CN109679909A - 一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法 - Google Patents

一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明方法公开了一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，包括如下步骤：步骤1、单核细胞复苏；步骤2、单核细胞培养及传代；步骤3、单核细胞诱导；步骤4、单核细胞诱导鉴定。本发明诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，通过低浓度的干扰素调节因子抑制剂‑‑‑曲美替尼对干扰素调节因子的表达进行调控，达到促进单核细胞向巨噬细胞分化的目的，具备诱导效率高，成本较低，操作简便，可以应用于高通量试验，节省成本等优点。

Description

一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及一种生物方法，具体是一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法。
背景技术
单核细胞(monocytes)是血液中最大的血细胞，也是体积最大的白细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。单核细胞具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞可参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。
单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞。单核细胞在血流中循环大约一至三天，然后通常进入全身的组织并分化为巨噬细胞(Macrophage)和树突状细胞(Dendritic cell)。巨噬细胞同样属于白细胞的一种，它可吞噬和消化细胞碎片、微生物、癌细胞以及某些蛋白质的细胞，目前认为单核细胞是巨噬细胞的前身。
众所周知，单核细胞和巨噬细胞组成的单核-巨噬细胞系统(mononuclear-phagocyte system，MPS)是机体固有免疫系统的重要组成部分，最初起源于造血干细胞。单核-巨噬细胞具有多方面的生物功能，主要可以概括为以下几个方面：i.非特异免疫防御：通过激发固有免疫应答，当外来病原体进入机体后即被单核-巨噬细胞吞噬清除；ii.抗原呈递：当外来抗原进入机体后，首先由单核-巨噬细胞吞噬、消化，将有效的抗原决定簇和MHCII类分子结合成复合体，这种复合体被T细胞识别，从而激发免疫应答。iii.分泌介质工L-1、干扰素、补体(C1，C4，C2，C3，C5，B因子)等。
目前单核-巨噬细胞系统的生理功能研究尚不明了，许多问题亟待解决，本发明提供了一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，通过药物曲美替尼trametinib抑制单核细胞向树突状细胞方向分化的促进因子干扰素调节因子(IRF4)，诱导单核细胞向巨噬细胞分化。本发明为单核-巨噬细胞系统的研究提供了新的思路及研究手段。
中国发明专利申请号CN201410809692公开了一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，通过shRNA干扰下调细胞内p38IP蛋白水平促进单核细胞向巨噬细胞的定向分化，从而增加巨噬细胞的获得率，克服了现有技术中单核细胞诱导向巨噬细胞分化的方法复杂且不理想的技术问题，针对巨噬细胞分化紊乱疾病提出新的研究和治疗思路。然而，该方法仍然存在诱导方法对细胞毒性较高、操作较繁琐、耗时较长、成本较高等问题。
方法内容
本发明的目的在于提供一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本方法提供如下技术方案：
一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，包括如下步骤：步骤1、单核细胞复苏；步骤2、单核细胞培养及传代；步骤3、单核细胞诱导；步骤4、单核细胞诱导鉴定。
作为本方法进一步的方案：所述步骤1单核细胞复苏的具体处理方法为：将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖，用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中，使用移液吸管将细胞转移至已装有预热平衡的单核细胞培养基的培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
作为本方法进一步的方案：所述步骤2单核细胞培养及传代的具体处理方法为：步骤2a.待步骤1中的细胞汇合率至80～90％时，将培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出培养瓶中的培养基，按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积使用HBSS平衡盐溶液润洗培养瓶，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液，按照100μl/em2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中，按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中；步骤2b.220g离心3分钟，弃去上清，使用适量单核细胞培养基重悬细胞团块，按照1*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
