CN109683342B - 基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置及其光斑校正方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置及其光斑校正方法，属于超分辨显微领域，通过第一激光器产生的淬灭光与第二激光器产生的激发光射入多模光纤后，将多模光纤出射端的光斑成像到校正系统的相机上，不断变换空间光调制器上的调制信号，将相机采集到的光斑强度信息作为多模光纤模式相关校正方法的数据基础，以此修正空间光调制器的调制信号，在多模光纤出射端，生成艾里斑状激发光光斑及面包圈状的淬灭光光斑。通过将淬灭光和激发光移动扫描样品，在生物组织样本中不同深度的成像通过移动光纤来实现，克服了生物组织成像过程中由于散射带来的成像质量下降，兼具了高分辨率以及大成像深度，使得可以在生物医学方面得到广泛应用。

Description

基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置及其光斑校正方法

技术领域

本发明涉及超分辨显微领域，具体地说，涉及一种基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置及其光斑校正方法。

背景技术

光学显微镜凭借其非接触、无损伤等优点，长期以来是生物医学研究的重要工具。但是，自1873年以来，人们一直认为，光学显微镜的分辨率极限约为200nm，无法用于清晰观察尺寸在200nm以内的生物结构。超分辨光学成像(Super-resolution OpticalMicroscopy)是本世纪光学显微成像领域最重大的突破，打破了光学显微镜的分辨率极限(换言之，超越了光学显微镜的分辨率极限，故被称为超分辨光学成像)，为生命科学研究提供了前所未有的工具。

近年来，随着生物领域的不断发展，科研工作者提出了对细胞中百纳米以下的结构进行实际观测的需求，这将有助于人们理解人类自身的生命活动，与此相关的显微成像技术变得尤为重要。

使用传统的扫描电镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜等具有超高分辨率的技术却难以对生物活体进行观测。与之相比，光学显微技术对生物样本的观测一直以损伤性低、特异性强等优点著称，是观测生物样本的有利手段。突破光学衍射极限的超分辨光学显微技术的出现，对生命科学具有革命性的推动作用。而众多超分辨方法之中，以1994年德国科学家S.W.Hell提出的受激发射损耗显微术的发展最为成熟，经过多方面的改造和发展已经成功应用在材料学、生物医学等众多领域。

但是，考虑到在生物学、医学的研究中，观测的样品多为组织结构，对光有很强的散射作用，随着成像深度的增加，生物样本引起的光学误差及散射将急剧增加，有用信号被严重削弱，导致突破衍射极限的分辨率难以维持。因此现有的超分辨显微系统无法兼具高的空间分辨率以及大的成像深度，限制了其在生物医学等方面的进一步应用。

光纤内镜是一种在医疗和工业上常用的成像器件，近年来快速发展的波前整形技术使得多模光纤型内镜迅速发展，其低侵入性的观测方式，可以很好的规避组织散射带来的成像影响，在深穿透成像中成为一种强有力的工具，有望和超分辨技术结合产生新一代显微工具。目前光纤内镜分辨率在数微米到数十微米量级，超越衍射极限的光纤内镜未见报道。

发明内容

本发明的目的为提供一种基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置，解决现有STED超分辨成像系统中，存在的由于生物体散射导致的光斑变形，而给STED超分辨成像系统带来像差，降低其成像质量，限制了超分辨技术在生物医学中的进一步发展的问题。

本发明的另一目的为提供一种基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置的光斑校正方法。

为了实现上述目的，本发明提供的基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置包括探测系统和对所述探测系统出射的光斑进行校正的校正系统；探测系统包括淬灭光光路、激发光光路和探测光路；淬灭光光路与激发光光路合束后耦合入多模光纤内，校正系统设置在多模光纤的输出端，用于对多模光纤出射的光斑进行测量并根据测量数据对光斑进行校正；淬灭光光路上依次设有用于产生淬灭光的第一激光器、用于调制淬灭光的群速度色散特性的第一色散调制器以及用于调制淬灭光相位的第一空间光调制器；激发光光路上依次设有用于产生激发光的第二激光器、用于调制激发光的群速度色散特性的第二色散调制器、用于调整激发光与淬灭光之间脉冲间隔的延迟线以及用于调制激发光相位的第二空间光调制器；探测光路位于多模光纤的输入端，其上设有光电探测器，样品受多模光纤输出端经校正后的光斑扫描激发后发出荧光返回原多模光纤，经探测光路被光电探测器收集。

