitazone）II相代谢物。在腹膜内(i.p.)注射曲格列酮(600 mg/kg)之后2小时，在人源化肝中检测到肝葡糖醛酸化（glucuronidated）和硫酸化代谢物的百分比。图25A. 人源化FRG小鼠。图25B. 鼠Por和Ugdh缺失之后的人源化FRG小鼠。图25C. 非人源化FRG小鼠。图25D. Por和Ugdh基因缺失的非人源化FRG小鼠。曲格列酮的硫酸酯代谢物以红色显示和葡糖苷酸缀合物以蓝色表示。
发明详述
最近已引入人肝嵌合小鼠来预测人异生素代谢和毒性。尽管其有潜力，但含有扩大的P450细胞色素组的剩余的鼠肝使得难以准确预测人药物代谢。因此，本公开内容提供NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的条件性敲除小鼠，其为所有鼠细胞色素的唯一电子供体，并且如果缺失，则胚胎致死1，从而允许所有鼠细胞色素功能失活。
任何包含突变和/或转基因的允许其肝被人肝细胞重新住入的小鼠都可与NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的条件性敲除等位基因或其他基因组缺失组合使用。在实施方案中，包含突变和/或转基因的允许得其肝被人肝细胞重新住入的小鼠为(i) FRG (Fah -/- / Rag2 -/- /Il2rg -/- )小鼠，(ii) 转基因uPA小鼠，其在诱导型启动子，优选地在肝局限性清蛋白启动子下超表达尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，(iii) TK-NOG小鼠，其为在肝局限性清蛋白启动子控制下具有胸苷激酶转基因表达的免疫缺陷NOG小鼠，(iv) 在肝中表达诱导型Caspase 8的小鼠，(v) 在肝中表达诱导型Caspase 9的小鼠，或(vi) 在肝细胞特异性清蛋白启动子(alb-TRECK)控制下表达人肝素结合的表皮生长因子样受体(HB-EGF)样受体的小鼠。使用这种小鼠和表达CRE的腺病毒或转基因策略，可产生鼠Por基因的几乎完全缺失，从而导致唯一的人体细胞色素代谢。
在uPA-SCID小鼠中(Rhim等人1994; Tateno等人 2004)，小鼠肝细胞切除（ablation）的遗传原因为尿激酶型纤溶酶原激活物（uroplasminogen activator）(uPA)；小鼠处于SCID免疫缺陷背景或Rag2 (或Rag1)-/-和/或Il2rg-/-，均导致移植和移入人肝细胞的能力。
在FRG小鼠中(Azuma等人20077, Bissig等人20075)，小鼠肝细胞切除的遗传原因为富马酰乙酰乙酸水解酶缺乏，并且小鼠肝细胞切除受±NTBC和/或±低酪氨酸膳食控制；小鼠处于Il2rg -/-和Rag2 -/-背景中。FRG小鼠将重组激活基因2 (Rag2)和白细胞介素2受体γ链(Il2rg)中介导免疫缺陷的突变与富马酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因的功能性敲除组合(Azuma等人20077, Bissig等人2007 5)。后一种基因编码酪氨酸分解代谢途径中的酶，并且其突变导致肝细胞中毒性中间体的细胞内积累。与uPA/SCID模型不同，FRG小鼠中肝细胞损伤的开始和严重程度可通过施用和停止服用保护性药物2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1,3-环己二酮(NTBC)来控制，其阻断酪氨酸途径中的上游酶，并且从而防止毒性中间体的积累。
在TK-NOG小鼠中(Hasegawa等人2011)，小鼠肝细胞切除的遗传原因为单纯疱疹病毒胸苷激酶，并且小鼠肝细胞切除受±更昔洛韦（ganciclovir）控制；小鼠处于Il2rg-/-和SCID背景中。利用HSVtk将否则无毒性的GCV转化为毒性中间体的事实，该TK-NOG模型中的小鼠肝细胞切除通过严重免疫缺陷NOG小鼠中1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)的肝特异性表达和施用更昔洛韦(GCV)来实现。
在AFC8小鼠中(Washburn等人2011)，小鼠肝细胞切除的遗传原因为FK508-capsae8融合，并且小鼠肝细胞切除受±AP20187控制；小鼠处于Il2rg-/-和Rag2-/-背景中。
在Alb-TRECK/SCID小鼠中(Zhang等人2015)，小鼠肝细胞切除的遗传原因为人肝素结合的EGF样受体，并且小鼠肝细胞切除受±白喉毒素控制；小鼠处于SCID免疫缺陷背景中。
Sheer和Wilson, 2015比较了迄今最常用模型中各种不同肝人源化模型的主要特征和肝重建过程。该参考文献整体引入作为参考。
本公开内容还提供利用人源化鼠Por缺陷小鼠来预测人药物代谢的方法。在实施方案中，将FRG小鼠和条件性Por-/-小鼠组合以产生PIRF (Por-/- Il2rg-/-/Rag2-/-/ Fah-/-)品系，其允许被人肝细胞重新住入。纯合PIRF小鼠为能育的并且可被人肝细胞重新住入，从而产生高度人嵌合状态(> 80%人)。
人p450细胞色素聚簇含有57个推定有功能的基因和58个假基因，而小鼠细胞色素聚簇则大大扩大，总共占102个推定有功能的基因和88个假基因2。这使得在小鼠中准确预测人药物代谢具有挑战性。另外，肝毒性连同超敏反应/皮肤反应与动物研究的相关性最差，仍然为临床开发中药物的毒性相关终止的最常见原因3。
由于肝为药物代谢的主要器官，所以人肝嵌合小鼠越来越多地用于异生素研究4-6。人源化小鼠的缺点为剩余的鼠肝组织。先前已经表明，即使在可实现高度人嵌合状态的小鼠中，平均人源化率为42%7。为了功能上阻断鼠细胞色素代谢，通过靶向小鼠胚胎干细胞产生NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的条件性(在序列两侧加上loxP位点的外显子3和4)敲除8 (图4)。注射的具有正确靶向的胚胎干细胞的胚泡产生具有Por“首先敲除（knock-out first）”等位基因种系传递的小鼠9。在胚胎和成体肝中证实了使用lacZ表达盒从靶向的Por基因座的表达(图5)。然后将所述小鼠与翻转酶表达品系10进行繁殖，以产生CRE重组酶条件性Por敲除品系。将来自该品系的纯合受精卵注射靶向同时缺失Il2-rg和Rag2和Fah基因的关键外显子(图6)的细菌II型规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9 (CRISPR-Cas9)系统11-13，以产生PIRF品系(图1A)。纯合PIRF小鼠为免疫缺陷的(T-、B-和NK-细胞缺陷)，但为健康和能育的。因为腺病毒基因治疗载体在体内有效转导肝细胞，所以使用编码CRE重组酶的腺病毒(Adeno-CRE)缺失Por基因。将渐增剂量(每只小鼠2.2x108-10)的病毒静脉内注射到PIRF小鼠内。肝中POR mRNA的定量RT-PCR揭示仅在高剂量下有效缺失(图1B)。POR的免疫染色(图1C)证实了这些发现，尽管即使在使用的最高剂量下也可通过蛋白质印迹检测到最小残留信号(图1D)。POR-缺失的PIRF小鼠肝在腺病毒转导之后两周开始积累脂质(图7)，类似于先前报道的肝特异性Por缺失14。
为了产生人特异性P450细胞色素代谢，通过将人肝细胞7,15,16移植到Por缺失的PIRF小鼠内来产生人肝嵌合小鼠。然而，由于在Adeno-Cre处理的PIRF小鼠中观察到残留Por表达性鼠肝细胞的克隆扩充(图8)，一些人源化PIRF (Hu-PIRF)小鼠注射了另外剂量的Adeno-Cre。免疫染色揭示，仅在双重注射的人源化PIRF (Hu-PIRF 2x)小鼠中可实现Por基因的几乎完全缺失(图2A)。
然后实施基因表达谱分析，比较被相同人肝细胞重新住入的有或没有Por缺失的Hu-PIRF小鼠(图2B)。对于一半基因，鼠P450细胞色素的表达明显改变：14个细胞色素上调>1.5倍且18个细胞色素下调< 0.5倍(图2c)。这些鼠细胞色素的表达谱与先前在非人源化小鼠中的行为相匹敌(表1)。表1显示嵌合肝的鼠基因表达谱与先前公开的非人源化小鼠的比较。通过微阵列分析定量条件性(Alb-Cre) Por KO小鼠的基因表达(Weng 等人 2005 JBiol Chem 280, 31686-31698 (2005))。这里，RNA-Seq用于比较用Adeno-Cre和Adeno-GFP转导的人源化肝中的基因表达(图2B)。表1列出了与本文所述数据集相比较的具有数值(变化倍数)的所有先前公开的细胞色素。多个数字代表多组微阵列探针。
表1：嵌合肝的鼠基因表达谱与先前公开的非人源化小鼠的比较。
在相同的嵌合肝中，除了CYP2C18以外，所有人P450细胞色素都在缺失鼠Por时被下调(图2D)。一半的人细胞色素仅略微(<50%)减少，且包括CYP3A4和CYP2C19的另一半更显著下调(> 1.5倍)。
并非所有人细胞色素都在异生素代谢中起重要作用。在美国200种最常转录的药物中，约四分之三通过P450细胞色素代谢，其中CYP3A4/5、2C9、2C19、2D6和1A2贡献了~95%17。在从供体肝分离之后，将来自嵌合肝(Hu-PIRF 2x)的这些人细胞色素聚簇与起源同基因原代肝细胞进行比较。大多数聚簇的表达水平相似，并且这些重要的细胞色素在嵌合肝中稳健表达(图3D)。