作为本方法进一步的方案：所述胰酶/EDTA溶液处于室温状态。
作为本方法进一步的方案：所述步骤3单核细胞诱导的具体处理方法为：按照步骤2a操作，离心后使用单核细胞培养基进行重悬，接种密度按照0.5*106/cm2的培养瓶皿底面积进行接种，贴壁24小时后将培养基更换为含有0.3μg/ml曲美替尼的单核细胞培养基，培养72小时后吸出培养基，并更换新鲜的含有0.2μg/ml曲美替尼的单核细胞培养基，继续培养72小时后对细胞进行诱导鉴定分析。
作为本方法进一步的方案：所述步骤4单核细胞诱导鉴定的具体处理方法包括流式分析鉴定方法、实时荧光定量PCR分析鉴定方法和免疫印迹分析鉴定方法；
所述流式分析鉴定方法为：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用trizol法提取RNA，反转录得到cDNA，配制反应体系，使用特异性引物进行qPCR试验；
所述免疫印迹分析鉴定方法为：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用蛋白裂解液对细胞进行裂解，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后分别使用特异性的CD14抗体、CD16抗体、CD1a初级抗体孵育和二级抗体孵育，ECL液发色；
所述免疫印迹分析鉴定：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用蛋白裂解液对细胞进行裂解，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后分别使用特异性的CD14抗体、CD16抗体、CD1a初级抗体孵育和二级抗体孵育，ECL液发色。
作为本方法进一步的方案：所述CD14的特异性引物序列为：正向引物：AGTGTGAAGCCTGGAAGCCG，反向引物：CGCGCTCCATGGTCGATAAG；CD16的特异性引物序列为：正向引物：CAGACCCACCCACCTTGCC，反向引物：CGCATGCCAGCTGAAACTAGA；CD1a的特异性引物序列为：正向引物：TTGGAGGAGCAACAGGGCTCAA，反向引物：CTCAGCCAACCTGAGACCAGA。
作为本方法再进一步的方案：步骤一至四的反应程序为：步骤一：95℃，3分钟；步骤二：95℃，10秒；步骤三：60℃，45秒；步骤四：步骤二与步骤三重复40次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，通过低浓度的干扰素调节因子抑制剂---曲美替尼对干扰素调节因子的表达进行调控，达到促进单核细胞向巨噬细胞分化的目的，具备诱导效率高，成本较低，操作简便，可以应用于高通量试验，节省成本等优点。
附图说明
图1为本发明诱导前的单核细胞图。
图2为本发明诱导后的单核细胞图。
图3为本发明曲美替尼诱导试验示意图。
图4为本发明诱导前的单核细胞分析结果图。
图5为本发明诱导前的单核细胞流式分析结果图。
图6为本发明诱导前的单核细胞免疫印迹结果图。
图7为本发明诱导后的单核细胞实时荧光定量PCR分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，所述方法包含以下步骤：
步骤1、单核细胞复苏：将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖。用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中。使用移液吸管将细胞转移至已装有预热平衡的单核细胞培养基的培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
优选地，冻存的单核细胞购自promocell(C-12909)。优选地，单核细胞培养基购自promocell(C-28030)。
步骤2、单核细胞培养及传代：
步骤2a.待步骤1中的细胞汇合率至80～90％时，将培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出培养瓶中的培养基，按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积使用HBSS平衡盐溶液润洗培养瓶，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液。按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶/EDTA溶液。拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中；
步骤2b.220g离心3分钟。弃去上清，使用适量单核细胞培养基重悬细胞团块。按照1*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