上述技术方案中，第一激光器产生的淬灭光与第二激光器产生的激发光射入多模光纤后，将多模光纤出射端的光斑成像到校正系统的相机上，不断变换空间光调制器上的调制信号，将相机采集到的光斑强度信息作为多模光纤模式相关校正方法的数据基础，以此修正空间光调制器的调制信号，在多模光纤出射端，生成艾里斑状激发光光斑及面包圈状的淬灭光光斑。通过将淬灭光和激发光移动来扫描样品，用同一根光纤收集荧光，通过光电倍增管放大信号。在生物组织样本中不同深度的成像，可以通过移动光纤来实现，克服了生物组织成像过程中由于散射带来的成像质量下降，兼具了高分辨率以及大成像深度，使得可以在生物医学方面得到广泛应用。

作为优选，第一色散调制器和所述的第二色散调制器包括棱镜对，棱镜对之间的距离为D，该距离D通过群速度延迟色散公式(GDD)计算得到。调整棱镜对之间的距离D可以补偿多模光纤的群速度色散导致的脉冲展宽。

作为优选，第一色散调制器和第二色散调制器还包括对光束进行反射的反射镜。

作为优选，淬灭光光路和激发光光路通过第一二向色镜进行合束，合束后的光路上设有第二二向色镜，用于将从多模光纤中出射的样品荧光信号反射至探测光路。

作为优选，第一色散调制器与第一空间光调制器之间设有用于提高第一空间光调制器对淬灭光的调制灵敏度的第一1/2波片；延迟线与第二空间光调制器之间设有用于提高第二空间光调制器对激发光的调制灵敏度的第二1/2波片。

作为优选，多模光纤为阶跃折射率光纤、渐变折射率光纤或光子晶体光纤等；第一激光器为飞秒激光器，第二激光器为皮秒激光器。

为了实现上述另一目的，本发明提供的多模光纤超分辨成像装置的光斑校正方法包括以下步骤：

(1)激发光通过空间光调制器的调制，一部分作为调制区域，该区域的光经过调制后复振幅被描述为E_n，n对应于调制区域上的像素；另外一部分作为参考区域，该区域的光不经过调制其复振幅被描述为S_n’，n’对应于参考区域的像素；

(2)将调制区域的光到达校正系统中相机所在平面的复振幅描述为E_m＝k_mnE_n，k_mn为一个复数矩阵，表示m个输出模式与n个输入模式间的变换关系，参考区域的光到达校正系统中相机所在平面的复振幅描述为S_m，两束光发生干涉；通过四步相移法算出两束光的复振幅分布，

为调制光整体相移θ相位后所对应的干涉光斑强度，m对应校正系统中相机上的像素，则

(3)利用一个哈达玛标准正交基H将出射光斑的复振幅信息和经空间光调制器调制的光的复振幅信息建立对应关系E_m＝k_mn*H，结合公式<1>计算得到传输矩阵K_obs＝SK_mn；