为了证实Hu-PIRF小鼠对人药物代谢的效用，研究了抗肺癌和多种其他癌症所使用的表皮生长因子受体抑制剂19吉非替尼的异生素代谢18。吉非替尼主要通过包括CYP3A4和2D6的P450细胞色素系统代谢。最近鉴定了新的吉非替尼代谢物，并且显示在人和小鼠肝微粒体之间存在相当大的差异20。吉非替尼在粪便中排泄，并且小于7%在尿中排泄，与剂量、途径或物种无关21,22。因此，在静脉内注射吉非替尼之后最初24小时期间分析非人源化PIRF小鼠粪便的吉非替尼代谢物。质谱分析法揭示，在Por基因缺失时几种吉非替尼代谢物减少，这意味着这些代谢物的Por-依赖性P450细胞色素缺乏 (图3A)。观察到O-脱甲基吉非替尼(M4，M523595)的最大和最相关减少，其为迄今为止人粪便中最丰富的代谢物，而啮齿类动物产生许多不同代谢物(包括M4)21,22(图3B)。因此，在鼠Por-缺失和Por-表达的人源化和非人源化对照小鼠中分析M4代谢物(图9)。可在鼠Por-缺陷Hu-PIRF小鼠中检测到最高水平的M4，其中人肝细胞优先地将吉非替尼代谢为M4，并且剩余的鼠肝细胞在其药物代谢中被抑制(图3C)。尽管鼠肝细胞优先地产生除M4以外的其他代谢物，但是测量了人特异性代谢物。M28为最丰富的人代谢物，其在非人源化对照小鼠中不能检测到。质谱分析法再次显示了在鼠Por-缺陷Hu-PIRF小鼠中最高水平的这种人特异性代谢物，从而证实了这些小鼠中更像人的代谢(图3D)。还用另一种药物测定了人异生素代谢，然而，这次使用PIRF小鼠的肝匀浆。使用人和小鼠微粒体，先前已经证实阿扎那韦代谢物M15主要为人代谢物(参见Li, F等人,“CYP3A-mediated generation of aldehyde and hydrazine in atazanavirmetabolism.”Drug Metab Dispos 39, 394-401。小鼠静脉内注射逆转录病毒治疗剂，并在注射之后30分钟收获肝。结果显示，与非缺失小鼠相比较，M15在POR-缺失人源化PIRF小鼠中升高到5.4倍(图3E)，从而再次证实在该种新小鼠模型中最优化的人药物代谢。
使用目前的实验动物模型鉴定人代谢物为一项重大挑战。然而，鉴定活性代谢物至关重要，这是因为它们会驱动人药物毒性23,24。本公开内容的新人源化小鼠模型在不妨碍人代谢的情况下抑制鼠药物代谢。鼠Por-缺陷人源化可与其他重新住入模型如转基因uPA小鼠组合使用，并且可更易于鉴定人特异性代谢物，以用于更大的药物安全性益处。
利用本公开内容可能鉴定大多数人或人特异性代谢物，而与毒性无关。可能存在毒性；然而并非总是如此。例如，如这里所示，吉非替尼没有导致任何肝酶升高，但是仍然鉴定出主要人代谢物。
本公开内容提供用于制备基本上缺乏鼠肝细胞而是包含人肝细胞的嵌合小鼠的方法，包括以下步骤：(a) 给小鼠提供第一剂编码Cre重组酶的病毒，所述小鼠包含Il2-rg、Rag2和Fah基因的每一个中的敲除突变和NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因，从而在Il2-rg、Rag2和Fah缺陷小鼠中使用体细胞基因组工程(CRIPSR/Cas9)和基因治疗载体产生Por基因的条件性敲除或por基因的敲除；(b) 将人肝细胞移植到所述小鼠内；和(c) 给小鼠提供第二剂编码Cre重组酶的病毒。步骤(a)和(b)可序贯或同时发生。
条件性敲除POR等位基因也可通过以本领域已知的任何方式递送CRE重组酶来产生。Cre重组酶递送的非限制性实例包括病毒或非病毒基因治疗载体。在一个实施方案中，基因治疗载体为腺病毒。还考虑了Cre重组的遗传递送，例如在细胞、组织或发育特异性启动子下或在诱导型启动子下。实际上，Cre重组酶可在转基因动物的鼠肝中被激活，其中Cre在清蛋白或其他肝特异性启动子下表达(图11)。
本公开内容还提供嵌合小鼠、其后代或其一部分，其具有包含人肝细胞的嵌合肝。优选地，嵌合小鼠、其后代或其一部分通过本公开内容的方法制备。嵌合小鼠可为免疫缺陷的。
在本公开内容中，嵌合小鼠的实例包括小鼠的部分。术语“小鼠的部分”是指例如小鼠来源的组织、体液、细胞及其破裂产物或来自其的提取物(其实例不特别限于它们)。这种组织的实例包括但不特别限于心、肺、肾、肝、胆囊、胰、脾、肠、肌肉、血管、脑、睾丸、卵巢、子宫、胎盘、髓、甲状腺、胸腺和乳腺。体液的实例包括但不特别限于血液、淋巴液和尿。术语“细胞”是指包含在以上组织或体液中的细胞，并且其实例包括通过分离或其培养获得的培养的细胞、精细胞、卵细胞和受精卵。培养的细胞的实例包括原代培养的细胞和确立细胞系的细胞两者。小鼠的部分的实例还包括处于发育阶段(胚胎阶段)的组织、体液和细胞及其破裂产物或提取物。另外，来自本公开内容的小鼠的确立细胞系可使用已知方法确立(Primary Culture Methods for Embryonic Cells (Shin Seikagaku Jikken Koza (NewBiochemical Experimental Lecture Series), Vol. 18, 第125-129页, TOKYO KAGAKUDOZIN CO., LTD., 和Manuals for. Mouse Embryo Manipulation, 第262-264页,Kindai Shuppan))。
本公开内容的小鼠可为免疫缺陷小鼠。本公开内容的免疫缺陷小鼠可用作用于移植人肝细胞的宿主小鼠。“免疫缺陷小鼠”的实例可为不显示针对来自不同动物来源的肝细胞(特别是人肝细胞)的排斥的任何小鼠，并且包括但不限于在T-和B-细胞系中显示缺陷的SCID (重度联合免疫缺陷)小鼠、由于胸腺遗传缺失而丧失T细胞功能的小鼠(NUDE小鼠)和通过经已知基因靶向方法敲除RAG2基因产生的小鼠(RAG2敲除小鼠) (Science, 244:1288-1292, 1989)。
此外，本公开内容提供具有人肝细胞的嵌合小鼠。本公开内容的嵌合小鼠可为免疫学缺陷的。本公开内容的嵌合小鼠可通过将人肝细胞移植到本公开内容的免疫缺陷小鼠内来制备。
作为用于移植的人肝细胞，可使用通过常规方法例如胶原酶灌注方法从正常人肝组织分离的人肝细胞。因此分离的肝细胞也可通过在深低温保藏之后解冻使用。另一方面，可以以新鲜状态使用嵌合小鼠肝细胞，其被定义为通过诸如胶原酶灌注方法的技术自嵌合小鼠肝分离的人肝细胞，在所述嵌合小鼠肝中小鼠肝细胞已被人肝细胞置换，并且深低温保藏的嵌合小鼠肝细胞在解冻之后也是可用的。
这种人肝细胞可经本公开内容的小鼠脾移植到肝中。这种人肝细胞也可经门静脉直接移植。待移植的人肝细胞数目可分布在从约1到2,000,000个细胞的范围内，且优选地分布在从约200,000到1,000,000个细胞的范围内。本公开内容小鼠的性别不受特别限制。同样，本公开内容的小鼠在移植时的日龄（age on days）不受特别限制。当将人肝细胞移植到幼小鼠(早期年龄周数)内时，人肝细胞可随着小鼠生长更活跃地增殖。因此，优选地使用出生之后约0-40日龄的小鼠，并且特别是出生之后约8-40日龄的小鼠。
移植的人肝细胞占大于约1%的人嵌合状态的任何百分比，例如嵌合非人动物的嵌合肝中所有肝细胞的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。
本公开内容进一步提供用于使用本公开内容的嵌合小鼠筛选影响人肝功能的物质的方法。所述方法的实例为包括以下步骤的评价方法：(a) 将测试物质施用给本公开内容的嵌合小鼠；(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合小鼠的一个或多个值；和(c) 与在未施用测试物质的嵌合小鼠的一个或多个值相比较，选择导致(b)中测量的一个或多个值增加或减少的测试物质。
优选地，所述一个或多个值选自人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平、人和非人器官中毒性的组织学评估。
本公开内容方法中的“测试物质”的实例不受特别限制，并且包括天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、抗体、肽和单一化合物例如氨基酸和核酸，以及化合物库、来自基因文库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物的产物、来自海洋生物的提取物、植物提取物、来自原核细胞的提取物、来自真核单细胞的提取物和来自动物细胞的提取物。这些产物可为纯化产物或粗产物，例如植物、动物或微生物提取物。同样，用于产生测试物质的方法不受特别限制。本文待使用的测试物质可为从天然产物分离的、化学或生物化学合成的或者通过遗传工程技术制备的物质。
以上测试物质可适当标记并然后在需要的情况下使用。标记的实例包括放射性标记和荧光标记。除了以上测试样品之外，测试物质的实例还包括多种类型这些测试样品的混合物。
测试样品的实例包括但不限于粪便、尿、血液(和任何血液产品，例如全血、血清和血浆)和组织(例如肝组织)。肝组织可来源于肝样品(例如活组织检查或外植块)，或者可来源于整个完整肝，例如在小鼠已被处死之后收获的肝。