优选地，胰酶/EDTA溶液处于室温状态。优选地，胰酶/EDTA溶液选自promocell。
步骤3、单核细胞诱导：按照步骤2a操作，离心后使用单核细胞培养基进行重悬，接种密度按照0.5*106/cm2的培养瓶皿底面积进行接种。贴壁24小时后将培养基更换为含有0.3μg/ml曲美替尼(trametinib)的单核细胞培养基。培养72小时后吸出培养基，并更换新鲜的含有0.2μg/ml曲美替尼(trametinib)的单核细胞培养基。继续培养72小时后对细胞进行诱导鉴定分析。
优选地，曲美替尼购自apexbio。
步骤4、单核细胞诱导鉴定：
流式分析鉴定：按照步骤2a操作，离心后使用HBSS平衡盐溶液进行重悬，重悬后加入CD14表面标志物抗体、CD16表面标志物抗体、CD1a表面标志物抗体并混匀，进行流式细胞分析。
优选地，CD14表面标志物抗体(367130)、CD16表面标志物抗体(302008)、CD1a表面标志物抗体(300130)均购自biolegend。
实时荧光定量PCR分析鉴定：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用trizol法提取RNA，反转录得到cDNA，配制反应体系，使用特异性引物进行qPCR试验。
优选地，CD14的特异性引物序列为：
正向引物：AGTGTGAAGCCTGGAAGCCG；
反向引物：CGCGCTCCATGGTCGATAAG；
优选地，CD16的特异性引物序列为：
正向引物：CAGACCCACCCACCTTGCC；
反向引物：CGCATGCCAGCTGAAACTAGA；
优选地，CD1a的特异性引物序列为：
正向引物：TTGGAGGAGCAACAGGGCTCAA；
反向引物：CTCAGCCAACCTGAGACCAGA；
优选地，反应程序为：
步骤一：95℃，3分钟；
步骤二：95℃，10秒；
步骤三：60℃，45秒；
步骤四：步骤二与步骤三重复40次。
免疫印迹分析鉴定：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用蛋白裂解液对细胞进行裂解，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后分别使用特异性的CD14抗体、CD16抗体、CD1a初级抗体孵育和二级抗体孵育，ECL液发色。
优选地，CD14抗体、CDl6抗体、CD1a初级抗体与二级抗体均购自biolegend。
实施例2：
一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，具体如下：
单核细胞诱导前鉴定：
1)将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖。用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中。使用移液吸管将冻存管内细胞转移至已预装有10ml预热平衡的单核细胞培养基的T75培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
2)当单核细胞汇合率至80～90％时，将装有单核细胞的T75培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出T75培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml HBSS平衡盐溶液，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。弃去上清，使用3ml单核细胞培养基重悬细胞团块。按照1*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
3)当单核细胞汇合率再次达到80～90％时，将T75培养瓶从培养箱中移出，移除培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。离心后使用HBSS平衡盐溶液进行重悬，重悬后加入CD14表面标志物抗体、CD16表面标志物抗体、CD1a表面标志物抗体并混匀，进行流式细胞分析。
实验组：
1)将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖。用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中。使用移液吸管将冻存管内细胞转移至已预装有10ml预热平衡的单核细胞培养基的T75培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
2)当单核细胞汇合率至80～90％时，将装有单核细胞的T75培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出T75培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml HBSS平衡盐溶液，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。弃去上清，使用3ml单核细胞培养基重悬细胞团块。按照0.5*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