(4)通过传输矩阵，在空间光调制器上加载对应的相位图，激发光通过多模光纤后生成艾里斑状的激发光光斑；

(5)淬灭光重复步骤(1)～(5)得到甜甜圈状的淬灭光光斑。

作为另一种方案，本发明提供的多模光纤超分辨成像装置的光斑校正方法包括以下步骤：

(1)激发光通过激发光光路中空间光调制器的调制后耦合至多模光纤，从多模光纤出射的光斑成像到校正系统的相机上，相机获取目标区域的光强；

(2)以艾里斑状的光强分布作为信标，控制激发光光路中空间光调制器上每个像素块独立实现对相位的调制；

(3)优化调制，直至信标信号强度达到最大，即激发光光路中空间光调制器产生了符合艾里斑状光斑生成要求的波前；

(4)淬灭光重复步骤(1)～(3)，直至淬灭光光路中空间光调制器产生了符合面包圈状光斑生成所要求的波前。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用波前整形结合多模光纤来调制得到STED技术所需的艾里斑状的激发光光斑，及面包圈状的淬灭光光斑。由于光纤直径在百微米量级，可以以近乎无侵入性的状态进入生物体内进行超分辨观测，扩大了STED超分辨显微技术的适用范围。

附图说明

图1为本发明实例基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置的结构示意图；

图2为本发明实施例的第一色散调制器和第二色散调制器的结构示意图；

图3为本发明实施例所使用到的传输矩阵用到的测量相位图；

图4为本发明实施例中多模光纤生成的激光光斑与淬灭光光斑示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

实施例1

参见图1和图2，本实施例的基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置包括以下组件：

飞秒激光器1，用于产生淬灭光，淬灭光入射到第一起偏器2；

第一起偏器2，设置在飞秒激光器1的出射光路上，用于确保淬灭光的线偏振特性；

第一透镜组3，设置在第一起偏器2的出射光路上，用于将淬灭光光束直径扩大；

第一色散调制器4，设置在第一透镜组3的出射光路上，用于调制淬灭光的群速度色散特性；

第一1/2波片5，设置在第一色散调制器4的出射光路上，确保第一空间光调制器7对淬灭光的调制灵敏度；

第一空间光调制器7，用于调制淬灭光的相位；

第一二向色镜8，设置在第一空间光调制器7的出射光路上，对于淬灭光起到反射作用；

第一物镜21，设置在第一二向色镜8的出射光路上，将淬灭光耦合到多模光纤22中进入校正系统；

皮秒激光器9，用于产生激发光，激发光入射到第二起偏器10

第二起偏器10，设置在皮秒激光器9的出射光路上，用于确保激发光的线偏振特性；

第二透镜组11，设置在第二起偏器10的出射光路上，用于将激发光光束直径扩大；

第二色散调制器件12，设置在第二透镜组11的出射光路上，用于调制激发光的群速度色散特性；

延迟线14，设置在第二色散调制器件12的出射光路上，用于调整激发光与淬灭光的脉冲间隔；

第二1/2波片16，设置在延迟线14的出射光路上，确保第二空间光调制18器对激发光的调制灵敏度；

第二空间光调制器18，用于调制激发光的相位；第一二向色镜8同时位于第二空间光调制器18的出射光路上，对于激发光起透射作用；第一物镜21将激发光耦合到多模光纤22之中，进入校正系统；

校正系统，用于对多模光纤22出射光斑进行测量，作为多模光纤波前相关校正方法需要的数据基础，其包括：

第二物镜23，设置在多模光纤22的出射端，结合场镜24可将多模光纤22出射端面的光斑成像到相机25上；

场镜24，设置在第二物镜23的出射光路上，用于与第二物镜23形成4F系统；

相机25，采集出射光斑的光强信号传输到计算机中26，作为相关校正方法所需的数据基础。

校正系统校正完成后通过空间光调制在多模光纤出射端形成STED所需光斑之后，移除校正系统，剩下的组件作为探测系统。

探测系统，将样品摆放至多模光纤22出射端面处，执行同步程序，用前述校正完成后多模光纤出射所形成的光斑激发样品。样品上受激发的荧光用前述同一根多模光纤收集，返回原光纤入射端，由第一物镜21接收，经过探测光路后被光电探测器28收集，探测光路上还设有透镜27。

