CN109678929A - 一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法 - Google Patents

一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法 Download PDF

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CN109678929A CN201910045273.0A CN201910045273A CN109678929A CN 109678929 A CN109678929 A CN 109678929A CN 201910045273 A CN201910045273 A CN 201910045273A CN 109678929 A CN109678929 A CN 109678929A
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吴正治
龙伯华
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Shenzhen Institute of Gerontology
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Shenzhen Institute of Gerontology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic

Abstract

本发明公开了一种生物活性肽N14‑Desacetoxytubulysin H的制备方法，包括以下步骤：制备TUV片段(2)；制备生物活性肽N14‑Desacetoxytubulysin H。本发明方法符合绿色化学标准：如利用可再生性资源、可回收、所用试剂毒性较小、反应经处理后对环境污染很小等；此外总产率高、立体选择性非常好、成本低、分离纯化简单方便、可用于大量制备。

Description

一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地说，涉及一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法。
背景技术
2000年，等人(Sasse,F.；Steinmetz,H.；Heil,J.；G.；Reichenbach,H.J.Antibiot.2000,53,879.)首次报导了一种从粘细菌中分离提取的线性四肽小分子。由于它们主要作用在细胞的微管蛋白细胞骨架(tubulin cytoskeleto)上，因此把这一类化合物命名为Tubulysins。
研究发现，Tubulysins不仅具有很高的抗癌活性(N14-Desacetoxytubulysin H的IC50约为紫杉醇的100-5000倍，为埃博霉素B的10倍以上)，而且能够有效地抑制耐药性癌细胞的生长，但它的具体作用机理却是与埃博霉素和紫杉醇相反，即促进微管蛋白的聚合。长春碱的作用机理虽与其相似，但活性差很多。另外，Kaur等人(G.Kaur,M.Hollingshead,S.Holbeck,et al.Biochem.J.2006,396,235-242.)还发现Tubulysins还具有抑制血管新生的作用。此外，在水溶性方面Tubulysins相比其它抗癌药物有着明显的优势，其对特定的癌细胞表现出超强的抗癌活性，使其成为新型抗癌新药研发中颇受关爱的目标分子之一(如表1所示)。
表1 N14-Desacetoxytubulysin H对人癌细胞的体外细胞毒活性
通过粘细菌发酵来实现生物合成，但只能合成很少量的Tubulysins，不到4毫克/升，而且还需要几个非常繁琐的纯化步骤，因而不利于工业化生产。
从Tubulysins几年很短的发展历程看，Tubulysins以其独有的生物活性正在受到越来越多人的关注，可能在未来的几年会成为抗肿瘤药物中的明星分子。但其在合成上并不理想，至今Tubulysis及其类似物化学合成上报道的文献有几十篇，而合成路线大部分不是很完美，存在很大进一步探索的空间。
因此，有必要提供一种简洁，快速，可以大量合成Tubulysis的制备方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种生物活性肽N14-DesacetoxytubulysinH的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、制备TUV片段(2)；
步骤2、制备生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H。
可选地，所述步骤1中的制备TUV片段(2)具体为：
其合成路线为：
包括以下步骤：
步骤1.1、化合物10的合成：
首先按文献(Macromolecules,2012,45(20):8172-8192)制得化合物9；
将化合物9溶于甲醇，加入苯甲醛，加热回流反应4h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠，然后于室温下搅拌反应12h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；
加入四氢呋喃/水混合溶剂，同时加入碳酸氢钠，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯，30min后升到室温搅拌反应12h，减压浓缩，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物10；
步骤1.2、化合物11的合成：
将化合物10溶于DMSO，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，于室温下搅拌反应3h后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用1M的KHSO4溶液洗，水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；
加入二氯甲烷，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌反应10h后，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物11；
步骤1.3、化合物13的合成：
将化合物11溶于甲醇，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体12；
将上述中间体12溶于无水四氢呋喃，冰水浴冷却下加入硼氢化钠和单质碘，30分钟后将溶液加热回流反应15h，冰水浴冷却到0℃，加甲醇淬灭反应，减压浓缩，将残余物溶于水，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物13；
步骤1.4、化合物14的合成：
将化合物13溶于无水二氯甲烷，加入PCC，于室温下搅拌反应4h后，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；
