CN109662238B - 一种细菌素camt2大豆卵磷脂纳米脂质体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体及应用。所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体由大豆卵磷脂纳米包埋细菌素CAMT2得到，所述细菌素CAMT2的包埋率为60~75%。本发明利用大豆卵磷脂对细菌素CAMT2进行纳米包埋得到的纳米脂质体可保护细菌素CAMT2使其不被降解或其它成分的干扰，提高了抗菌活性的稳定性；另外，纳米脂质体为纳米颗粒，因其粒径小，增加了其扩散性，使其更容易接近被抑制的食源性腐败菌或病源菌。纳米脂质体化后也增加了其表面积，使得纳米大豆卵磷脂细菌素与腐败菌或病源菌作用的面积增大，从而增强了其抗菌活性。

Description

一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米 脂质体及应用。
背景技术
随着生活质量的日渐提高，人们对食品的需求无论是从种类、营养还是安全 性方面都有了很大的提高。而营养丰富的各类食品，在收获、加工、运输、贮藏 以及销售的过程中很容易发生腐败变质，从而造成经济上的巨大损失，严重时甚 至还会引发食品安全问题，危害消费者的身心健康。因此，采取有效的食品保鲜 措施始终是保证食品安全的研究热点。在我国，食品的防腐保鲜技术还比较欠缺， 肉类、果蔬、水产品在流通过程中的腐损率仍达到了12％、30％和15％，每年 仅果蔬采后由腐烂所导致的损失也高达8000万吨，造成的直接经济损失接近750 亿元人民币。导致食品腐败变质的因素有很多，如收获中产生的损伤、食品本身 的生理失衡、加工技术的缺陷以及运输和贮藏条件的不当等，但最终使食品品质 降低的最直接的原因还是腐败或致病微生物的滋生与繁殖。因此，如何有效地避免腐败或致病微生物的污染及抑制其在食品中的生长繁殖则是改善并解决食品 腐败变质问题的关键。
防止食品腐败变质的方法有很多种，如低温保藏、真空包装、干燥、高渗、 添加防腐剂等，其中最普遍和有效的方法是通过添加防腐剂来达到防腐的目的。 化学防腐剂作为抑制腐败或致病微生物生长繁殖最有效的一类防腐剂，目前为止 一直被广泛应于食品防腐保鲜领域。然而，有些化学防腐剂却逐渐表现出一定的 安全隐患，如亚硝酸盐和硝酸盐的致癌作用、亚硫酸盐的致过敏性反应以及苯甲 酸钠的致毒致癌作用等，增强了人们对化学防腐剂的抵制心理。于是，科研工作 者将研究方向逐渐转移到那些既可抗菌又无毒副作用且无残留的天然生物防腐 剂的开发与应用上来。生物防腐剂是指经过生物培养、提取和分离技术获得的一 类具有抑制或杀灭微生物作用的天然防腐剂，根据来源的不同，可以分为动物源、 植物源和微生物源防腐剂。由于植物和动物的生长繁殖易受环境、季节等因素的 影响且生产成本高，因此，由微生物代谢产生的具有抗菌活性的物质成为生物防 腐剂的研究热点。其中，细菌素作为微生物源防腐剂中的典型代表，尤其是随着 乳酸链球菌素(Nisin)被批准作为安全的食品防腐剂应用于食品工业中，细菌 素作为食品防腐剂的研究越来越受到人们的重视。
然而，细菌素作为天然的生物防腐剂在食品的应用中还存在诸多问题。其中， 产量过低，生产成本高是制约细菌素在食品中广泛应用的一个最基础的因素；此 外，细菌素在食品中进行防腐应用时，容易与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白 质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，减小了细菌素与腐败或致病微生物 接触的有效浓度，从而降低了其生物可利用率和抗菌功效。这些问题的存在都极 大地限制了微生物细菌素的开发与应用。
细菌素CAMT2是由一株海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成的一种 新型细菌素，具有比已商业化应用的乳酸链球菌素(Nisin)更广的抗菌谱(Nisin 只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而CAMT2对革兰氏阴性菌也有抗菌作用)。但 CAMT2天然的生物防腐剂同样存在容易与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白质、 美拉德反应的产物等)发生不良的反应，生物可利用率和抗菌功效降低的问题。
因此，开发一种可避免细菌素CAMT2与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白 质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，提高细菌素CAMT2的生物可利用 率和抗菌功效的产品具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中细菌素易受食品中复杂成分的影响，生物 可利用率和抗菌功效低的缺陷和不足，提供一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米 脂质体。本发明提供的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体可以有效保护细菌 素CAMT2的活性，进而增强其在复杂食品体系中的抗菌防腐效果。