装置中还包含若干用于转折光路的反射镜，分别为：反射镜6、反射镜13，反射镜15、反射镜17和反射镜19。第一色散调制器4和第二色散调制器件12包括棱镜c、棱镜d、反射镜b、反射镜f、反射镜e，其中棱镜c和棱镜d构成本实施例的棱镜对，具体结构参见图2。

本实施例在基于STED超分辨成像的原理上，为了获得图像，需要在多模光纤的出射端生成特殊光斑并对样品进行扫描。其过程细分为，用多模光纤生成所需光斑的校正环节，及光斑对样品的扫描成像环节，具体如下：

(1)校正环节：两束照明光在显微系统中通过空间光调制器调制在多模光纤出射端形成光斑，其中一束为激发光，另一束为淬灭光，淬灭光斑具有以下特性，相较于激发光，其边缘部分具有较大的光强抑制自发荧光，同时在激光光斑中心部分具有趋近于零的低光强，对自发荧光不产生影响。

(2)成像环节：通过空间光调制器加载相应相位调制。同步移动激发光斑和淬灭光斑，实现缩小有效点扩展函数的点扫描(如图4所示)，达到超分辨成像的目的。

本实施例中，校正环节中的两束照明光，如图1所示，分别为飞秒激光器1产生的淬灭光和皮秒激光器9产生的激发光。

淬灭光的光路为：飞秒激光器1出射淬灭光，淬灭光首先通过第一起偏器2，其中第一起偏器2将确保入射淬灭光为线偏振光。之后淬灭光射入第一透镜组3进行扩束处理，将光斑直接扩大至第一空间光调制器件7的工作尺寸范围。第一色散调制器4放置在第一透镜组3的出射光路上，调整第一色散调制器4中的棱镜c与棱镜d之间的距离D可以补偿多模光纤22的群速度色散导致的脉冲展宽，棱镜c与棱镜d之间的距离D计算将通过群速度延迟色散公式(GDD)得到。第一1/2波片5放置在棱镜对的出射光路上，通过第一1/2波片5调制偏振态使淬灭光的偏振方向平行于第一空间光调制器7的液晶面的长轴，以保证第一空间光调制器7对淬灭光调制的灵敏度。第一二向色镜8放置在第一空间光调制器7的出射光路上，第一二向色镜8对于淬灭光起反射作用。淬灭光入射到第一物镜21，第一物镜21将光束耦合进多模光纤22，传输至校正系统。

激发光的光路为：皮秒激光器9出射激发光，激发光首先通过第二起偏器10，第二起偏器10确保入射激发光光为线偏振光。之后激发光射入第二透镜组11进行扩束处理，将光斑直接扩大至第二空间光调制器件18的工作尺寸范围。第二色散调制器件12放置在透镜组11的出射光路上，调整第二色散调制器件12中的棱镜c与棱镜d之间的距离D可以补偿多模光纤的群速度色散导致的脉冲展宽，棱镜c与棱镜d之间的距离D计算将通过群速度延迟色散公式(GDD)得到。延迟线14设置在棱镜对的出射光路上，改变激发光所在的光路的光程，在时间上控制激发光与淬灭光的脉冲间隔，保证淬灭光更彻底地让样品中的电子受激发射回到基态。第二1/2波片16设置在延迟线14的出射光路上，通过第二1/2波片16调制偏振态使得激发光的偏振方向平行于第二空间光调制器18的液晶面的长轴，以保证第二空间光调制器18对激发光调制的灵敏度。第一二向色镜8放置在第二空间光调制器18的出射光路上，第一二向色镜8对于激发光透射。之后激发光入射至第一物镜21，第一物镜21将光束耦合进多模光纤22，传输至校正系统。根据校正系统得到信息结合相关校正方法可生成所需光斑。