用于给小鼠施用测试物质的方法的实例不受特别限制。取决于待施用的测试物质的类型，这种施用方法可从口服施用或肠胃外施用中进行适当选择，所述肠胃外施用例如皮下、静脉内、局部、经皮和肠(直肠内)施用。
本公开内容进一步提供用于使用本公开内容的嵌合小鼠评价测试物质对人肝细胞的肝毒性的方法。这个方法的实例为包括以下步骤的评价方法：(a) 将测试物质施用给本公开内容的嵌合小鼠；(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合小鼠的一个或多个值；和(c) 与在未施用测试物质的嵌合小鼠中的一个或多个指标相比较，使用(b)中测量的一个或多个指标评价测试物质对人肝细胞的影响。
优选地，所述一个或多个值选自人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平。优选地，所述一个或多个指标选自人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平的任何一种或多种的增加或减少。
编码本公开内容的示例性Por基因的人核酸序列由Genbank登记号：NM_000941.2组成或包含Genbank登记号：NM_000941.2：
编码本公开内容的示例性Por基因的相应人氨基酸序列由Genbank登记号：NP_000932.3组成或包含Genbank登记号：NP_000932.3：
编码本公开内容的示例性Por基因的鼠核酸序列由Genbank登记号：NM_008898.2组成或包含Genbank登记号：NM_008898.2：
编码本公开内容的示例性Por基因的相应鼠氨基酸序列由Genbank登记号：NP_032924.1组成或包含Genbank登记号：NP_032924.1：
编码本公开内容的示例性II2-rg基因的人核酸序列由Genbank登记号：NM_000206.2组成或包含Genbank登记号：NM_000206.2：
编码本公开内容的示例性II2-rg基因的相应人氨基酸序列由Genbank登记号：NP_000197.1组成或包含Genbank登记号：NP_000197.1：
编码本公开内容的示例性II2-rg基因的鼠核酸序列由Genbank登记号：NM_013563.4组成或包含Genbank登记号：NM_013563.4：
编码本公开内容的示例性II2-rg基因的相应鼠氨基酸序列由Genbank登记号：NP_038591.1组成：
编码本公开内容的示例性Rag2基因的人核酸序列由Genbank登记号：NM_000536.3组成或包含Genbank登记号：NM_000536.3：
编码本公开内容的示例性Rag2基因的相应人氨基酸序列由Genbank登记号：NP_000527.2组成或包含Genbank登记号：NP_000527.2：
编码本公开内容的示例性Rag2基因的鼠核酸序列由Genbank登记号：NM_009020.3组成或包含Genbank登记号：NM_009020.3：
编码本公开内容的示例性Rag2基因的相应氨基酸序列由Genbank登记号：NP_033046.1组成的基因组成或包含Genbank登记号：NP_033046.1组成的基因：
编码本公开内容的示例性Fah基因的人核酸序列由Genbank登记号：NM_000137.2组成的基因组成或包含Genbank登记号：NM_000137.2组成的基因：
编码本公开内容的示例性Fah基因的相应人氨基酸序列由Genbank登记号：NP_000128.1组成的基因组成或包含Genbank登记号：NP_000128.1组成的基因：
编码本公开内容的示例性Fah基因的相应鼠氨基酸序列由Genbank登记号：NP_034306.2组成的基因组成或包含Genbank登记号：NP_034306.2组成的基因：
提供以下实施例以更好地举例说明所要求保护的公开内容，且其不应解释为限制本公开内容的范围。就提及的具体材料而言，其仅仅是为了举例说明起见的，而非意图限制本公开内容。本领域的技术人员可在不运用有创造性的能力和不背离本公开内容范围的情况下开发等同的手段或反应物。
实施例
实施例1：Por-在序列两侧加上loxP位点的小鼠品系的产生
Por首先敲除靶向载体购自National Institutes of Health (NIH) Knock-OutMouse Program (KOMP)(图4A)。载体用AsisI限制酶线性化，并通过Baylor College ofMedicine的小鼠胚胎干细胞中心(Mouse Embryonic Stem Cell Core)将DNA电穿孔到Jm8A3小鼠胚胎干细胞(ESC)中(Pettitt, S.J.等人“Agouti C57BL/6N embryonic stemcells for mouse genetic resources.”Nat Methods 6, 493-495 (2009))。使用新霉素抗性选择整合的克隆。按照制造商的说明书，用NSiI限制酶消化ESC克隆的DNA，并使用DIG非同位素检测系统(Roche Applied Biosciences)通过DNA印迹法筛选位点特异性整合(图17中的全部印迹)。使用以下引物组合成在载体同源臂外部结合的500 bp大小的5'和3'探针。
通过Baylor College of Medicine的基因工程小鼠中心(GeneticallyEngineered Mouse Core)将正确靶向的ESC细胞注射入C57/BL胚泡中。使雄性嵌合体与C57/BL白化雌性(Taconic)进行繁殖以获得靶向的ESC的种系传递。为了去除侧翼为FRT的LacZ和新霉素盒并产生条件性POR敲除品系，使小鼠与Rosa26-FLPe品系杂交(Farley,F.W., Soriano, P., Steffen, L.S. & Dymecki, S.M.“Widespread recombinaseexpression using FLPeR (flipper) mice.” Genesis 28, 106-110(2000))。基因型分型由Transnetyx (Cordova, TN)进行。
实施例2：X-Gal染色
将胚胎和新鲜肝切片在4% PFA中于4℃固定1小时，并在X-Gal冲洗缓冲液(PBS1x, 含0.02% Igepal和0.01%脱氧胆酸盐)中洗涤2x30分钟，随后与X-Gal染色溶液(PBS1x, 含5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6, 0.02% Igepal, 0.01%脱氧胆酸盐, 2 mMMgCl2, 5 mM EGTA和1 mg/ml新鲜X-Gal)温育过夜。将样品在4% PFA中于4℃后固定（post-fixed）过夜。
实施例3：PIRF (Por c-/c -/Il2rg-/-/Rag2-/-/Fah-/-)小鼠品系的产生
使用两种不同在线工具(crispr.mit.edu和CORMID)选择了靶向Rag2、Il2-rg或Fah基因关键外显子的6种gRNA序列(图1A、图6和图7) (Cradick, T.J., Qiu, P., Lee,C.M., Fine, E.J. & Bao, G.“COSMID: A Web-based Tool for Identifying andValidating CRISPR/Cas Off-target Sites.”Molecular therapy. Nucleic acids 3,e214 (2014))。将互补寡核苷酸退火并使用标准分子克隆技术，用限制酶BsaI (NEB)和T4DNA连接酶(NEB)连接到DR274载体(Addgene质粒#42250)中(Hwang, W.Y. 等人“Efficientgenome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.”Nat Biotechnol 31,227-229 (2013))。使用标准分子克隆技术，将T7细菌启动子序列插入Cas9转录起始位点上游的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体(Addgene质粒＃42230)中(Cong, L. 等人“Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.”Science 339, 819-823(2013))。使用DraI (NEB)切割DR274载体，并使用Zymoclean Gel DNA回收试剂盒（Recovery Kit）(Zymo, Cat#11-301)进行凝胶纯化。根据制造商的说明书，使用MEGAshortscript T7转录试剂盒(LifeTechnologies, AM1354)进行sgRNA的体外转录。使用RNA Clean＆Concentrator-5 (Zymo, R1015)纯化所得的RNA，并在无RNA酶的水中洗脱。合成通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行证实。pX330 (含有T7启动子)用NcoI和NotI消化，并进行凝胶纯化。根据制造商的规程，使用mMessage mMachine T7 ULTRA试剂盒(life techAM1345)从消化的pX330-T7载体合成Cas9 mRNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳(MOPS缓冲液中的1%琼脂糖和6.6%甲醛)证实聚腺苷酸化。