本发明的另一目的在于提供上述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体作 为天然防腐剂在抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种抑制食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方 法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，所述纳米脂质体由大豆卵磷脂 纳米包埋细菌素CAMT2得到，所述细菌素CAMT2的包埋率为60～75％，所述 细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ZJHD3-06代 谢合成得到，所述海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens ZJHD3-06于 2016年12月15日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2016756，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成得到，具体可 参考文献：Purification and characterization of a novel bacteriocin CAMT2 produced byBacillus amyloliquefaciens isolated from marine fish Epinephelus areolatus，Food Control。
本发明通过多次研究发现，将细菌素CAMT2制备为特定的纳米脂质体可避 免细菌素CAMT2与食品中的复杂成分(如脂肪、蛋白质、美拉德反应的产物等) 发生不良的反应，有效提高生物可利用率和抗菌功效。
经研究发现，大豆卵磷脂所具有的亲水性和疏水性特性，在包埋细菌素 CAMT2的过程中可以起到乳化作用，并在纳米卵磷脂的作用下形成一个良好的 容合体系，成为疏水性、亲水性及两亲性的纳米结构脂质载体，该载体可将细菌 素CAMT2以镶嵌、吸附或溶解的方式存于脂质基质中，并且保护细菌素CAMT2 使其不被降解或其它成分的干扰，提高了抗菌活性的稳定性。另外，形成的纳米 颗粒，因其粒径小，增加了其扩散性，使其更容易接近被抑制的食源性腐败菌或 病源菌。纳米脂质体化后也增加了其表面积，使得纳米大豆卵磷脂细菌素与腐败 菌或病源菌作用的面积增大，从而增强了其抗菌活性。
将利用大豆卵磷脂对细菌素CAMT2进行纳米包埋，并对细菌素CAMT2的 包埋量进行调控，得到的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的抗菌活性非但 不会受到大豆暖磷脂本身的影响，还具有更佳的稳定性和抗菌活性。
将粒子尺寸、分散指数PDI和Zeta电位控制在合理的范围，可进一步使得 所包埋的活性物质(细菌素CAMT2)因粒子间的碰撞、聚沉而突然释放的频率 会有所降低，进而使得抗菌物质顺利到达靶向位置，精准缓慢释放的频率大大增 加，从而高效地表达所包埋的细菌素CAMT2的抗菌活性。
优选地，所述纳米脂质体的粒径为180～200nm。
一般情况下，纳米脂质体的粒径越小，其扩散性与靶向性越好，与目标菌接 触的表面积也越大，抗菌效果也就越好。
更为优选地，所述纳米脂质体的粒径为186.0nm。
优选地，所述纳米脂质体的分散指数PDI≤0.3。
PDI值越小，纳米颗粒就越均匀。
更为优选地，所述纳米脂质体的分散指数PDI为0.231。
优选地，所述纳米脂质体的Zeta电位为-60～-40mV。
优选地，所述细菌素CAMT2的包埋率为70％。
上述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体作为天然防腐剂在抑制食品腐 败或致病微生物生长繁殖中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明提供的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体可作为天然防腐剂，并 以直接添加、固定化在包装袋或保鲜膜上、与其他防腐保鲜技术共同应用等方式 来抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖。
一种抑制食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：向含有单 核细胞增生李斯特氏菌的食品中加入上述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质 体，静置6～8天。
优选地，所述食品为液态食品。
更为优选地，所述液态食品为全脂牛奶或脱脂牛奶。
优选地，所述方法中细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的加入量为 0.1～1.0g/Kg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用大豆卵磷脂对细菌素CAMT2进行纳米包埋得到的纳米脂质体 可保护细菌素CAMT2使其不被降解或其它成分的干扰，提高了抗菌活性的稳定 性；另外，纳米脂质体为纳米颗粒，因其粒径小，增加了其扩散性，使其更容易 接近被抑制的食源性腐败菌或病源菌。纳米脂质体化后也增加了其表面积，使得 纳米大豆卵磷脂细菌素与腐败菌或病源菌作用的面积增大，从而增强了其抗菌活 性。
附图说明
图1为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的显微形态；
图2为细菌素CAMT2溶液的标准曲线；
图3为单核细胞增生李斯特氏菌悬液浓度为OD600＝0.03时对应的菌落计数 结果；
图4为牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的计数结果；
图5为细菌素CAMT2对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结 果；