3)细胞贴壁24小时后，将装有细胞的T75培养瓶移入生物安全柜中，移除培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入15ml含有0.3μg/ml曲美替尼(trametinib)的单核细胞培养基，将T75培养瓶放回培养箱中。培养72小时后吸出培养基，向T75培养瓶中加入15ml含有0.2μg/ml曲美替尼(trametinib)的单核细胞培养基，将T75培养瓶放回培养箱中。继续培养72小时。
4)将T75培养瓶从培养箱中移出，移除培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。离心后使用HBSS平衡盐溶液进行重悬，重悬后加入CD14表面标志物抗体、CD16表面标志物抗体、CD1a表面标志物抗体并混匀，进行流式细胞分析、实时荧光定量分析、免疫印迹分析。
对照组：
1)将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖。用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中。使用移液吸管将冻存管内细胞转移至已预装有10ml预热平衡的单核细胞培养基的T75培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
2)当单核细胞汇合率至80～90％时，将装有单核细胞的T75培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出T75培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml HBSS平衡盐溶液，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。弃去上清，使用3ml单核细胞培养基重悬细胞团块。按照0.5*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
3)细胞贴壁24小时后，将装有细胞的T75培养瓶移入生物安全柜中，移除培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入15ml新鲜的单核细胞培养基，将T75培养瓶放回培养箱中。培养72小时后吸出培养基，向T75培养瓶中加入15ml新鲜的单核细胞培养基，将T75培养瓶放回培养箱中。继续培养72小时。
5)将T75培养瓶从培养箱中移出，移除培养瓶中的培养基，向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中。向T75培养瓶中加入7.5ml胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中，220g离心3分钟。离心后使用HBSS平衡盐溶液进行重悬，重悬后加入CD14表面标志物抗体、CD16表面标志物抗体、CD1a表面标志物抗体并混匀，进行流式细胞分析、实时荧光定量分析、免疫印迹分析。
流式细胞分析：
细胞离心后使用HBSS平衡盐溶液进行重悬，重悬后加入2.5μl 1∶100 CD14表面标志物抗体稀释液、2.5μl 1∶200PE标记的CD16表面标志物抗体稀释液、2.5μ1 1∶100APC标记的CD1a表面标志物抗体稀释液并混匀，进行流式细胞分析。
实时荧光定量分析：按照如下所示配制反应体系，按照如下反应程序运行qPCR仪器。仪器运行结束后导出实验数据并使用Prism软件进行分析。
反应体系：
2x qPCR Mix 5μl
1μM引物Mix 2.5μl
cDNA 2.5μl
反应程序为：
步骤一：95℃，3分钟；
步骤二：95℃，10秒；
步骤三：60℃，45秒。
步骤四：步骤二与步骤三重复40次。
免疫印迹分析：
1)聚丙烯酰胺凝胶配制：选取洁净玻璃板，将长板和短板对齐夹紧放入夹中，确保夹紧不漏胶，按照每块分离胶7.5ml进行配制，浓缩胶3ml进行配制；
2)SDS-PAGE：将胶板固定，放入电泳槽中，加入约500ml电泳缓冲液，缓缓拔出梳子，除去内槽液面泡沫，观察内槽液体是否漏出，若漏出则需重新安装，确认内槽无漏液后将制备好的样品按照顺序缓缓加入胶孔中，其中一个泳道加入彩虹蛋白marker，其余泳道用样品等体积的1xloading buffer补齐，打开电泳仪，连接电源，设置参数，恒压，80V，待溴酚蓝带移动至分离胶处，蛋白marker分开时，调整电压至120V，溴酚蓝带移动至胶板末端即将跑出时停止电泳；
3)转膜(湿转)：配制1x转膜缓冲液1L，预冷至4度，将转膜夹，海绵，转膜滤纸，硝酸纤维素膜浸泡在转膜缓冲液中，将转膜夹打开，透明面朝下，按照白色海绵，转膜滤纸，硝酸纤维素膜，聚丙烯酰胺凝胶，转膜滤纸，黑色海绵的顺序依次放入转膜夹中，确保该过程均在转膜缓冲液中，防止气泡影响转膜，将转膜夹夹紧，放入转膜槽中(预先倒入转膜缓冲液)，转膜夹透明面对红色，黑色面对黑色，连接电源，设置模式为恒流300毫安，计时90分钟，转膜过程因大量放热，故应在四度进行。
4)丽春红染色：转膜结束后取出转膜夹，将硝酸纤维素膜放入丽春红溶液中，待硝酸纤维素膜上蛋白条带清晰后回收丽春红溶液，观察硝酸纤维素膜上是否有因气泡导致的未着色区域，根据蛋白marker指示大小对硝酸纤维素膜进行剪裁；
5)封闭：将硝酸纤维素膜浸泡于过量的5％脱脂牛奶/TBST中，室温，计时1小时；
6)一抗：用TBST洗去硝酸纤维素膜上多余的5％脱脂牛奶，将硝酸纤维素膜浸泡于待检抗原对应一抗溶液中，4度过夜；