来自Por c/c小鼠的受精卵注射了酿脓链球菌Cas9 mRNA (60 ng/μl)和6种gRNA(每种15 ng/μL)。将所有有生活力的受精卵植入3只假孕雌性内。为了检测缺失的区域，断奶之后使用以下引物对所有23只幼崽进行基因型分型：
进一步的后代基因型分型由Transnetyx (Cordova, TN)进行。
实施例4：PIRF小鼠的人源化
如最初针对小鼠肝细胞所述，通过脾脏注射将肝细胞(3x106/小鼠)移植到PIRF小鼠的鼠肝中(Ponder, K.P. 等人“Mouse hepatocytes migrate to liver parenchymaand function indefinitely after intrasplenic transplantation.”Proc Natl Acad Sci U S A 88, 1217-1221 (1991))。简而言之，通过中腹（midabdominal）切口打开腹腔，并将在体积100 μl的PBS中的3x106个人肝细胞注射到脾中。移植之后立即通过以下步骤从饮用水停止服用药物尼替西农（nitisinone）(NTBC)来施加朝向所移植的人肝细胞的选择压力：在完全停止药物之前，以集落维持剂量(100% = 7.5 mg/l)的2天为25%，然后2天为12%和最后2天为6% (Bissig, K.D. 等人“Human liver chimeric mice provide a modelfor hepatitis B and C virus infection and treatment.”The Journal of clinical investigation 120, 924-930 (2010))。将具有临床症状(弓身姿势、嗜睡、体重减轻等)的小鼠放回100%尼替西农几天，之后再次如上所述断药。为了确定人嵌合状态的程度，测量了鼠血液中的人清蛋白(ELISA, Bethyl实验室)，先前已经显示人清蛋白水平与通过人肝细胞免疫染色评估的人嵌合状态水平相关(Bissig, K.D. 等人 (2010))。仅进一步使用具有> 70%人嵌合状态的小鼠。在有说明的场合，在肝细胞移植之前24小时和/或当达到高度人嵌合状态(> 70%)时，一些PIRF小鼠静脉内注射100 μl编码在CMV启动子下的CRE重组酶的腺病毒(Ad5 CMV-Cre，2.3x1011 pfu/ml，由Baylor College of Medicine的VectorDevelopment Laboratory提供)。可获得的肝细胞供体信息在表2中给出。所有动物实验均经Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准。由于手术后并发症较少，所有用于人源化的动物(包括对照)均为雌性。
实施例5：qPCR
使用Purelink RNA小提试剂盒（mini kit）(Invitrogen)从新鲜冷冻组织样品分离总mRNA。2 μg总mRNA使用qScript cDNA超混液（supermix）(Quanta Biosciences)进行逆转录，并使用20 ng cDNA进行qPCR反应，反应用Perfecta SYBR Green Fast Mix (QuantaBiosciences)进行并在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosciences)上进行分析。以下引物用于PIRF小鼠样品的Por mRNA扩增：
对于人源化的PIRF小鼠肝样品，小鼠Por和人POR使用以下引物组扩增：
使用以下引物将每个样品针对作为内部对照基因的Gapdh/GADPH进行标准化：
实施例6：RNA-Seq文库
使用从所有7个肝叶取样的新鲜冷冻肝组织提取的总RNA进行全转录组RNA测序(RNA-Seq)。使用Purelink RNA小提试剂盒(Invitrogen)分离总RNA。根据制造商的建议使用TrueSeq Stranded mRNA LT试剂盒(Illumina)从总RNA产生文库。文库在NextSeq 500测序仪上测序。每个样品平均读数（read）为1700万。使用应用于组合的人和小鼠NCBI Refseq(3/21/16)转录组的读数比对软件（aligner）Bowtie253，用RSEM52 (版本1.2.17)计算RNA-Seq TPM表达值。RNA测序数据可从European Nucleotide Archive，ENA登记号PRJEB14714获得。如果其中一个实验组达到> 20 TPM，则仅比较低丰度细胞色素(人< 20 TPM且小鼠<20 TPM)。基因表达已针对3种人管家基因及其鼠对应物(PSMB2、PSMB4、RAB7A和VPS2929；Psmb2、Psmb4、Rab7和Vps29)54进行标准化。RNA-Seq数据可从European NucleotideArchive，ENA登记码PRJEB14714获得。
实施例7：蛋白质印迹
如先前所述进行蛋白质印迹(Bissig-Choisat, B. 等人“Development andrescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model.”Nature communications 6, 7339 (2015))。将来自骤冻肝的组织在含有蛋白酶抑制剂(Roche, cat# 04693159001)的RIPA缓冲液(Sigma, cat# R0278-50 ml)中匀浆。将30 μg总蛋白在NuPAGE 4-12% Bis Tris Gel (Invitrogen, cat# NP0336BOX)中电泳，并转移至PVDF膜(Millipore, cat# IPVH00010)。印迹然后在5%牛奶中封闭，随后为第一抗体温育。兔抗-Por (Abcam cat# ab13513)或小鼠抗-β-肌动蛋白(Sigma cat# A1978)分别稀释1:1,000和1:3,000(图18和图19中的全部印迹)。第二抗体为分别以1:10,000和1:50,000使用的驴抗兔IgG/HRP和驴抗小鼠IgG/HRP (Jackson Immunoresearch Labs, cat# 711-035-152和711-035-150)。使用Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent(General Electric Healthcare Life Sciences, cat# RPN2106)对膜成像。
实施例8：免疫组织化学
将来自深低温保藏组织块的10 μm切片用3% PFA固定15分钟，并在4℃与以下第一抗体温育过夜：在含有0.2% Triton X-100和0.5% BSA的PBS中1:500稀释的抗-Por(Abcam, cat# ab13513)、1:250稀释的抗人细胞核(EMD Millipore, cat# MAB1281)。将第二抗体(1:1,000 Alexa-fluor缀合的, Molecular Probes)在室温下于相同缓冲液中温育60分钟。切片用Vectashield plus DAPI (Vector Labs)封固。
实施例9：小鼠管理
将所有小鼠(6-10个月龄，人源化或非人源化的)保持在标准的12小时暗/光周期下，并且随意提供水和食物。所有动物实验均经Baylor College of MedicineInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)批准。
实施例10：质谱分析法的样品制备
一组小鼠用吉非替尼(10 mg/kg)处理(i.v.)并分别安置于代谢笼中用于16小时粪便收集。将粪便样品称重并在水中匀浆(100 mg粪便在1,000 μl H2O中)。接着，将300 μl甲醇加入到100 μl所得的混合物中，随后以15,000 g离心20分钟。将上清液转移至新的Eppendorf小瓶中进行二次离心(15,000 g进行20分钟)。阿戈美拉汀（agomelatine）的最终浓度为2 μM。将每个上清液转移至自动取样器小瓶用于进行分析(如下所述)。
对于肝中的阿扎那韦代谢，在阿扎那韦处理(i.v., 30 mg/kg)之后30分钟收获肝样品。简言之，将肝称重并在含有内标阿戈美拉汀的水/MeOH中匀浆[100 mg肝在300 ulH2O/MeOH中(v/v 3:1)]。接着，将300 μl甲醇加入到100 μl所得的混合物中，随后以15,000g离心20分钟。将上清液转移至新的Eppendorf小瓶中进行二次离心(15,000 g进行20分钟)。样品中阿戈美拉汀的最终浓度为2 μM。将每个上清液转移至自动取样器小瓶中。将5 μl每种制备的样品注射入组合了超高效液相层析(UHPLC)和四极飞行时间质谱分析法(QTOFMS)的系统用于进行分析。
实施例11：质谱分析法(UHPLC-QTOFMS分析)