加入二甲亚砜，同时加入亚硝基苯和L-脯氨酸，于室温下搅拌反应1h，冰水浴冷却到0℃，加入甲醇和硼氢化钠，搅拌反应30分钟后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第二淋洗剂快速柱层析得到中间体13’；
将上述中间体13’溶于乙醇，加入冰醋酸和锌粉，于室温下搅拌反应5h，加水稀释，冰水浴冷却到0℃，加氢氧化钠固体碱化溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第三淋洗剂快速柱层析得到化合物14；
步骤1.5、化合物15的合成：将化合物14溶于无水DMF，加入咪唑和4-二甲氨基吡啶，冰水浴冷却到0℃，加入叔丁基二甲基氯硅烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应14h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用KHSO4溶液洗两次，水洗，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物15；
步骤1.6、化合物17的合成：将化合物15溶于异丙醇，加入10％钯碳催化剂，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩；
加入无水二氯甲烷，同时加入化合物16，EDCI以及HOBt，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺，30分钟后恢复到室温搅拌反应20h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物17；
步骤1.7、化合物18的合成：将化合物17溶于无水DMF，冰水浴冷却到0℃，加入60％氢化钠，搅拌反应40分钟后滴加碘甲烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却到0℃，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物18；
步骤1.8、化合物19的合成：将化合物18溶于无水甲醇，加入氟化铵固体，于室温下搅拌反应6h，然后加饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物19；
步骤1.9、化合物Tuv片段(2)的合成：将化合物19溶于无水乙腈，加入2-碘酰基苯甲酸IBX，加热回流反应1.5h，冷却到室温，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；
加入无水甲醇，同时加入化合物20和三乙胺，于室温下搅拌反应15h，减压浓缩，然后用第二淋洗剂快速柱层析；
加入无水乙腈，同时加入活性二氧化锰，将溶液加热到60℃搅拌反应20h，然后冷却到室温，滴加DBU，10分钟再滴加三氯溴甲烷，于室温下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩，用淋洗剂快速柱层析得到Tuv片段(2)。
可选地，所述步骤1.1中的洗脱液为体积比为10：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.2中的洗脱液为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.3中的洗脱液为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯。
可选地，所述步骤1.4中的第一淋洗剂为体积比为10：1的石油醚和乙酸乙酯；第二淋洗剂为体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯；第三淋洗剂为体积比为1：20的甲醇和二氯甲烷。
可选地，所述步骤1.5、步骤1.6和步骤1.7中的淋洗剂为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.8中的淋洗剂为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯。
可选地，所述步骤1.9中的第一淋洗剂和第二淋洗剂为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯；第三淋洗剂为体积比为5：1的石油醚和乙酸乙酯。
可选地，所述步骤2中的制备生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的合成路线为：
包括以下步骤：
步骤2.1、化合物4的合成：将化合物2溶于THF，加入水和三苯基膦，加热回流反应3h，冷却到室温，减压浓缩，直接用流动相柱层析分离纯化；
加入无水二氯甲烷，同时加入化合物3，EDCI和HOBt，搅拌均匀后滴加三乙胺，于室温下搅拌反应15h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物4；
步骤2.2、将化合物4溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体，30min后升到室温搅拌反应3h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的PH＝2，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体酸4’；
将上述中间体酸4’溶于无水二氯甲烷，加入化合物5，EDCI和HOBt，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺，20分钟后恢复到室温搅拌反应18h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物6；
步骤2.3、将化合物6溶于三氟乙酸，冰水浴冷却，加入水，20分钟后恢复到室温搅拌反应5h，冰水浴冷却，加饱和碳酸钾溶液淬灭反应至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体6’；
将上述中间体6’溶于乙腈，加入37％的甲醛水溶液和氰基硼氢化钠，于室温下搅拌反应30分钟后，滴加冰醋酸至溶液的PH＝7，再于室温下搅拌反应12h后加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体7；
将上述中间体7溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体，30min后升到室温搅拌反应18h，冰水浴冷却，加三氟乙酸酸化至溶液的PH＝2，减压浓缩，得到中间体酸7’；
将该中间体酸7’溶于吡啶，加入乙酸酐，于室温下搅拌反应15h后减压浓缩，直接用流动相柱层析分离分离纯化得到终产物1。
可选地，所述步骤2.1中的流动相为体积比为1:20的甲醇和二氯甲烷；洗脱液为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯。