图6为细菌素CAMT2对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结 果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域 常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明， 均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的 基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，通过如下制备方 法制备得到：
称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解， 随后向溶液中加入0.05mol/L的硫酸亚铁铵溶液，涡旋震荡后于40KHz、30℃ 条件下超声5min；然后加入500μL CAMT2溶液(100mg/mL)，振荡后形成 油包水的乳状液，在40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反 相微乳液分散体系；将该体系中置于磁力加热搅拌器中，在50℃、450r/min的 条件下加热搅拌3h；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷至圆底 烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶；最后加入5mL超纯水并于40KHz、30℃ 条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质 体。样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential 进行测定。同时将制备好的样品保存于4℃冰箱中，每隔一段时间取样对其Size、 PDI和Zeta potential进行测定，并对其稳定性进行监测。
如图1，为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的显微形态结果，A和B 分别为大豆卵磷脂纳米脂质体(未包埋细菌素CAMT2)在放大倍数80000×和 150000×下的显微形态；C和D分别为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在 放大倍数80000×和150000×下的显微形态。由图可以看出，包含与未包含细菌 素CAMT2的大豆卵磷脂纳米脂质体都呈现出相似的球形形态；从纳米脂质体之 间的分布状态来看也都比较均匀，未出现聚集的现象，表明它们具有良好的稳定 性；通过对比大豆卵磷脂纳米脂质体和细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的 表观颜色可以看出，细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的颜色比大豆卵磷脂纳米脂质体要深，间接反映出细菌素CAMT2被大豆卵磷脂成功包埋。
利用Nano-ZS90纳米粒度电位分析仪对本实施例提供的细菌素CAMT2大豆 卵磷脂纳米脂质体粒度、多分散性指数和电位进行测定，测试结果如表1。
(1)细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体粒度、多分散性指数的测定
采用动态光散射法(Dynamic Light Scattering，DLS)测定细菌素CAMT2 大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度和多分散指数。以氦氖激光(λ＝632.8nm)作为光 源，固定散射角为90°，测定温度为25℃。取1287μL超纯水于四面透光的石 英比色皿中，然后加入制备好的大豆卵磷脂纳米脂质体13μL(即将纳米脂质体 样品稀释100倍)，混匀后将比色皿置于纳米粒度电位分析仪的测试槽中，在粒 度测定的模式下进行测定。每个样品测定3次，取平均值。
(2)大豆卵磷脂纳米脂质体电位的测定
大豆卵磷脂纳米脂质体的电位是基于激光多普勒微电泳的原理进行测定的。 将稀释100倍的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体样品从石英比色皿中转移 到用于电位测定的特定装置中，然后同样置于纳米粒度电位分析仪的测试槽中， 在电位测定的模式下进行测定。每个样品测定3次，取平均值。
表1细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体粒度Size、多分散性指数PDI 和电位Zetapotential
4℃下保存天数(d) Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
0 186.0±3.0<sup>a</sup> 0.231±0.010<sup>a</sup> -56.2±0.6<sup>a</sup>
15 187.2±2.0<sup>a</sup> 0.235±0.009<sup>ab</sup> -56.3±0.5<sup>a</sup>
30 191.6±1.8<sup>ab</sup> 0.255±0.006<sup>ab</sup> -57.2±0.5<sup>ab</sup>
60 195.0±1.9<sup>b</sup> 0.261±0.009<sup>b</sup> -58.4±0.7<sup>b</sup>
注：显著性水平α＝0.05，每列中右上角含相同字母则差异不显著，反之则显著。
由表1可知，刚制备好的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度约为 186nm，PDI值为0.231，Zeta值为-56.2mV。细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米 脂质体在4℃下可以稳定保存2个月左右，表明其在冷藏条件下具有较好的稳 定性。