使用配备有100 mm x 2.7 mm (Agilent XDB C18)柱的1260 Infinity BinaryLC System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)分离来自吉非替尼和阿扎那韦的代谢物。柱温度保持在40℃。流速为0.3 mL/分钟，在15-分钟运行中的梯度分布在从含有0.1%甲酸的2%到98%含水乙腈的范围内。四极飞行时间质谱分析法(QTOFMS)由电喷射离子化以正模式操作。应用超高纯的氮作为干燥气体(12 L/分钟)和碰撞气体。干燥气体温度设定在325℃且雾化器压力保持在35 psi。毛细管电压设定在3.5 kV。在质谱分析法期间，实时质量校正和准确质量通过在正模式下以m/z 121.0508、922.0098连续测量标准参考离子来实现。通过MassHunter Workstation数据采集软件(Agilent, Santa Clara, CA)以棒状图（centroid）和轮廓图（profile）格式从m/z 50至1000采集质量色谱图（Masschromatograms）和质谱。采集速率设定在每秒1.5个谱。用于这个研究的方法已通过先前对人肝微粒体中吉非替尼代谢的研究得到证实39。同时，在样品运行过程中每10个样品进行质量控制样品。由于不可获得真正的代谢物化合物，所以代谢物鉴定基于其精确质量和MS/MS片段。在Qualitative Analysis software (Agilent, Santa Clara, CA)上进行代谢物的色谱图和相对丰度。基于每种代谢物的完整峰面积评价相对丰度。
实施例12：统计学
实验用样本大小通过估计的组间差异和高度人源化小鼠的可用性来确定。既没有在分配给实验组之前进行动物随机化，也没有进行实验组的盲法。使用PRISM版本6.0软件(Graph Pad软件)，使用Mann-Whitney检验或ANOVA进行统计学分析。在p-值<0.05 (*)的情况下假设有统计显著性。除非另外指出，否则图中的条代表平均值±SEM。组大小(N)代表生物样本大小。
实施例13：用于肝细胞重新住入的新小鼠模型的产生
为了功能上阻断鼠细胞色素代谢，通过靶向小鼠胚胎干细胞28产生NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因的条件性(在序列两侧加上loxP位点的外显子3和4)敲除(图4)。注射的具有正确靶向的胚胎干细胞的胚泡产生具有Por“首先敲除（knock-out first）”等位基因种系传递的嵌合体29。证实了在胚胎和成体肝中使用lacZ表达盒从靶向的Por基因座的表达(图5)。接下来将所述小鼠与翻转酶表达品系30进行繁殖，以产生CRE重组酶条件性Por敲除品系（Por c/c ）。将来自该品系的纯合受精卵注射靶向同时缺失Il2-rg、Rag2和Fah基因的关键外显子(图6和图7)的细菌II型规律间隔成簇短回文重复序列/Cas9 (CRISPR-Cas9)系统31,32,33，以产生PIRF品系(图1A)。纯合PIRF小鼠因而为免疫缺陷的，缺乏T、B和NK细胞，但为健康和能育的。因为腺病毒基因治疗载体在体内有效转导肝细胞，所以使用编码CRE重组酶的腺病毒(Adeno-CRE)缺失Por基因。将渐增剂量(每只小鼠2.2x108-10)的病毒静脉内注射到PIRF小鼠内。肝中Por mRNA的定量RT-PCR揭示仅在高剂量腺病毒下有效缺失(图1B)。Por的免疫染色(图1C)证实了这些发现，尽管即使在使用的最高剂量下也可通过蛋白质印迹检测到最小残留信号(图1D)。Por-缺失的PIRF小鼠肝在腺病毒转导之后约两周开始积累脂质(图2)，但与免疫感受态Alb-Cre/Por c/c 品系25,27形成对照的是，没有浸润和缺乏坏死(图20)。然而，残留的Por表达性肝细胞比起富含脂质的Por-缺失肝细胞来具有生长优势，并且通过免疫染色在腺病毒转导之后4周可检测到少数Por表达性细胞的克隆扩充(图9)。
实施例14：人源化PIRF小鼠的表征
使用PIRF品系产生人肝嵌合小鼠5,20,34。为了确保P450细胞色素代谢为人特异性的，我们在人肝细胞移植之前注射了Adeno-Cre (2.3x1010 pfu/小鼠)，并且在一些高度人源化的PIRF (Hu-PIRF)小鼠中注射了另外剂量的Adeno-Cre。免疫染色揭示，仅在双重注射的人源化PIRF (Hu-PIRF 2x)小鼠中可实现Por基因的几乎完全缺失(图2A)。定量PCR和蛋白质印迹证实了在腺病毒递送CRE时鼠Por大量减少(图12)。进行基因表达谱分析，以比较注射了Adeno-CRE (Hu-PIRF 2x)或Adeno-GFP的被人肝细胞重新住入的PIRF小鼠(Hu-PIRF)(图2B)。两组均用来自相同肝细胞供体的人肝细胞重新住入(表2)以避免个体间差异。
表2：用于本公开内容的人肝细胞供体特征
| 肝细胞 | 年龄* | 性别 | 种族 | BMI | 死亡原因 | 在本研究中的使用 |
| #1 | 24 | 男性 | 非裔美国人 | 20.3 | 缺氧 | RNAseq (嵌合小鼠, 肝细胞) |
| #2 | 2 | 女性 | 非裔美国人 | 19.6 | 头部创伤 | RNAseq (嵌合小鼠, 肝细胞) |
| #3 | 45 | 女性 | 高加索人 | 20.8 | 缺氧症 | RNAseq (嵌合小鼠) |
| #4 | 1.2 | 女性 | 高加索人 | 20.8 | 头部创伤 | 吉非替尼代谢物 |
| #5 | 18 | 男性 | 高加索人 | 24.3 | 心血管的 | ATV代谢物 |
* 以岁表示。
在Por缺失之后分析的38个基因中有27个明显改变了鼠P450细胞色素的表达(图2C)：24个细胞色素显著上调(1.5-12.5倍)且3个细胞色素显著下调(0.5-0.3倍)。这些鼠细胞色素的表达谱大体上与来自先前在非人源化的Por-缺陷小鼠中的工作的那些相匹敌(表1)35。在相同嵌合肝的人部分，人P450细胞色素在鼠Por缺失时改变较小(图2D)。一半的人细胞色素仅略微改变(0.5-1.5倍变化)，而另一半则中等上调(1.5-2.4倍)。
并非所有人细胞色素都在异生素代谢中起重要作用。在美国200种最常开处方的药物中，约四分之三通过P450细胞色素代谢，其中CYP3A4/5、2C9、2C19、2D6和1A2贡献了~95%36。将来自嵌合肝(Hu-PIRF 2x)的这些人细胞色素聚簇与起源同基因原代肝细胞进行比较。对于这个比较，两种供体肝细胞(表2)和相应的人(同基因)肝嵌合小鼠(N = 6)。大多数聚簇的表达水平相似，并且这些重要的细胞色素都在嵌合肝中稳健表达(图2E)。有趣的是，一些人聚簇(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP3A4)在嵌合肝中的表达水平甚至高于在原代人肝细胞中。
实施例15：人源化PIRF小鼠的异生素代谢
为了证实Hu-PIRF小鼠的人药物代谢，使用了抗肺癌和多种其他瘤形成所使用的表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼37的异生素代谢38。吉非替尼主要通过包括CYP3A4和2D6的P450细胞色素系统代谢。吉非替尼代谢物显示在人和小鼠肝微粒体之间存在相当大的差异39，但与剂量、途径或物种无关，吉非替尼主要在粪便中排泄（在尿中小于7%）40,41。然后分析了在静脉内注射吉非替尼之后最初24小时期间非人源化PIRF小鼠粪便的吉非替尼代谢物。
质谱分析法揭示，在Por基因缺失时几种吉非替尼代谢物减少，这意味着这些代谢物的Por-依赖性P450细胞色素缺乏 (图3A和图13A)。由于一些代谢物没有显著改变，所以测试了残留Por活性决定着持续性鼠P450细胞色素代谢系统的可能性。使Por c/c 品系与在清蛋白启动子下表达CRE的转基因小鼠杂交。对Alb-CRE/Por c/c 动物肝中的Por蛋白进行有效缺失(图14)；然而，吉非替尼注射之后形成的代谢谱与具有Por的腺病毒缺失的PIRF小鼠相匹敌(图13)。这个结果相似性表明吉非替尼具有P450-依赖性和非依赖性药物代谢两者。
观察到O-脱甲基吉非替尼(M4，M523595)的最大和最相关减少，其为迄今为止人粪便中最丰富的代谢物。除M4之外，啮齿类动物产生许多不同代谢物40,41(图3B)，从而分析了在鼠Por-缺失和Por-表达的人源化和非人源化对照小鼠中的M4代谢物(图10)。在鼠Por-缺陷Hu-PIRF小鼠中检测到最高水平的M4，其中使用的人肝细胞优先地将吉非替尼代谢为M4，并且剩余的鼠肝细胞在其药物代谢中被抑制(图3C)。接下来，为了测量其他人特异性代谢物。最丰富的人代谢物为M28，其在非人源化对照小鼠中根本不能检测到。质谱分析法再次显示了在鼠Por-缺陷Hu-PIRF小鼠中最高水平的这种人特异性代谢物（图3D和图15），从而证实这些小鼠显示更类似于人的肝代谢。
Por-缺陷Hu-PIRF小鼠为用于药物代谢研究的新模型系统，并因此用于分析不同的身体区室，例如，血清(注射之后1小时)和尿的这些关键吉非替尼代谢物。M4在尿中不能检测到并且血清中大量减少(Hu-PIRF小鼠中为1/23)，而M28在Hu-PIRF小鼠的尿和血清两者中均可以较低浓度检测到(图16A和图16B)。尽管在两个区室中均以较低水平存在，但M28再现了在粪便中观察到的相对丰度(图3C)。这些发现证实吉非替尼代谢物主要通过粪便排泄40, 41。