本实施例中，校正环节中的校正方法采用传输矩阵法——用矩阵形式表达入射光波模式在多模光纤中的线性组合关系。具体步骤如下：

(1)激发光通过激发光光路中第二空间光调制器18的调制，如图3所示，其中一部分作为调制区域，光经过调制后复振幅被描述为E_n，n对应于调制区域上的像素；另外一部分作为参考区域，通过的光不经过调制其复振幅被描述为S_n’，n’对应于参考区域的像素。调制区域的光到达相机所在平面的复振幅被描述为E_m＝k_mnE_n，参考区域的光到达相机所在平面被描述为S_m，两束光会发生干涉，经过四步相移法可以算出其复振幅分布，，

为调制光整体相移θ相位后所对应的干涉光斑强度，m对应相机上的像素。

(3)用一个哈达玛标准正交基H将出射光斑的复振幅信息和经空间光调制器5调制的光的复振幅信息建立对应关系E_m＝k_mn*H，结合公式<1>可得到传输矩阵K_obs＝SK_mn；

(4)通过传输矩阵，在第一空间光调制器18上加载对应的一系列相位图，可在多模光纤的出射端得到任意模式的输出，根据STED技术所需，此时系统对激发光通过多模光纤后生成艾里斑状激发光光斑(如图4所示)；

(5)淬灭光重复过程(1)～(5)得到面包圈状淬灭光光斑(如图4所示)；

成像环节具体如下：如图1所示，先将虚线内的器件拆除，保持校正环节中除虚线外的系统的设置，然后在多模光纤22出射端即原第二物镜23前焦面处放置样品24。工作时先打开皮秒激光器9产生激发光，后打开飞秒激光器1产生淬灭光，常用手段是利用皮秒激光器9的控制系统来同步触发飞秒激光器1产生淬灭光及皮秒激光器9产生激发光，再通过变换空间光调制器的相位实现艾里斑状激发光光斑及面包圈状淬灭光光斑的生成和移动，对样品24进行二维点阵扫描。经前述的同一根光纤22将受激发的荧光收集，通过第一物镜21将光纤中的光导出，入射到第二二向色镜20，由第二二向色镜20反射荧光。透镜27放置在第二二向色镜20的反射光路上，将荧光采集到光电探测器28得到光强信息。将收集的数据传输到计算机26，最后由计算机26依照设定的扫描顺序将信号光光强拼接得到图像.

实施例2

本实施例的基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置与实施例1相同，仅光斑校正方法与实施例1不同。本实施例的光斑校正方法采用迭代优化方法——一种为了提高系统所需的增益，将输出信号作为反馈信号的闭环迭代技术，包括以下步骤：

(1)激发光通过激发光光路中第二空间光调制器18的调制后，由第一物镜21耦合至多模光纤22，通过第二物镜23和场镜24将出射光斑成像到相机25上，相机25获取目标区域的光强。设置艾里斑状的光强分布作为信标，控制第二空间光调制器18上每个像素块独立实现对相位的调制，不断优化调制，直至信标信号强度达到最大，即第二空间光调制器18产生了符合艾里斑状光斑生成要求的波前；

(2)淬灭光通过淬灭光光路中第一空间光调制器7的调制后，由第一物镜21耦合至多模光纤22，通过第二物镜23和场镜24将出射光斑成像到相机25上，相机25获取目标区域的光强。设置艾里斑状的光强分布作为信标，控制第一空间光调制器7上像素块独立实现对相位的调制，不断优化调制，直至信标信号强度达到最大，即空间光调制器7产生了符合面包圈状光斑生成所要求的波前。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于波前整形的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：包括探测系统和对所述探测系统出射的光斑进行校正的校正系统；

所述探测系统包括淬灭光光路、激发光光路和探测光路；所述淬灭光光路与所述激发光光路合束后耦合入多模光纤内，所述校正系统设置在所述多模光纤的输出端，用于对多模光纤出射的光斑进行测量并根据测量数据对所述光斑进行校正；