可选地，所述步骤2.2中的洗脱液为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯。
可选地，所述步骤2.3中的流动相为体积比为1:10的甲醇和二氯甲烷。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明路线符合绿色化学标准：利用可再生性资源、可回收、所用试剂毒性较小、反应经处理后对环境污染很小等；
2)本发明总产率高、立体选择性非常好(终产物的ee值在99％以上)、成本低、分离纯化简单方便、可用于大量制备。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法，其合成路线如下：
实施例1制备TUV片段(2)：
TUV片段(2)的合成路线如下：
包括以下步骤：
步骤1、化合物10的合成：
首先按文献(Macromolecules,2012,45(20):8172-8192)制得化合物9；
将化合物9(39g,378.15mmol)溶于甲醇(500mL)，加入苯甲醛(39mL,378.15mmol)，加热回流反应4h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠(43g,1.13mol)，然后于室温下搅拌反应12h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的PH＝10，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；
然后加入四氢呋喃/水(1:1，600mL)混合溶剂，加入碳酸氢钠(100g，1.19mol)，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(53mL，377mmol)，30min后升到室温搅拌反应12h，减压浓缩，加水(200mL)稀释，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1为洗脱液快速柱层析得化合物10为无色液体104g，两步产率84％。
合成的化合物10，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25-3.5(c1,CH2Cl2)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.15(m,11H),5.15(s,2H),4.69–4.54(m,1H),4.26(d,J＝15.8Hz,1H),3.69(s,2H),3.18(d,J＝5.3Hz,1H),2.41–2.19(m,1H),1.02–0.88(m,3H),0.87(d,J＝6.7Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ157.46,138.07,136.29,128.54,128.39,127.95,127.83,127.52,127.36,126.84,67.76,67.42,63.14,51.80,26.60,20.14,20.04；HR-ESIMS m/z:calculated for C20H25NO3 +[M+H]+:328.1834,found 328.1897.
步骤2、化合物11的合成：
将化合物10(60g,186.3mmol)溶于DMSO(200mL)，水浴冷却下加入三乙胺(78mL,560mmol)和三氧化硫-吡啶复合物(89g,560mmol)，于室温下搅拌反应3h后，加水(500mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用1M的KHSO4溶液(200mL)洗，水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干，加入二氯甲烷(500mL)，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(83.6g，240mmol)，于室温下搅拌反应10h后，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱液快速柱层析得化合物11，为无色液体59g，两步产率80％。
步骤3、化合物13的合成：
将化合物11(59g，149.2mmol)溶于甲醇(300mL)，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍(17.6g，74mmol)，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠(17.0g，448mmol)，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液(300mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体12；
将上述中间体12溶于无水四氢呋喃(300mL)，冰水浴冷却下加入硼氢化钠(7.0g，448mmol)和单质碘(38g，149.2mmol)，30分钟后将溶液加热回流反应15h，冰水浴冷却到0℃，加甲醇(300mL)淬灭反应，减压浓缩，将残余物溶于水(300mL)，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为洗脱液快速柱层析得化合物13为无色液体38.7g，两步产率73％。
合成的化合物13，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+21(c 0.5,CH2Cl2)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47–7.16(m,10H),5.20(d,J＝11.8Hz,2H),4.55(dd,J＝33.5,15.4Hz,1H),4.25(d,J＝15.9Hz,1H),3.78(s,1H),3.64(dd,J＝20.8,14.4Hz,1H),3.41(t,J＝6.0Hz,1H),3.29(t,J＝6.2Hz,1H),1.95–1.75(m,1H),1.75–1.53(m,1H),1.40(dd,J＝15.0,9.2Hz,2H),1.26(dd,J＝13.3,5.9Hz,1H),0.87(ddd,J＝35.2,24.8,6.6Hz,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.04,157.36,139.18,138.95,136.75,136.56,128.53,128.43,138.36,128.21,127.96,127.88,127.82,127.09,127.01,67.31,67.22,63.85,62.18,62.07,47.39,31.33,31.08,29.72,26.90,26.48,20.54,20.39,20.24,20.20；HR-ESIMS m/z:calculated for C22H29NO3 +[M+H]+:356.2147,found 356.2206.