7)二抗：将硝酸纤维素膜从一抗溶液中取出，TBST洗3次，每次5分钟，将硝酸纤维素膜浸泡于二抗溶液中，室温，计时1小时，TBST洗3次，每次5分钟；
8)ECL显色：将现配的ECL工作液均匀滴加在表面无明显液滴的硝酸纤维素膜上，室温等待反应1分钟，将多余的ECL工作液移去，进入暗环境利用胶片感光性对硝酸纤维素膜上的反应进行成像，将胶片放入自动冲片机中进行曝光；
对结果进行分析，比对胶片和硝酸纤维素膜的位置，标记marker，扫描仪扫描胶片，记录结果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、单核细胞复苏；步骤2、单核细胞培养及传代；步骤3、单核细胞诱导；步骤4、单核细胞诱导鉴定。
2.根据权利要求1所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤1单核细胞复苏的具体处理方法为：将冻存的单核细胞从液氮中取出，将细胞冻存管盖旋开1/4周然后拧紧立即放入37摄氏度水浴中，使得液面刚好处于细胞冻存管盖以下，确保没有任何液体触碰到细胞管盖，用70％酒精喷洒冻存管表面，移除冻存管表面多余的酒精并移入生物安全柜中，使用移液吸管将细胞转移至已装有预热平衡的单核细胞培养基的培养瓶中，将培养瓶放入37摄氏度，5％CO2的培养箱中。
3.根据权利要求1或2所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤2单核细胞培养及传代的具体处理方法为：步骤2a.待步骤1中的细胞汇合率至80～90％时，将培养瓶从培养箱中移入生物安全柜中，吸出培养瓶中的培养基，按照100μ1/cm2的培养瓶皿底面积使用HBSS平衡盐溶液润洗培养瓶，轻晃培养瓶15秒并吸出培养瓶中的HBSS平衡盐溶液，按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶/EDTA溶液，拧紧培养瓶瓶盖，将培养瓶置于显微镜下镜检，当细胞开始脱落皿底时轻拍培养瓶并将培养瓶移入生物安全柜中，按照100μl/cm2的培养瓶皿底面积向培养瓶中加入胰酶中和液，充分混匀，吸出混匀后的液体至离心管中；步骤2b.220g离心3分钟，弃去上清，使用适量单核细胞培养基重悬细胞团块，按照1*106/ml的密度接种细胞至培养瓶中。
4.根据权利要求3所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述胰酶/EDTA溶液处于室温状态。
5.根据权利要求3所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤3单核细胞诱导的具体处理方法为：按照步骤2a操作，离心后使用单核细胞培养基进行重悬，接种密度按照0.5*106/cm2的培养瓶皿底面积进行接种，贴壁24小时后将培养基更换为含有0.3μg/ml曲美替尼的单核细胞培养基，培养72小时后吸出培养基，并更换新鲜的含有0.2μg/ml曲美替尼的单核细胞培养基，继续培养72小时后对细胞进行诱导鉴定分析。
6.根据权利要求3所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述步骤4单核细胞诱导鉴定的具体处理方法包括流式分析鉴定方法、实时荧光定量PCR分析鉴定方法和免疫印迹分析鉴定方法；
所述流式分析鉴定方法为：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用trizol法提取RNA，反转录得到cDNA，配制反应体系，使用特异性引物进行qPCR试验；
所述免疫印迹分析鉴定方法为：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用蛋白裂解液对细胞进行裂解，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后分别使用特异性的CD14抗体、CD16抗体、CD1a初级抗体孵育和二级抗体孵育，ECL液发色；
所述免疫印迹分析鉴定：按照步骤2a操作，离心后的细胞使用蛋白裂解液对细胞进行裂解，再使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后分别使用特异性的CD14抗体、CD16抗体、CD1a初级抗体孵育和二级抗体孵育，ECL液发色。
7.根据权利要求6所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述CD14的特异性引物序列为：正向引物：AGTGTGAAGCCTGGAAGCCG，反向引物：CGCGCTCCATGGTCGATAAG；CD16的特异性引物序列为：正向引物：CAGACCCACCCACCTTGCC，反向引物：CGCATGCCAGCTGAAACTAGA；CD1a的特异性引物序列为：正向引物：TTGGAGGAGCAACAGGGCTCAA，反向引物：CTCAGCCAACCTGAGACCAGA。
8.根据权利要求1所述的诱导单核细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，步骤一～四的反应程序为：步骤一：95℃，3分钟；步骤二：95℃，10秒；步骤三：60℃，45秒；步骤四：步骤二与步骤三重复40次。
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