所述淬灭光光路上依次设有用于产生淬灭光的第一激光器、用于调制淬灭光的群速度色散特性的第一色散调制器以及用于调制淬灭光相位的第一空间光调制器；

所述激发光光路上依次设有用于产生激发光的第二激光器、用于调制激发光的群速度色散特性的第二色散调制器、用于调整激发光与淬灭光之间脉冲间隔的延迟线以及用于调制激发光相位的第二空间光调制器；

所述探测光路位于所述多模光纤的输入端，其上设有光电探测器，样品受所述多模光纤输出端经校正后的光斑扫描激发后发出荧光返回原多模光纤，经所述探测光路被光电探测器收集；

校正后的成像装置将多模光纤放入生物体内，通过移动光纤来实现在生物组织样本中不同深度的成像。

2.根据权利要求1所述的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：所述的第一色散调制器和所述的第二色散调制器包括棱镜对，所述棱镜对之间的距离为D，该距离D通过群速度延迟色散公式计算得到。

3.根据权利要求2所述的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：所述的第一色散调制器和所述的第二色散调制器还包括对光束进行反射的反射镜。

4.根据权利要求1所述的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：所述的淬灭光光路和所述的激发光光路通过第一二向色镜进行合束，合束后的光路上设有第二二向色镜，用于将从所述多模光纤中出射的样品荧光信号反射至所述的探测光路。

5.根据权利要求1所述的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：所述的第一色散调制器与所述的第一空间光调制器之间设有用于提高所述第一空间光调制器对淬灭光的调制灵敏度的第一1/2波片；

所述的延迟线与所述的第二空间光调制器之间设有用于提高所述第二空间光调制器对激发光的调制灵敏度的第二1/2波片。

6.根据权利要求1所述的多模光纤超分辨成像装置，其特征在于：所述的多模光纤为阶跃折射率光纤、渐变折射率光纤或光子晶体光纤；所述的第一激光器为飞秒激光器，所述的第二激光器为皮秒激光器。

7.一种用于权利要求1～6任一权利要求所述的多模光纤超分辨成像装置的光斑校正方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)激发光通过空间光调制器的调制，一部分作为调制区域，该区域的光经过调制后复振幅被描述为E_n，n对应于调制区域上的像素；另外一部分作为参考区域，该区域的光不经过调制其复振幅被描述为S_n’，n’对应于参考区域的像素；

(2)将调制区域的光到达校正系统中相机所在平面的复振幅描述为E_m＝k_mnE_n，k_mn为一个复数矩阵，表示m个输出模式与n个输入模式间的变换关系，参考区域的光到达校正系统中相机所在平面的复振幅描述为S_m，两束光发生干涉；通过四步相移法算出两束光的复振幅分布，

为调制光整体相移θ相位后所对应的干涉光斑强度，m对应校正系统中相机上的像素，则

(3)利用一个哈达玛标准正交基H将出射光斑的复振幅信息和经空间光调制器调制的光的复振幅信息建立对应关系E_m＝k_mn*H，结合公式<1>计算得到传输矩阵K_obs＝SK_mn；

(4)通过传输矩阵，在空间光调制器上加载对应的相位图，激发光通过多模光纤后生成艾里斑状的激发光光斑；

(5)淬灭光重复步骤(1)～(5)得到甜甜圈状的淬灭光光斑。

8.一种用于权利要求1～6任一权利要求所述的多模光纤超分辨成像装置的光斑校正方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)激发光通过激发光光路中空间光调制器的调制后耦合至多模光纤，从多模光纤出射的光斑成像到校正系统的相机上，相机获取目标区域的光强；

(2)以艾里斑状的光强分布作为信标，控制激发光光路中空间光调制器上每个像素块独立实现对相位的调制；

(3)优化调制，直至信标信号强度达到最大，即激发光光路中空间光调制器产生了符合艾里斑状光斑生成要求的波前；

(4)淬灭光重复步骤(1)～(3)，直至淬灭光光路中空间光调制器产生了符合面包圈状光斑生成所要求的波前。

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