步骤4、化合物14的合成：
将化合物13(38.7g,108.9mmol)溶于无水二氯甲烷(400mL)，加入PCC(47g,218mmol)，于室温下搅拌反应4h后，过滤，滤液减压浓缩，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1为淋洗剂快速柱层析；加入二甲亚砜(100mL)，同时加入亚硝基苯(11.6g,108mmol)和L-脯氨酸(2.5g,22mmol)，于室温下搅拌反应1h，冰水浴冷却到0℃，加入甲醇(100mL)和硼氢化钠(12.4g,327mmol)，搅拌反应30分钟后，加饱和碳酸氢钠溶液(150mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用石油醚：乙酸乙酯＝2：1为淋洗剂快速柱层析得到中间体13’；
将上述中间体13’溶于乙醇(150mL)，加入冰醋酸(50mL)和锌粉(21.4g,327mmol)，于室温下搅拌反应5h，加水(300mL)稀释，冰水浴冷却到0℃，加氢氧化钠固体碱化溶液的PH＝10，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用甲醇∶二氯甲烷1∶20为淋洗剂快速柱层析得到化合物14，浅黄色油状物22.2g，三步产率55％。
合成的化合物14，经1HNMR，13CNMR，HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+65(c1.4,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.17(m,10H),5.34–5.15(m,2H),4.68(d,J＝15.7Hz,1H),4.18–4.06(m,1H),3.97(s,1H),3.72(s,1H),3.30(d,J＝24.5Hz,1H),3.20(dd,J＝18.5,11.2Hz,2H),3.01(s,1H),2.14(s,1H),1.91(ddd,J＝25.3,14.5,9.3Hz,2H),1.54(ddd,J＝18.2,10.6,5.1Hz,1H),0.93(dd,J＝34.3,6.5Hz,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ157.98,138.30,136.43,136.05,128.34,128.26,127.98,127.94,127.88,127.25,68.75,68.46,67.62,67.30,66.38,66.08,60.55,60.21,46.85,33.51,29.85,20.28,20.23,20.02；HR-ESIMS m/z:calculated for C22H29NO4 +[M+H]+:372.2097,found 372.2146.
步骤5、化合物15的合成：
将化合物14(22.2g，59.8mmol)溶于无水DMF(50mL)，加入咪唑(20.4g,300mmol)和4-二甲氨基吡啶(14.7g,120mmol)，冰水浴冷却到0℃，加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)(25.6g,150mmol)，30分钟后恢复到室温搅拌反应14h，加水(500mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用1MKHSO4溶液(200mL)洗两次，水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤两次，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为淋洗剂快速柱层析得化合物15为无色液体32.3g，产率90％。
合成的化合物15，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+34(c1.0,MeOH)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.14(m,10H),5.17(ddd,J＝51.3,36.8,12.2Hz,2H),4.70–4.20(m,2H),3.96(s,1H),3.53(d,J＝15.5Hz,1H),3.31–3.18(m,1H),3.14(d,J＝4.9Hz,1H),1.77(d,J＝11.8Hz,2H),1.30(d,J＝15.1Hz,1H),0.99–0.73(m,24H),0.07–-0.11(m,12H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.08,156.87,139.41,136.76,136.63,128.44,128.34,128.24,127.92,127.78,127.70,127.26,126.91,126.76,71.19,71.08,67.55,67.47,67.37,66.94,60.91,48.05,31.99,31.69,26.03,25.98,25.88,20.26,20.09,19.92,18.34,-3.77,-3.95,-4.82,-5.40；HR-ESIMS m/z:calculated for C34H57NO4Si2+[M+H]+:600.3826,found 600.3893.
步骤6、化合物17的合成：
将化合物15(32.3g，53.8mmol)溶于异丙醇(150mL)，加入10％钯碳催化剂(10g)，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩；加入无水二氯甲烷(200mL)，同时加入化合物16(15.7g，100mmol)，EDCI(57.5g，300mmol)以及HOBt(40.5g,300mmol)，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺(55.6mL，400mmol)，30分钟后恢复到室温搅拌反应20h，加水(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用水(300mL)洗，饱和食盐水(300mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为淋洗剂快速柱层析得化合物17为油状物23.5g，两步产率85％。
合成的化合物17，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+18.5(c 0.5,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.29(d,J＝8.4Hz,1H),3.96(dd,J＝15.1,6.5Hz,1H),3.83(d,J＝4.6Hz,1H),3.74–3.65(m,1H),3.58(dd,J＝9.8,4.9Hz,1H),3.36(dd,J＝9.8,7.5Hz,1H),2.13–2.01(m,1H),1.91(td,J＝13.6,6.8Hz,1H),1.71–1.65(m,1H),1.56–1.44(m,2H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H),0.92–0.84(m,27H),0.08(t,J＝8.1Hz,12H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.18,70.67,70.37,66.97,51.47,38.23,35.14,31.69,25.86,24.31,18.39,18.23,18.03,17.72,15.97,11.46,-4.28,-4.81,-5.38；HR-ESIMS m/z:calculated for C25H54N4O3Si2 +[M+H]+:515.3734,found 515.3810.