对细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的包埋率进行测定 (3)包埋率的测定
1.细菌素CAMT2溶液标准曲线的制备：
配置浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的细菌素CAMT2溶液，测定其在 275nm处的吸光值，绘制细菌素CAMT2溶液的标准曲线。
2.包埋率的测定
采用紫外吸收光谱法测定大豆卵磷脂纳米脂质体对细菌素CAMT2的包埋 率。使用Ultracel YM-30超滤膜将刚制备好的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂 质体分散体系于5000×g、4℃下离心15min，被纳米脂质体包埋的细菌素 CAMT2截留在上层，未被纳米脂质体包埋的细菌素CAMT2留在滤液中，收集 滤液，测定其在275nm处的吸光值，根据CAMT2溶液的标准曲线计算滤液中 CAMT2的含量，并通过以下公式计算出细菌素CAMT2的包埋率。
Figure BDA0001886054190000071
如图2，为细菌素CAMT2溶液的标准曲线，所得标准方程为y＝0.55381x+ 0.05964(R2＝0.99925)，表明细菌素CAMT2溶液在此浓度范围内具有良好的线 性关系。经测定，超滤后的滤液在275nm处的吸收值为2.1363，滤液的体积为 4mL，根据标准方程及包埋率的计算公式可以得出大豆卵磷脂纳米脂质体对细 菌素CAMT2的包埋率约70％。
应当理解的是，在其它条件保持不变的情况下，调整制备方法中细菌素 CAMT2的用量，可得到其它包埋率的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体。
应用试验例1
本应用试验例考察细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在纯牛奶中对单 核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果，通过如下过程实现。
(1)单核细胞增生李斯特氏菌的活化与保存
单核细胞增生李斯特氏菌的活化：用无菌注射器的针头取适量的单核细胞增 生李斯特氏菌冻干粉于50mL已灭菌的酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSB-YE) 培养基中，在37℃、120r/min的条件下培养至对数生长期(15h左右)，作为 活化种子液。
单核细胞增生李斯特氏菌的保存：取活化后的单核细胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE培养基上进行三区划线培养，于37℃恒温培养箱中培养24h后，作为 纯化的第一代，如此纯化2～3代后，挑取平板上的单菌落转接至TSA-YE试管斜 面进行划线培养，37℃恒温培养24h后置于4℃冰箱保存备用。
(2)单核细胞增生李斯特氏菌标准菌悬液的配制
取试管斜面保存的单核细胞增生李斯特氏菌于含有0.85％生理盐水的无菌 试管中，用移液枪吸打混匀后测定菌悬液在600nm处的吸光值(OD600)，适当 调整菌悬液的浓度使OD600约为0.03，将此菌悬液进行十倍稀释后采用倾注法进 行菌落计数。经计数，此浓度的菌悬液中单核细胞增生李斯特氏菌的菌量约为 3.32×107CFU/mL，然后将该菌悬液稀释100倍后即得到约105CFU/mL的单核 细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液。
图3为单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液浓度为OD600＝0.03时对应的菌落计 数结果。其中A、B、C是三个平行，且它们的稀释倍数为10-4，倾注时菌悬液 的用量为100μL，37℃恒温培养24h后，经过计数，A、B、C三个平板上的 菌落数分别为308、321、366个，换算后总的菌量分别为3.08×107、3.21×107、 3.66×107CFU/mL，对A、B、C取平均值，得到菌悬液浓度为OD600＝0.03时， 单核细胞增生李斯特氏菌的菌量为3.32×107CFU/mL。因此，将此浓度的菌悬液 再稀释100倍即得到约105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液，用 于制备含定量单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型。
(3)含单核细胞增生李斯特氏菌牛奶模型的建立
取100μL配制的105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液于10 mL牛奶中，混合均匀后采用倾注法对牛奶中的单核细胞增生李斯特氏菌进行计 数，得到含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型，作为测定细菌素 CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体抑制食品中单核细胞增生李斯特氏菌效果的载体。
牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的计数结果见图4。其中A、B、C是三个 平行，且它们的稀释倍数为100(未稀释)，倾注时牛奶的用量为100μL，37℃ 恒温培养24h后，经过计数，A、B、C三个平板上的菌落数分别为139、163、 192个，换算后总的菌量分别为1.39×103、1.63×103、1.92×103CFU/mL，对A、 B、C取平均值，得到牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的菌量为1.65×103CFU/mL。 此结果表明含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型建立成功，可用 于细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体接下来在牛奶中的防腐实验。
(4)脱脂牛奶的制备
取买到的新鲜纯牛奶于50mL已灭菌的离心管中，配平后置于离心机中于 4℃、5000rpm/min的条件下离心10min，去除上层的脂肪，即得到脱脂牛奶， 经灭菌处理后于4℃保存备用。
(5)CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的 抑制效果
取4支已灭菌的50mL离心管，编号1、2、3、4，取含103CFU/mL单核 细胞增生李斯特氏菌的全脂牛奶模型，摇匀后取100μL牛奶样品经适当稀释后 采用倾注法进行菌落计数，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的起 始菌量，最后向4支离心管中分别加入1mL无菌水、大豆卵磷脂纳米脂质体、 细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体和细菌素CAMT2溶液，摇匀后置于4℃ 冰箱中，保存1、2、4、6、8、10d后，分别测定4支离心管中单核细胞增生李 斯特氏菌的数量。每个样品重复3次，取平均值。
细菌素CAMT2对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果见 图5(注：空纳米脂质体指大豆卵磷脂纳米脂质体，CAMT2纳米脂质体指细菌 素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体)。由图可知，经无菌水(阴性对照)和大豆 卵磷脂纳米脂质体(空白对照)处理的牛奶，其单核细胞增生李斯特氏菌的菌量 随着保藏时间的延长而逐渐增加，6d后菌量达到最大值，并基本保持稳定，此 结果表明，大豆卵磷脂纳米脂质体在全脂牛奶中对单核细胞增生李斯特氏菌无抗 菌活性。经细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体(实验组)和游离的细菌素 CAMT2(阳性对照)处理的牛奶，0～4d，单核细胞增生李斯特氏菌的菌量都逐 渐降低，但实验组降低的速率比阳性对照组慢，可能是由于细菌素CAMT2发挥 抗菌作用前首先需要从纳米脂质体中释放出来；4d后，阳性对照组的菌量又开 始升高，表明有效的细菌素CAMT2被消耗殆尽，从而不能继续抑制单核细胞增 生李斯特氏菌的生长繁殖，而实验组的菌量则继续缓慢降低，直到8d时数量降 为0，且10d时依旧未检出，表明在8d时单核细胞增生李斯特氏菌已全部被杀 死。对比阳性对照组和实验组的结果可以得出，阳性对照组中能有效发挥抗菌作 用的细菌素CAMT2的总量应该低于实验组。
(6)细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特 氏菌的抑制效果
取4支已灭菌的50mL离心管，编号1、2、3、4，取含103CFU/mL单核 细胞增生李斯特氏菌的脱脂牛奶模型，摇匀后取100μL牛奶样品经适当稀释后 采用倾注法进行菌落计数，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的起 始菌量，最后向4支离心管中分别加入1mL无菌水、大豆卵磷脂纳米脂质体、 细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体和CAMT2溶液，摇匀后置于4℃冰箱中， 保存1、2、4、6、8、10d后，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌 的数量。每个样品重复3次，取平均值。
细菌素CAMT2对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果见 图6。由图可知，经无菌水(阴性对照)和大豆卵磷脂纳米脂质体(空白对照) 处理的牛奶，其单核细胞增生李斯特氏菌的菌量随保藏时间的变化情况与在全脂 牛奶中的结果相似，即6d前逐渐升高，随后基本保持稳定，此结果表明，大豆 卵磷脂纳米脂质体在脱脂牛奶中对单核细胞增生李斯特氏菌也无抗菌活性。经细 菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体(实验组)和游离的细菌素CAMT2(阳性 对照)处理的牛奶，0～2d，单核细胞增生李斯特氏菌的菌量都逐渐降低，但阳 性对照组降低的速率比实验组快，且2d时，阳性对照组中的单核细胞增生李斯 特氏菌已全部被杀死；实验组的菌量在2～6d继续缓慢降低，到6d时，菌量也 降为0，且不再随保藏时间的延长而升高。对比阳性对照组和实验组的结果可以 得出，被大豆卵磷脂纳米脂质体包埋的细菌素CAMT2发挥抗菌功效的速率比游 离的CAMT2要慢，这表明被包埋的细菌素CAMT2要发挥抗菌作用需要经过一 个从纳米脂质体中缓慢释放的过程。
从上述结果可知，在全脂牛奶中，被包埋的CAMT2在8d时可彻底杀灭单 核细胞增生李斯特氏菌，而游离的CAMT2只在前4d对单核细胞增生李斯特氏 菌有一定的抑制作用，4d后菌量又逐渐升高，这可能是因为牛奶中的脂肪与阳 性对照组中游离的CAMT2发生了相互作用，使能发挥抗菌作用的CAMT2的有 效浓度降低，导致杀菌作用不彻底，而经纳米化包埋的CAMT2则有效地避免了 此类作用的影响，表现出更好地抗菌效果；