使用PIRF小鼠的肝匀浆证实人异生素代谢。测试了用于治疗人免疫缺陷病毒的抗逆转录病毒药物(蛋白酶抑制剂)阿扎那韦。先前在人和小鼠微粒体中的研究证实，阿扎那韦代谢物M15为主要人代谢物42。为了确定人源化PIRF小鼠中的M15水平，PIRF小鼠静脉内注射阿扎那韦，并在注射之后30分钟收获其肝。在Por-缺失的人源化PIRF小鼠中的M15水平为在非缺失小鼠中观察到的那些的5.4倍(图3E)，从而再次表明这些小鼠像人一样代谢药物。
实施例16：UDP-葡糖6-脱氢酶(UGDH)的缺失
UDP-葡糖6-脱氢酶(UGDH)的缺失导致UDP-葡糖醛酸的耗尽，后者为所有UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)的底物。UGT使肝中的亲脂性药物葡糖醛酸化(II相)，并且从而有助于药物在肝中的生物转化；葡糖醛酸化的药物更加极性(亲水)并且更易于排泄。UGDH的缺失为胚胎致死性的，并且因此需要条件性地或通过体细胞基因组工程缺失，类似于POR。曲格列酮被作为抗糖尿病药物开发，但由于肝毒性而退出市场。有趣的是，小鼠和人有差别地代谢药物，这意味着人主要产生硫酸酯代谢物(主要循环代谢物)，而曲格列酮的葡糖苷酸缀合物(glucuronide conjugates)在人中较不普遍。与小鼠形成对照的是，小鼠主要产生葡糖苷酸缀合物。因此，曲格列酮提供了证实所述方法除了Por缺失和人源化之外通过在人肝嵌合小鼠中缺失UDP-葡糖6-脱氢酶(UGDH)来抑制UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)的有效性的机会。
谷胱甘肽合成酶(GSS)催化谷胱甘肽生物合成的第二步。谷胱甘肽为谷胱甘肽S-转移酶(GST)的底物，后者使该分子与亲脂性药物缀合(conjugates) (II相)，并且从而有助于药物在肝中的生物转化。
体细胞基因组工程用于同时缺失鼠P450氧化还原酶(Por)和参与人源化小鼠内药物代谢的其他鼠酶。人源化FRG小鼠(鼠血清中的人清蛋白> 2 mg/ml)注射了表达sgRNA的腺伴随病毒(AAV，血清型8)，所述sgRNA靶向鼠Por、UDP-葡糖6-脱氢酶(Ugdh)或谷胱甘肽合成酶(Gss)基因的早期外显子(参见基因治疗载体设计，图21)。在注射表达Cas9的腺病毒(7x109 pfu/Ad/小鼠)之前1周注射了AAV (2x1011 GC/AAV/小鼠)。对照小鼠仅注射腺病毒载体(图22，下面行)。结果显示鼠por以及ugdh和gss基因的缺失。当查看DNA (图23)和蛋白质水平(图22)时，由CRISPR/Cas9击倒人源化小鼠的鼠por是显著的，但不如用loxP/CRE系统观察到的击倒那么有效。同样，特别是在FRG小鼠中的por缺失与其他两个基因(ugdh和gss)的缺失相互独立，这是因为它们的sgRNA (引导分子)均处于不同AAV载体上。然而，免疫染色(图22)证实相当大量的细胞具有por和gss缺失(图22)，而ugdh缺失的效率较低。
使用具有转基因Alb-CRE和参与药物代谢的其他鼠酶缺失的人源化PIRF小鼠。Por通过CRE的表达缺失，但是不是腺病毒CRE，而是该PIRF小鼠在鼠基因组内携带Alb-CRE序列。这些小鼠有效地被人肝细胞重新住入，如鼠血液中的人特异性清蛋白> 2 mg/ml和嵌合肝中的运甲状腺素蛋白(前清蛋白)染色所证明的那样(图24)。由于清蛋白启动子已经在肝的胚胎阶段后期表达，所以在这些嵌合小鼠的肝有效地缺失鼠por。同样，在这些人源化PIRF小鼠中，除了por之外，还可缺失gss和ugdh(图23)。
实施例17：曲格列酮代谢物的分析
分析了在有和没有Por和Ugdh缺失的人源化和非人源化FRG小鼠肝中的曲格列酮代谢物(在i.p.注射600 mg/kg曲格列酮之后2小时)。对照小鼠的非人源化肝具有比人或人源化PIRF小鼠高得多的量的葡糖苷酸缀合物(图24)。此外，在非人源化和人源化PIRF小鼠中，ugdh和por缺失时葡糖苷酸缀合物显著减少。该数据证实，ugdh的缺失还导致人肝嵌合肝中UGT的功能性损伤或取消。
本公开内容提供了适合于人药物代谢的下一代人源化小鼠模型，其具有最小的来自鼠P450细胞色素的干扰。比较了人源化PIRF小鼠和“正常”人源化FRG小鼠之间两种不同药物的人代谢物的产生。分析揭示人源化PIRF小鼠的鼠粪便和肝匀浆中人代谢物的浓度高于在FRG小鼠中的，并且证实这些小鼠具有人源化药物代谢。用于这个研究的PIRF和FRG品系处于混合的(C57B和129S)遗传背景中。除了与两种先前公开的FRG小鼠品系5,7在背景中的潜在差异之外，我们的CRISPR/Cas9产生的敲除品系不表达任何转基因，例如使广泛范围的氨基糖苷类抗生素失活的新霉素磷酸转移酶。该模型系统用于早期检测活性代谢物，并且是阻断大量且混杂的药物代谢鼠酶聚簇的精巧方式。除了本文提供的新小鼠模型之外，本公开内容还提供(a) 在多个器官的组合如肠和肝或者肺和肝中敲除Por将是所期望的，(b) 其他药物代谢酶的另外缺失和/或更有效地实现Por缺失。然而，使用表达Cre重组酶的转基因小鼠将仍然需要另一个杂交步骤成为四倍转基因(PIRF)小鼠，并且早期器官特异性缺失可能不会产生适合于异种移植（xenotransplantation）的稳健品系。
总之，本公开内容提供了新小鼠模型，其将人嵌合状态与通过Por缺失的所有鼠细胞色素的功能性缺失相组合。这种鼠Por-缺陷人源化可与其他重新住入模型组合使用，例如转基因uPA小鼠11,21。在两个不同身体区室中对两种不同药物的研究证实，人源化PIRF小鼠的研究有效地鉴定了人代谢物。
参考文献
Claims (16)
1.一种用于制备包含人肝细胞的嵌合小鼠的方法，所述方法包括：
(a) 提供包含NADPH-P450氧化还原酶(Por)基因减少或缺失，从而导致Por蛋白表达减少或缺乏的Fah-/- Rag2-/- IL-2Rg-/-小鼠；和
(b) 将人肝细胞移植到所述小鼠内，其中所述人肝细胞占嵌合小鼠肝中所有肝细胞的至少70%。
2.权利要求1的方法，其中所述减少或缺失的Por基因为Por基因的条件性敲低或敲除或为突变、转基因、用外源性物质处理或体细胞基因组工程的结果。
3.权利要求2的方法，其中所述体细胞基因组工程包含指导RNA (gRNA)和Cas 9。
4.权利要求1的方法，其中所述小鼠包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因，并且其中所述小鼠被提供了足以产生Por基因条件性敲除的Cre重组酶。
5.权利要求4的方法，其中所述包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的小鼠被提供至少第一剂编码Cre重组酶的病毒。
6.权利要求5的方法，其中所述小鼠被提供至少第二剂编码Cre重组酶的病毒。
7.权利要求1的方法，包括：
(a) 给包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的小鼠提供第一剂编码Cre重组酶的病毒；
(b) 将人肝细胞移植到所述小鼠内；和
(c) 给所述小鼠提供第二剂编码Cre重组酶的病毒。
8.权利要求7的方法，其中步骤(a)和(b)序贯发生或同时发生。
9.权利要求4的方法，其中使所述包含Por基因的在序列两侧加上loxP位点的等位基因的小鼠与表达Cre重组酶的转基因小鼠品系杂交。
10.权利要求1的方法，其中所述小鼠进一步包含UDP-葡糖6-脱氢酶(UGDH)基因或谷胱甘肽合成酶(GSS)基因的减少或缺失。
11.通过根据权利要求1-10中任一项的方法制备的具有包含人肝细胞的肝的嵌合小鼠的破裂产物或来自其的提取物。
12.权利要求11的具有包含人肝细胞的肝的嵌合小鼠的破裂产物或来自其的提取物，其中所述人肝细胞占嵌合肝中所有肝细胞的至少80%、至少90%、至少95%或至少99%。
13.一种用于筛选影响人肝功能的物质的方法，包括：
(a) 将测试物质施用给通过权利要求1-10中任一项的方法制备的嵌合小鼠；
(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合小鼠的一个或多个值；和
(c) 与在未施用测试物质的嵌合小鼠中测量的一个或多个值相比较，选择导致(b)中测量的一个或多个值增加或减少的测试物质。
14.权利要求13的方法，其中所述一个或多个值选自测试物质的代谢物、人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、谷丙转氨酶(ALT)水平、谷草转氨酶(AST)水平和总胆红素水平、肌酸酐、血尿素氮(BUN)、肌钙蛋白、血细胞计数、TSH及人和非人器官中病理学的组织学评估。
15.一种用于在嵌合小鼠中评价测试物质对人肝细胞和任何其他非人器官的毒性的方法，包括：
(a) 将测试物质施用给通过权利要求1-10中任一项的方法制备的嵌合小鼠；
(b) 测量(a)中施用了测试物质的嵌合小鼠的一个或多个指标；和
(c) 与在未施用测试物质的嵌合小鼠中测量的一个或多个指标相比较，通过测定(b)中测量的一个或多个指标中的增加或减少评价测试物质对人肝细胞的影响。