步骤7、化合物18的合成：
将化合物17(20g,38.9mmol)溶于无水DMF(50mL)，冰水浴冷却到0℃，加入60％氢化钠(7.8g,195mmol)，搅拌反应40分钟后滴加碘甲烷(12.5mL,200mmol)，30分钟后恢复到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却到0℃，加饱和氯化铵水溶液(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用水(300mL)洗，饱和食盐水(300mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为淋洗剂快速柱层析得化合物18为油状物20.1g，产率98％。
合成的化合物18，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+51(c 0.21,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.42(t,J＝10.1Hz,1H),3.63–3.40(m,3H),3.34(ddd,J＝22.8,9.6,7.4Hz,1H),2.83(d,J＝11.1Hz,3H),2.17(dtd,J＝12.8,9.6,9.3,6.3Hz,1H),1.79(ddd,J＝10.6,8.4,3.9Hz,1H),1.72–1.64(m,1H),1.55(ddd,J＝14.8,7.9,2.0Hz,1H),1.33–1.22(m,2H),1.02–0.84(m,30H),0.18–0.03(m,12H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.96,70.82,70.63,66.50,63.54,56.51,34.82,33.79,29.90,25.45,25.43,24.68,19.62,18.84,15.38,10.18,-5.07,-5.88；HR-ESIMS m/z:calculated for C26H56N4O3Si2 +[M+H]+:529.3891,found 529.3957.
步骤8、化合物19的合成：
将化合物18(20.1g,38mmol)溶于无水甲醇(150mL)，加入氟化铵固体(70.4g,1.9mol)，于室温下搅拌反应6h，然后加饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为淋洗剂快速柱层析得化合物19为无色油状物13.4g，产率85％。
合成的化合物19，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+71(c1.0,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.34(td,J＝9.5,3.9Hz,1H),3.67(t,J＝4.3Hz,1H),3.58–3.36(m,3H),2.84(d,J＝21.3Hz,3H),2.16(ddd,J＝9.4,6.5,3.5Hz,1H),1.76–1.70(m,2H),1.33–1.21(m,2H),1.02–0.82(m,21H),0.18–0.05(m,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.63,71.61,66.41,63.82,57.18,35.22,34.18,30.65,29.96,25.84,25.11,20.05,19.17,18.02,15.72,10.61,-4.47,-4.60；HR-ESIMS m/z:calculated for C20H42N4O3Si+[M+H]+:415.3026,found 415.3114.
步骤9、Tuv片段(2)的合成：
将化合物19(13.4g,32.3mmol)溶于无水乙腈(150mL)，加入2-碘酰基苯甲酸IBX(27.2g,97mmol)，加热回流反应1.5h，冷却到室温，过滤，滤液减压浓缩，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为淋洗剂快速柱层析；
加入无水甲醇(150mL)，加入化合物20(16.7g,97mmol)和三乙胺(27.8ml,200mmol)，于室温下搅拌反应15h，减压浓缩，然后用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为淋洗剂快速柱层析；
加入无水乙腈(150mL)，同时加入活性二氧化锰(28.1g,323mmol)，将溶液加热到60℃搅拌反应20h，然后冷却到室温，滴加DBU(15mL,100mmol)，10分钟再滴加三氯溴甲烷(10mL,100mmol)，于室温下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩，用石油醚：乙酸乙酯＝5：1为淋洗剂快速柱层析得到Tuv片段(2)6.8g，三步产率40％。
合成的化合物2，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+24.0(c 0.51,MeOH)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(s,1H),4.93(dd,J＝6.6,3.7Hz,1H),4.49(s,1H),3.94(s,3H),3.53(d,J＝9.5Hz,1H),2.95(s,3H),2.23–2.15(m,1H),2.11–2.03(m,2H),1.82–1.77(m,1H),1.23(d,J＝3.4Hz,2H),1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.94–0.83(m,18H),0.20–0.07(m,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ179.14,170.71,162.96,147.40,128.58,90.29,72.12,65.16,53.34,41.58,36.10,31.47,26.16,21.21,20.24,19.11,17.11,11.75,-3.55,-3.73；HR-ESIMS m/z:calculated forC24H43N5O4SSi+[M+H]+:526.2805,found 525.2887.
实施例2生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的合成：
其合成路线如下：
包括以下步骤：
步骤1、化合物4的合成：
将化合物2(1g,1.9mmol)溶于THF(60mL),加入水(3mL)和三苯基膦(5.0g,19mmol)，加热回流反应3h，冷却到室温，减压浓缩，直接柱层析分离(流动相：甲醇∶二氯甲烷1∶20)分离纯化；
加入无水二氯甲烷(100mL)，加入化合物3(0.87g,3.8mmol)，EDCI(1.82g,9.5mmol)和HOBt(1.28g,9.5mmol)，搅拌均匀后滴加三乙胺(2.6mL,19mmol)，于室温下搅拌反应15h，加水(300mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱液快速柱层析得化合物4为油状物1.08g，产率80％。
合成的化合物4，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+7.5(c 0.345,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(s,1H),6.64(s,1H),4.98–4.82(m,2H),4.81–4.63(m,1H),4.45(s,1H),4.11(s,1H),3.93(s,3H),3.06(s,3H),2.72(d,J＝15.1Hz,1H),2.51(d,J＝9.7Hz,1H),2.30(s,1H),2.06(d,J＝6.1Hz,2H),1.86(s,2H),1.68(s,2H),1.60(d,J＝6.8Hz,2H),1.31–1.26(m,3H),1.15–1.02(m,2H),1.03–0.92(m,15H),0.93–0.72(m,9H),0.18(s,3H),-0.04(t,J＝14.2Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.80,173.13,170.73,161.91,146.41,127.42,80.41,71.05,53.75,52.24,40.61,37.09,30.41,29.67,28.32,25.82,20.57,20.08,19.44,16.16,10.97,-4.69,-4.83；HR-ESIMS m/z:calculated for C35H62N4O7SSi+[M+H]+:711.4108,found711.4165.
步骤2、化合物6的合成：
将化合物4(1.08g，1.52mmol)溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂(1:1:1,90mL)，冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体(1.26g，30mmol)，30min后升到室温搅拌反应3h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的PH＝2，乙酸乙酯(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体酸4’；
将上述中间体酸4’溶于无水二氯甲烷(100mL)，加入化合物5(0.77g,3mmol)，EDCI(2.91g,15.2mmol)和HOBt(2.05g,15.2mmol)，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺(4.2mL,30mmol)，20分钟后恢复到室温搅拌反应18h，加水(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝2：1为洗脱液快速柱层析得化合物6为油状物0.89g，产率65％。
合成的化合物6，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25+2.0(c 0.48,CHCl3)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),7.28–7.20(m,5H),6.73(d,J＝9.2Hz,1H),4.85–4.72(m,2H),4.51(d,J＝9.7Hz,1H),4.41(d,J＝3.8Hz,2H),3.95–3.87(m,1H),3.80–3.71(m,1H),3.64(s,3H),3.57–3.53(m,1H),3.49(dt,J＝11.2,6.7Hz,1H),3.00(d,J＝12.4Hz,2H),2.92(d,J＝6.2Hz,2H),2.74–2.57(m,4H),2.56–2.46(m,3H),2.39–2.17(m,8H),2.12–2.00(m,4H),1.72–1.57(m,8H),1.49(s,8H),1.18(d,J＝7.1Hz,3H),1.02(d,J＝6.5Hz,3H),0.98–0.78(m,23H),0.23–-0.15(m,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ176.16,175.90,172.61,170.44,167.26,160.20,155.80,149.02,143.11,136.91,130.36,128.99,128.30,127.84,127.23,126.00,122.40,113.49,79.96,70.35,68.21,65.01,53.06,51.18,49.64,47.83,44.20,40.46,40.30,37.43,36.72,35.99,31.39,30.48,30.04,29.77,29.63,29.16,28.82,27.80,25.28,22.15,20.02,19.56,18.93,18.65,17.28,13.58,13.19,10.52,-5.14,-5.39；HR-ESIMS m/z:calculated for C47H77N5O8SSi+[M+H]+:900.5262,found 900.5311.
步骤3、终产物N14-Desacetoxytubulysin H(1)的合成：
将化合物6(0.89g,0.99mmol)溶于三氟乙酸(40mL)，冰水浴冷却，加入水(40mL)，20分钟后恢复到室温搅拌反应5h，冰水浴冷却，加饱和碳酸钾溶液淬灭反应至溶液的PH＝10，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体6’；
将上述中间体6’溶于乙腈(50mL)，同时加入37％的甲醛水溶液(10mL)和氰基硼氢化钠(1g,15.9mmol)，于室温下搅拌反应30分钟后，滴加冰醋酸至溶液的PH＝7，再于室温下搅拌反应12h后加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体7；
将上述中间体7溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂(1:1:1,90mL)，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体(1.26g，30mmol)，30min后升到室温搅拌反应18h，冰水浴冷却，加三氟乙酸酸化至溶液的PH＝2，减压浓缩，得到中间体酸7’。
将该中间体酸7’溶于吡啶(40mL)，同时加入乙酸酐(20mL)，于室温下搅拌反应15h后减压浓缩，直接柱层析分离(流动相：甲醇∶二氯甲烷1∶10)分离纯化得到终产物10.36g，四步产率50％。
合成的化合物1，经1HNMR,13CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]D 25-18.5(c 0.9,MeOH)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.13(s,1H),7.23(s,4H),7.17(s,1H),5.71(d,J＝10.6Hz,1H),4.74(d,J＝7.5Hz,1H),4.46(s,2H),3.13(s,3H),3.01(s,1H),2.90(s,3H),2.42(s,1H),2.36(s,3H),2.16(s,3H),2.05(s,1H),1.90(s,4H),1.75(d,J＝13.1Hz,4H),1.42(s,1H),1.15(d,J＝6.0Hz,4H),1.05–0.99(m,6H),0.94(dd,J＝13.6,6.2Hz,12H)；13C NMR(101MHz,MeOD)δ174.90,171.92,171.16,163.18,150.89,139.92,131.13,130.72,129.51,127.62,125.90,71.47,68.94,56.56,55.94,51.24,43.66,42.91,35.84,31.17,30.96,25.50,24.75,23.90,21.07,20.76,20.54,19.48,11.45；HR-ESIMS m/z:calculated for C38H57N5O7S+[M+H]+:728.4057.Found:728.4089.
用HPLC测产物N14-Desacetoxytubulysin H的ee值大于99％。
表1合成的终产物生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的ee值结果
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备TUV片段(2)；
步骤2、制备生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的制备TUV片段(2)具体为：
其合成路线为：
包括以下步骤：
步骤1.1、化合物10的合成：
首先按文献(Macromolecules,2012,45(20):8172-8192)制得化合物9；
将化合物9溶于甲醇，加入苯甲醛，加热回流反应4h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠，然后于室温下搅拌反应12h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；
加入四氢呋喃/水混合溶剂，同时加入碳酸氢钠，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯，30min后升到室温搅拌反应12h，减压浓缩，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物10；
步骤1.2、化合物11的合成：
将化合物10溶于DMSO，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，于室温下搅拌反应3h后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用1M的KHSO4溶液洗，水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；
加入二氯甲烷，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌反应10h后，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物11；
步骤1.3、化合物13的合成：
将化合物11溶于甲醇，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体12；
将上述中间体12溶于无水四氢呋喃，冰水浴冷却下加入硼氢化钠和单质碘，30分钟后将溶液加热回流反应15h，冰水浴冷却到0℃，加甲醇淬灭反应，减压浓缩，将残余物溶于水，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物13；
步骤1.4、化合物14的合成：
将化合物13溶于无水二氯甲烷，加入PCC，于室温下搅拌反应4h后，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；
加入二甲亚砜，同时加入亚硝基苯和L-脯氨酸，于室温下搅拌反应1h，冰水浴冷却到0℃，加入甲醇和硼氢化钠，搅拌反应30分钟后，加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第二淋洗剂快速柱层析得到中间体13’；
将上述中间体13’溶于乙醇，加入冰醋酸和锌粉，于室温下搅拌反应5h，加水稀释，冰水浴冷却到0℃，加氢氧化钠固体碱化溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，用第三淋洗剂快速柱层析得到化合物14；
步骤1.5、化合物15的合成：将化合物14溶于无水DMF，加入咪唑和4-二甲氨基吡啶，冰水浴冷却到0℃，加入叔丁基二甲基氯硅烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应14h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用KHSO4溶液洗两次，水洗，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物15；
步骤1.6、化合物17的合成：将化合物15溶于异丙醇，加入10％钯碳催化剂，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩；
加入无水二氯甲烷，同时加入化合物16，EDCI以及HOBt，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺，30分钟后恢复到室温搅拌反应20h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物17；
步骤1.7、化合物18的合成：将化合物17溶于无水DMF，冰水浴冷却到0℃，加入60％氢化钠，搅拌反应40分钟后滴加碘甲烷，30分钟后恢复到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却到0℃，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物18；
步骤1.8、化合物19的合成：将化合物18溶于无水甲醇，加入氟化铵固体，于室温下搅拌反应6h，然后加饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用淋洗剂快速柱层析得化合物19；
步骤1.9、化合物Tuv片段(2)的合成：将化合物19溶于无水乙腈，加入2-碘酰基苯甲酸IBX，加热回流反应1.5h，冷却到室温，过滤，滤液减压浓缩，用第一淋洗剂快速柱层析；
加入无水甲醇，同时加入化合物20和三乙胺，于室温下搅拌反应15h，减压浓缩，然后用第二淋洗剂快速柱层析；
加入无水乙腈，同时加入活性二氧化锰，将溶液加热到60℃搅拌反应20h，然后冷却到室温，滴加DBU，10分钟再滴加三氯溴甲烷，于室温下搅拌反应4h，过滤，滤液减压浓缩，用淋洗剂快速柱层析得到Tuv片段(2)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1.1中的洗脱液为体积比为10：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.2中的洗脱液为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.3中的洗脱液为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1.4中的第一淋洗剂为体积比为10：1的石油醚和乙酸乙酯；第二淋洗剂为体积比为2：1的石油醚和乙酸乙酯；第三淋洗剂为体积比为1：20的甲醇和二氯甲烷。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1.5、步骤1.6和步骤1.7中的淋洗剂为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯；步骤1.8中的淋洗剂为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1.9中的第一淋洗剂和第二淋洗剂为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯；第三淋洗剂为体积比为5：1的石油醚和乙酸乙酯。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的制备生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的合成路线为：
包括以下步骤：
步骤2.1、化合物4的合成：将化合物2溶于THF，加入水和三苯基膦，加热回流反应3h，冷却到室温，减压浓缩，直接用流动相柱层析分离纯化；
加入无水二氯甲烷，同时加入化合物3，EDCI和HOBt，搅拌均匀后滴加三乙胺，于室温下搅拌反应15h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物4；
步骤2.2、将化合物4溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体，30min后升到室温搅拌反应3h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的PH＝2，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体酸4’；
将上述中间体酸4’溶于无水二氯甲烷，加入化合物5，EDCI和HOBt，搅拌均匀后冷却到0℃，滴加三乙胺，20分钟后恢复到室温搅拌反应18h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物6；
步骤2.3、将化合物6溶于三氟乙酸，冰水浴冷却，加入水，20分钟后恢复到室温搅拌反应5h，冰水浴冷却，加饱和碳酸钾溶液淬灭反应至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体6’；
将上述中间体6’溶于乙腈，加入37％的甲醛水溶液和氰基硼氢化钠，于室温下搅拌反应30分钟后，滴加冰醋酸至溶液的PH＝7，再于室温下搅拌反应12h后加饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体7；
将上述中间体7溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体，30min后升到室温搅拌反应18h，冰水浴冷却，加三氟乙酸酸化至溶液的PH＝2，减压浓缩，得到中间体酸7’；
将该中间体酸7’溶于吡啶，加入乙酸酐，于室温下搅拌反应15h后减压浓缩，直接用流动相柱层析分离分离纯化得到终产物1。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2.1中的流动相为体积比为1:20的甲醇和二氯甲烷；洗脱液为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2.2中的洗脱液为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2.3中的流动相为体积比为1:10的甲醇和二氯甲烷。
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