在脱脂牛奶中，游离和被包埋的CAMT2可分别在2d和6d时杀灭其中的 单核细胞增生李斯特氏菌，游离的CAMT2相比于被包埋的CAMT2更快速地达 到了杀菌的效果，说明在没有脂肪存在的情况下，游离的CAMT2能更好地发挥 抗菌效果，而被包埋的CAMT2则需通过缓慢释放来发挥抗菌作用。

Claims (8)

1.一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体由大豆卵磷脂纳米包埋细菌素CAMT2得到，所述细菌素CAMT2的包埋率为60～75％，所述细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成得到，所述海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06于2016年12月15日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2016756；
所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体通过如下过程制备得到：称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，随后向溶液中加入0.05mol/L的硫酸亚铁铵溶液，涡旋震荡后于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL CAMT2溶液，振荡后形成油包水的乳状液，在40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；将该体系中置于磁力加热搅拌器中，在50℃、450r/min的条件下加热搅拌3h；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶；最后加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体；所述CAMT2溶液的浓度为100mg/mL。
2.根据权利要求1所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的粒径为180～200nm。
3.根据权利要求1所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的粒径为186.0nm。
4.根据权利要求1所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的分散指数PDI≤0.3。
5.根据权利要求4所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的分散指数PDI为0.231。
6.根据权利要求1所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的Zeta电位为-60～-40mV。
7.根据权利要求6所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，所述纳米脂质体的Zeta电位为-56.2mV。
8.权利要求1～7任一所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体作为天然防腐剂在抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63107742A (ja) * 1986-05-20 1988-05-12 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規な機能性リポソ−ム及びその製造法
JPH08231417A (ja) * 1994-12-28 1996-09-10 Chugai Pharmaceut Co Ltd エリスロポエチンのリポソーム製剤
CN1771938A (zh) * 2004-11-09 2006-05-17 胡才忠 茴三硫脂质体及其制备方法
CN106501525A (zh) * 2016-09-30 2017-03-15 江苏大学 一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63107742A (ja) * 1986-05-20 1988-05-12 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規な機能性リポソ−ム及びその製造法
JPH08231417A (ja) * 1994-12-28 1996-09-10 Chugai Pharmaceut Co Ltd エリスロポエチンのリポソーム製剤
CN1771938A (zh) * 2004-11-09 2006-05-17 胡才忠 茴三硫脂质体及其制备方法
CN106501525A (zh) * 2016-09-30 2017-03-15 江苏大学 一种测定脂质囊泡中蛋白或多肽类药物包封率的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Purification and characterization of a novel bacteriocin CAMT2 produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from marine fish Epinephelus areolatus;An, Junying 等;《FOOD CONTROL》;20151231;第51卷;第278-282页 *
胰岛素脂质体的结构特点;张 等;《药学学报》;20011231(第06期);第448-451页 *

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