16.权利要求15的方法，其中所述一个或多个指标选自测试物质的代谢物、人清蛋白浓度、体重曲线、肝重与体重比率、总清蛋白水平、总蛋白水平、ALT水平、AST水平和总胆红素水平、肌酸酐、BUN、肌钙蛋白、血细胞计数、TSH的任何一种或多种的增加或减少，以及人和非人器官中病理学的组织学评估。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210513465.1A CN114875066A (zh) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662355102P | 2016-06-27 | 2016-06-27 | |
| US62/355102 | 2016-06-27 | ||
| US201762509942P | 2017-05-23 | 2017-05-23 | |
| US62/509942 | 2017-05-23 | ||
| PCT/US2017/039474 WO2018005471A1 (en) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | Human liver chimeric non-human animal with deficient p450 oxidoreductase and methods of using same |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210513465.1A Division CN114875066A (zh) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109688810A CN109688810A (zh) | 2019-04-26 |
| CN109688810B true CN109688810B (zh) | 2022-06-03 |
Family
ID=59351074
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780052153.2A Active CN109688810B (zh) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 |
| CN202210513465.1A Pending CN114875066A (zh) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210513465.1A Pending CN114875066A (zh) | 2016-06-27 | 2017-06-27 | 具有缺陷性p450氧化还原酶的人肝嵌合非人动物及其使用方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11716974B2 (zh) |
| EP (1) | EP3474662A1 (zh) |
| JP (2) | JP2019524077A (zh) |
| KR (1) | KR102466092B1 (zh) |
| CN (2) | CN109688810B (zh) |
| AU (1) | AU2017289194B2 (zh) |
| CA (1) | CA3027752A1 (zh) |
| IL (1) | IL263693B2 (zh) |
| MX (1) | MX2018016307A (zh) |
| SG (1) | SG11201811202WA (zh) |
| TW (1) | TWI767916B (zh) |
| WO (1) | WO2018005471A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113440502B (zh) * | 2020-11-30 | 2022-10-18 | 先见明创医药科技(苏州)有限公司 | Fah基因缺失动物的程序化慢性肝损伤维持及其在制备异源化肝脏模型中的应用 |
| CN114717195A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-08 | 武汉大学 | 筛选经cyp3a7介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用 |
| US20240102045A1 (en) * | 2022-07-19 | 2024-03-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors, genetically modified cells, and genetically modified non-human animals comprising the same |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6509514B1 (en) | 2000-03-17 | 2003-01-21 | Kmt Hepatech, Inc. | Chimeric animal model susceptible to human hepatitis C virus infection |
| US7700822B2 (en) * | 2002-07-12 | 2010-04-20 | Cancer Research Technology Limited | Modulation of cytochrome P450 reductase activity |
| GB0216203D0 (en) | 2002-07-12 | 2002-08-21 | Imp Cancer Res Tech | Mondulation of cytochrome P450 reductase activity |
| JPWO2004032615A1 (ja) | 2002-10-11 | 2006-02-02 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ブラディオン遺伝子発現抑制キメラマウス |
| GB0402318D0 (en) | 2004-02-03 | 2004-03-10 | Imp Cancer Res Tech | Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity in man |
| US7759541B2 (en) | 2004-12-13 | 2010-07-20 | Iti Life Sciences | Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity |
| JP5497639B2 (ja) * | 2007-06-05 | 2014-05-21 | オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ | 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法 |
| GB0718029D0 (en) | 2007-09-14 | 2007-10-24 | Iti Scotland Ltd | Two step cluster deletion and humanisation |
| GB0720552D0 (en) | 2007-10-19 | 2007-11-28 | Iti Scotland Ltd | Multiple cluster knockout |
| WO2010127275A1 (en) | 2009-05-01 | 2010-11-04 | Oregon Health & Scince University | Method of expanding human hepatocytes in vivo |
| US9167805B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-10-27 | National University Corporation Kumamoto University | Method of establishing mouse strain |
| EP3578042A1 (en) * | 2011-08-26 | 2019-12-11 | Yecuris Corporation | Fumarylacetoacetate hydrolase (fah)-deficient and immunodeficient rats and uses thereof |
| JP5883265B2 (ja) | 2011-10-13 | 2016-03-09 | 株式会社フェニックスバイオ | ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物 |
| JP5976380B2 (ja) | 2012-04-27 | 2016-08-23 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス |
| CN104540382A (zh) | 2012-06-12 | 2015-04-22 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 |
-
2017
- 2017-06-27 AU AU2017289194A patent/AU2017289194B2/en active Active
- 2017-06-27 IL IL263693A patent/IL263693B2/en unknown
- 2017-06-27 SG SG11201811202WA patent/SG11201811202WA/en unknown
- 2017-06-27 CN CN201780052153.2A patent/CN109688810B/zh active Active
- 2017-06-27 MX MX2018016307A patent/MX2018016307A/es unknown
- 2017-06-27 US US16/309,871 patent/US11716974B2/en active Active
- 2017-06-27 KR KR1020197002668A patent/KR102466092B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-27 CA CA3027752A patent/CA3027752A1/en active Pending
- 2017-06-27 WO PCT/US2017/039474 patent/WO2018005471A1/en unknown
- 2017-06-27 TW TW106121484A patent/TWI767916B/zh active
- 2017-06-27 JP JP2018567651A patent/JP2019524077A/ja not_active Withdrawn
- 2017-06-27 EP EP17740168.4A patent/EP3474662A1/en active Pending
- 2017-06-27 CN CN202210513465.1A patent/CN114875066A/zh active Pending
-
2022
- 2022-02-07 JP JP2022017030A patent/JP2022065020A/ja active Pending
-
2023
- 2023-06-15 US US18/335,959 patent/US20230337643A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/- /Rag2-/- /IL-2Rg-/- mice;Hisaya Azuma等;《nature biotechnology》;20070831;第25卷(第8期);第903-910页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2022065020A (ja) | 2022-04-26 |
| AU2017289194A1 (en) | 2019-01-17 |
| EP3474662A1 (en) | 2019-05-01 |
| IL263693B1 (en) | 2023-11-01 |
| TW201803988A (zh) | 2018-02-01 |
| US20230337643A1 (en) | 2023-10-26 |
| CA3027752A1 (en) | 2018-01-04 |
| TWI767916B (zh) | 2022-06-21 |
| JP2019524077A (ja) | 2019-09-05 |
| KR20190022799A (ko) | 2019-03-06 |
| IL263693B2 (en) | 2024-03-01 |
| KR102466092B1 (ko) | 2022-11-11 |
| WO2018005471A1 (en) | 2018-01-04 |
| SG11201811202WA (en) | 2019-01-30 |
| IL263693A (en) | 2019-01-31 |
| MX2018016307A (es) | 2019-05-20 |
| US11716974B2 (en) | 2023-08-08 |
| CN109688810A (zh) | 2019-04-26 |
| AU2017289194B2 (en) | 2019-12-05 |
| CN114875066A (zh) | 2022-08-09 |
| US20190166810A1 (en) | 2019-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chiu et al. | Transgenic mice that express Cre recombinase in osteoclasts | |
| US20230337643A1 (en) | Human liver chimeric non-human animal with deficient p450 oxidoreductase and methods of using same | |
| US20110107445A1 (en) | Efficient Insertion of DNA Into Embryonic Stem Cells | |
| Ludes-Meyers et al. | Generation and characterization of mice carrying a conditional allele of the Wwox tumor suppressor gene | |
| Wu et al. | Conditional knockout of the mouse NADPH‐cytochrome p450 reductase gene | |
| US20140373187A1 (en) | Fumarylacetoacetate hydrolase (fah)-deficient and immunodeficient rats and uses thereof | |
| Mo et al. | 1‐Cys peroxiredoxin knock‐out mice express mRNA but not protein for a highly related intronless gene | |
| AU2005263930B2 (en) | Detection of cellular stress | |
| JP4942081B2 (ja) | アルツハイマー病モデル動物およびその用途 | |
| Luo et al. | Generation of AQP2-Cre transgenic mini-pigs specifically expressing Cre recombinase in kidney collecting duct cells | |
| Sanchez-Fernandez et al. | Transgenic mice for a tamoxifen-induced, conditional expression of the Cre recombinase in osteoclasts | |
| JP2013230093A (ja) | ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス | |
| JP5075641B2 (ja) | 遺伝子改変動物およびその用途 | |
| JP2001211782A (ja) | ｔｏｂ遺伝子欠損ノックアウト非ヒト哺乳動物 | |
| US10470446B2 (en) | Engineered cell comprising a recombinant pro-methylation cis-element construct that resides in a regulatory region of a target gene | |
| JP5605718B2 (ja) | アルツハイマー病モデル動物およびその用途 | |
| McNew et al. | Houston, Texas, USA, November 12–15, 2023 | |
| JP2008131940A (ja) | Ｇｎｅ遺伝子に変異を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
| Martino et al. | Innovative strategies for improving engineered mouse models of human cancer for preclinical development | |
| Peters | Use of transgenic and knockout mice to study gene regulation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |