CN109619368B - 一种细菌素camt2大豆卵磷脂纳米脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细菌素camt2大豆卵磷脂纳米脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：S1：将大豆卵磷脂溶解于有机溶剂，超声，然后加入CAMT2溶液，振荡形成油包水的乳状液后，超声得到反相微乳液分散体系；S2：在40~60℃下对反相微乳液分散体系搅拌1~12 h，然后利用旋转蒸发除去分散体系中的有机溶剂得有机凝胶；S3：向有机溶胶中加入水，超声，过滤后即得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体。本发明利用反相蒸发法来实现大豆卵磷脂对细菌素CAMT2的纳米包埋，得到的纳米脂质体可保护细菌素CAMT2使其不被降解或其它成分的干扰，抗菌活性的稳定性提高，抗菌活性增强。

Description

一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
随着生活质量的日渐提高，人们对食品的需求无论是从种类、营养还是安全性方面都有了很大的提高。而营养丰富的各类食品，在收获、加工、运输、贮藏以及销售的过程中很容易发生腐败变质，从而造成经济上的巨大损失，严重时甚至还会引发食品安全问题，危害消费者的身心健康。因此，采取有效的食品保鲜措施始终是保证食品安全的研究热点。在我国，食品的防腐保鲜技术还比较欠缺，肉类、果蔬、水产品在流通过程中的腐损率仍达到了12％、30％和15％，每年仅果蔬采后由腐烂所导致的损失也高达8000万吨，造成的直接经济损失接近750亿元人民币。导致食品腐败变质的因素有很多，如收获中产生的损伤、食品本身的生理失衡、加工技术的缺陷以及运输和贮藏条件的不当等，但最终使食品品质降低的最直接的原因还是腐败或致病微生物的滋生与繁殖。因此，如何有效地避免腐败或致病微生物的污染及抑制其在食品中的生长繁殖则是改善并解决食品腐败变质问题的关键。
防止食品腐败变质的方法有很多种，如低温保藏、真空包装、干燥、高渗、添加防腐剂等，其中最普遍和有效的方法是通过添加防腐剂来达到防腐的目的。化学防腐剂作为抑制腐败或致病微生物生长繁殖最有效的一类防腐剂，目前为止一直被广泛应于食品防腐保鲜领域。然而，有些化学防腐剂却逐渐表现出一定的安全隐患，如亚硝酸盐和硝酸盐的致癌作用、亚硫酸盐的致过敏性反应以及苯甲酸钠的致毒致癌作用等，增强了人们对化学防腐剂的抵制心理。于是，科研工作者将研究方向逐渐转移到那些既可抗菌又无毒副作用且无残留的天然生物防腐剂的开发与应用上来。生物防腐剂是指经过生物培养、提取和分离技术获得的一类具有抑制或杀灭微生物作用的天然防腐剂，根据来源的不同，可以分为动物源、植物源和微生物源防腐剂。由于植物和动物的生长繁殖易受环境、季节等因素的影响且生产成本高，因此，由微生物代谢产生的具有抗菌活性的物质成为生物防腐剂的研究热点。其中，细菌素作为微生物源防腐剂中的典型代表，尤其是随着乳酸链球菌素(Nisin)被批准作为安全的食品防腐剂应用于食品工业中，细菌素作为食品防腐剂的研究越来越受到人们的重视。
然而，细菌素作为天然的生物防腐剂在食品的应用中还存在诸多问题。其中，产量过低，生产成本高是制约细菌素在食品中广泛应用的一个最基础的因素；此外，细菌素在食品中进行防腐应用时，容易与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，减小了细菌素与腐败或致病微生物接触的有效浓度，从而降低了其生物可利用率和抗菌功效。这些问题的存在都极大地限制了微生物细菌素的开发与应用。
细菌素CAMT2是由一株海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成的一种新型细菌素，具有比已商业化应用的乳酸链球菌素(Nisin)更广的抗菌谱(Nisin只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而细菌素CAMT2对革兰氏阴性菌也有抗菌作用)。但细菌素CAMT2天然的生物防腐剂同样存在容易与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，生物可利用率和抗菌功效降低的问题。
因此，开发一种可避免细菌素CAMT2与食品中复杂的成分(如脂肪、蛋白质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，提高细菌素CAMT2的生物可利用率和抗菌功效的产品具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中细菌素易受食品中复杂成分的影响，生物可利用率和抗菌功效低的缺陷和不足，提供一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的制备方法。本发明利用反相蒸发法制备得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，该细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体可以有效保护细菌素CAMT2的活性，进而增强其在复杂食品体系中的抗菌防腐效果。
本发明的另一目的在于一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体。
本发明的另一目的在于提供上述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体作为天然防腐剂在抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：
S1：将大豆卵磷脂溶解于有机溶剂，超声，然后加入细菌素CAMT2溶液，振荡形成油包水的乳状液后，超声得到反相微乳液分散体系；所述大豆卵磷脂和细菌素CAMT2的质量比1:0.18～0.71；
S2：在40～60℃下对反相微乳液分散体系搅拌1～12h，然后利用旋转蒸发除去分散体系中的有机溶剂得有机凝胶；
S3：向有机溶胶中加入水，超声，过滤后即得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体；
所述细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensZJHD3-06代谢合成得到，所述海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensZJHD3-06于2016年12月15日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M2016756，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成得到，具体可参考文献：海洋源解淀粉芽孢杆菌细菌素CAMT2发酵优化、分离及抗菌机理研究。
本发明通过多次研究发现，将细菌素CAMT2制备为特定的纳米脂质体可避免细菌素CAMT2与食品中的复杂成分(如脂肪、蛋白质、美拉德反应的产物等)发生不良的反应，有效提高生物可利用率和抗菌功效。
经研究发现，大豆卵磷脂所具有的亲水性和疏水性特性，在包埋细菌素CAMT2的过程中可以起到乳化作用，并在纳米卵磷脂的作用下形成一个良好的容合体系，成为疏水性、亲水性及两亲性的纳米结构脂质载体，该载体可将细菌素CAMT2以镶嵌、吸附或溶解的方式存于脂质基质中，并且保护细菌素CAMT2使其不被降解或其它成分的干扰，提高了抗菌活性的稳定性。另外，形成的纳米颗粒，因其粒径小，增加了其扩散性，使其更容易接近被抑制的食源性腐败菌或病原菌。纳米脂质体化后也增加了其表面积，使得纳米大豆卵磷脂细菌素与腐败菌或病原菌作用的面积增大，从而增强了其抗菌活性。
利用大豆卵磷脂对细菌素CAMT2进行纳米包埋，并对细菌素CAMT2的包埋量进行调控，得到的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的抗菌活性非但不会受到大豆暖磷脂本身的影响，还具有更佳的稳定性和抗菌活性。
本发明选用反相蒸发法来实现大豆卵磷脂对细菌素CAMT2进行纳米包埋，通过调控细菌素CAMT2的加入量及搅拌的温度和时间，对细菌素CAMT2的包埋率、得到的细菌素纳米脂质体的粒径、分散指数PDI和Zeta电位进行调控，从而实现细菌素CAMT2的较好包埋，从而提高细菌素CAMT2的抗菌活性的稳定性，增强细菌素CAMT2抗菌活性。
优选地，S1中所述有机溶剂为三氯甲烷。
优选地，S1中所述细菌素CAMT2溶液的浓度为25～100mg/mL。
更为优选地，S1中所述细菌素CAMT2溶液的浓度为100mg/mL。
优选地，S1中在加入细菌素CAMT2溶液前，还包括加入抗氧化剂的步骤。
抗氧化剂的加入防止大豆卵磷脂在空气中被氧化，进一步降低细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度，同时使脂质体体系中的纳米颗粒拥有更好的均匀度，从而更有利于纳米脂质体的稳定保存。
优选地，所述抗氧化剂为Fe2+、抗坏血酸Vc或丁基羟基茴香醚BHA中的一种或几种。
更为优选地，所述抗氧化剂为Fe2+。
优选地，所述抗氧化剂与大豆卵磷脂的质量比为0.001～0.01:1。
更为优选地，所述抗氧化剂与大豆卵磷脂的质量比为0.003:1。
优选地，S2中所述搅拌的温度为50℃；所述搅拌的时间为3h。
优选地，S2中所述搅拌的方式为磁力搅拌。
更为优选地，所述磁力搅拌的转速为400～500r/min。
更为优选地，所述磁力搅拌的转速为450r/min。
一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，通过上述制备方法制备得到。
上述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在作为天然防腐剂在抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明提供的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体可作为天然防腐剂，并以直接添加、固定化在包装袋或保鲜膜上、与其他防腐保鲜技术共同应用等方式来抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用反相蒸发法来实现大豆卵磷脂对细菌素CAMT2的纳米包埋，得到的纳米脂质体可保护细菌素CAMT2使其不被降解或其它成分的干扰，提高了抗菌活性的稳定性；另外，纳米脂质体为纳米颗粒，因其粒径小，增加了其扩散性，使其更容易接近被抑制的食源性腐败菌或病原菌。纳米脂质体化后也增加了其表面积，使得纳米大豆卵磷脂细菌素与腐败菌或病原菌作用的面积增大，从而增强了其抗菌活性。
附图说明
图1为细菌素CAMT2对单核细胞增生李斯特氏菌最小抑菌浓度的测定结果；
图2为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的显微形态；
图3为细菌素CAMT2溶液的标准曲线；
图4为单核细胞增生李斯特氏菌悬液浓度为OD600＝0.03时对应的菌落计数结果；
图5为牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的计数结果；
图6为细菌素CAMT2对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果；
图7为细菌素CAMT2对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
利用Nano-ZS90纳米粒度电位分析仪对细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度、多分散性指数和电位进行测定。
(1)细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度、多分散性指数的测定
采用动态光散射法(Dynamic Light Scattering，DLS)测定细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度和多分散指数。以氦氖激光(λ＝632.8nm)作为光源，固定散射角为90°，测定温度为25℃。取1287μL超纯水于四面透光的石英比色皿中，然后加入制备好的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体13μL(即将纳米脂质体样品稀释100倍)，混匀后将比色皿置于纳米粒度电位分析仪的测试槽中，在粒度测定的模式下进行测定。每个样品测定3次，取平均值。
(2)细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体的电位的测定
大豆卵磷脂纳米脂质体的电位是基于激光多普勒微电泳的原理进行测定的。将稀释100倍的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体或大豆卵磷脂纳米脂质体样品从石英比色皿中转移到用于电位测定的特定装置中，然后同样置于纳米粒度电位分析仪的测试槽中，在电位测定的模式下进行测定。每个样品测定3次，取平均值。
实施例1
本实施例利用反相蒸发法和薄膜水化法来制备大豆卵磷脂纳米脂质体，进而筛选出合适的制备方法。
(1)反相蒸发法：称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，并于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL超纯水，振荡后形成油包水的乳状液，再于40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷，直至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶薄层，最后再加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zetapotential进行测定。
(2)薄膜水化法：称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，并于40KHz、30℃条件下超声5min；室温下，通过旋转蒸发除去三氯甲烷至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶；然后加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min进行水化，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。
如表1，为反相蒸发法和薄膜水化法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果比较。
表1反相蒸发法和薄膜水化法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果比较
Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
反相蒸发法 209.6±4.2<sup>a</sup> 0.133±0.008<sup>a</sup> -54.8±1.2<sup>a</sup>
薄膜水化法 279.5±5.2<sup>b</sup> 0.238±0.003<sup>b</sup> -62.3±1.4<sup>b</sup>
注：显著性水平α＝0.05，每列中右上角含相同字母则差异不显著，反之则显著。
采用反相蒸发法和薄膜水化法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的相关理化评价指标结果见表1。其中，粒度(Size，nm)指的是所有大豆卵磷脂纳米脂质体颗粒的平均直径，多分散性指数(PDI)反映的是整个大豆卵磷脂纳米脂质体体系中所有纳米脂质体颗粒粒径的分散程度或均匀度，电位(Zeta potential，mV)表示的是每个纳米脂质体颗粒表面所带电荷的平均值。粒度越小，多分散性指数越低(通常情况下，PDI<0.300即认为符合一般纳米脂质体制备的要求)，电位的绝对值越大(≧40mV)，则纳米脂质体稳定性越强；反之，粒度越大，多分散性指数越高，电位的绝对值越小，则纳米脂质体稳定性越弱，越容易发生凝聚，从而失去纳米脂质体特有的性质(如易扩散性、缓释性等)。由表1可知，反相蒸发法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度(209.6nm)比薄膜水化法(279.5nm)要小70nm左右，且多分散性指数反相蒸发法(0.133)也比薄膜水化法(0.238)更小；另外，电位方面，两种方法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体所带的电荷都处于有利于脂质体稳定保存的范围内。综合来看，反相蒸发法制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的质量要优于薄膜水化法。因此，选择反相蒸发法作为接下来的研究中大豆卵磷脂纳米脂质体的制备方法。
实施例2
本实施例利用Fe2+对反相蒸发法制备大豆卵磷脂纳米脂质体过程进行优化。
(1)添加有Fe2+
称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，向溶液中加入0.05mol/L的硫酸亚铁铵溶液(70μL)，涡旋震荡后于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL超纯水，振荡后形成油包水的乳状液，再于40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷，直至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶薄层，最后再加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。
(2)未添加Fe2+
称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，并于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL超纯水，振荡后形成油包水的乳状液，再于40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷，直至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶薄层，最后再加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。
反相蒸发法中Fe2+对制备大豆卵磷脂纳米脂质体的影响结果见表2。由表可知，大豆卵磷脂纳米脂质体制备过程中添加Fe2+可使其粒度减小10nm左右，多分散性指数略有降低，而电位则基本保持稳定。此结果表明，反相蒸发法制备大豆卵磷脂纳米脂质体的过程中，添加具有抗氧化性的Fe2+可以使纳米脂质体的粒度进一步减小，同时使脂质体体系中的纳米颗粒拥有更好的均匀度，从而更有利于纳米脂质体的稳定保存。
表2含Fe2+与不含Fe2+所制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果评价
Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
不含Fe<sup>2+</sup> 209.6±4.2<sup>a</sup> 0.133±0.008<sup>a</sup> -54.8±1.2<sup>a</sup>
含Fe<sup>2+</sup> 197.8±1.0<sup>b</sup> 0.126±0.008<sup>a</sup> -53.7±0.4<sup>a</sup>
注：显著性水平α＝0.05，每列中右上角含相同字母则差异不显著，反之则显著。
实施例3
本实施例研究搅拌温度对反相蒸发法制备大豆卵磷脂纳米脂质体的影响。具体过程如下：
称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，并于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL超纯水，振荡后形成油包水的乳状液，再于40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；将该体系分别置于30、40、50、60℃的磁力加热搅拌器中，于450r/min的条件下加热搅拌3h；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷，直至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶薄层，最后再加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。
如表3，为不同搅拌温度下制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果评价。由表可知，当搅拌温度在30～50℃范围内时，随着温度的逐步升高，大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度逐渐减小，多分散性指数和电位也逐渐降低；当搅拌温度超过50℃时，大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度又逐渐增大，多分散性指数和电位也随之升高。因此，可以得出搅拌温度对大豆卵磷脂纳米脂质体的制备有较大的影响，且当搅拌温度为50℃时，大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度更小，脂质体颗粒的大小更均匀。
表3不同搅拌温度下制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果评价
温度(℃) Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
30 246.1±2.8<sup>a</sup> 0.275±0.008<sup>a</sup> -67.2±0.7<sup>a</sup>
40 192.7±2.5<sup>b</sup> 0.188±0.011<sup>b</sup> -56.2±0.5<sup>b</sup>
50 171.7±1.6<sup>c</sup> 0.136±0.006<sup>c</sup> -52.3±0.4<sup>c</sup>
60 205.8±2.0<sup>d</sup> 0.237±0.011<sup>d</sup> -58.1±0.6<sup>d</sup>
实施例4
本实施例研究搅拌时间对反相蒸发法制备大豆卵磷脂纳米脂质体的影响，具体过程如下：
称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，并于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μL超纯水，振荡后形成油包水的乳状液，再于40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；将该体系分别置于50℃的磁力加热搅拌器中，于450r/min的条件下加热搅拌1～12h；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷，直至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶薄层，最后再加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到大豆卵磷脂纳米脂质体。每个样品制备3个平行，对大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。
如表4，为不同搅拌时间下制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果评价。由表可知，当搅拌时间低于3h时，随着时间的延长，大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度逐渐减小；当搅拌时间高于3h时，大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度随着时间的延长基本保持稳定不变。从1～12h，纳米脂质体的多分散性指数都基本稳定在0.130～0.150之间，说明纳米脂质体颗粒大小的分布表现出较好的均匀度；而电位都稳定在-50～-60mV之间，表明大豆卵磷脂纳米脂质体稳定性良好。此外，通过对比粒度和电位之间的大小关系，可以得出它们之间存在着一定的联系，即随着纳米脂质体粒度的增加，其所带电荷也逐渐增多。因此，选择3h作为优化后的搅拌时间。
表4不同搅拌时间下制备的大豆卵磷脂纳米脂质体的结果评价
时间(h) Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
1 196.2±1.8<sup>a</sup> 0.147±0.027<sup>a</sup> -57.5±0.8<sup>a</sup>
3 171.7±1.6<sup>bc</sup> 0.136±0.006<sup>a</sup> -52.3±0.4<sup>b</sup>
6 171.8±2.4<sup>bc</sup> 0.137±0.011<sup>a</sup> -52.2±0.9<sup>b</sup>
9 168.7±2.7<sup>b</sup> 0.132±0.007<sup>a</sup> -51.1±0.6<sup>b</sup>
12 178.3±1.7<sup>c</sup> 0.141±0.010<sup>a</sup> -55.6±0.7<sup>a</sup>
实施例5
本实施例对细菌素CAMT2对单核细胞增生李斯特氏菌最小抑菌浓度进行了测定。
如图1，为细菌素CAMT2对单核细胞增生李斯特氏菌最小抑菌浓度的测定结果。由图可知，当CAMT2的浓度为2.5mg/mL时，对单核细胞增生李斯特氏菌仍有一定的抑制效果，当CAMT2被继续稀释为1.25mg/mL时，抑制效果基本消失。因此，可以得出CAMT2对单核细胞增生李斯特氏菌的最小抑菌浓度约为2.5mg/mL。
实施例6
采用优化后的反相蒸发法制备细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，具体方法如下：称取大豆卵磷脂70mg于20mL棕色瓶中，加入5mL三氯甲烷进行溶解，随后向溶液中加入0.05M的硫酸亚铁铵溶液，涡旋震荡后于40KHz、30℃条件下超声5min；然后加入500μLCAMT2溶液(100mg/mL)，振荡后形成油包水的乳状液，在40KHz、30℃条件下超声10min，形成均匀的乳白色的反相微乳液分散体系；将该体系中置于磁力加热搅拌器中，在50℃、450r/min的条件下加热搅拌3h；室温下，通过旋转蒸发除去分散体系中的三氯甲烷至圆底烧瓶底部形成一层高粘性的有机凝胶；最后加入5mL超纯水并于40KHz、30℃条件下超声15min，过0.45μm滤膜后得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体。样品制备3个平行，并对细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的Size、PDI和Zeta potential进行测定。同时将制备好的样品保存于4℃冰箱中，每隔一段时间取样对其Size、PDI和Zeta potential进行测定，研究其在此条件下的稳定性。
如图2，为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的显微形态结果，A和B分别为大豆卵磷脂纳米脂质体(未包埋细菌素CAMT2)在放大倍数80000×和150000×下的显微形态；C和D分别为细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在放大倍数80000×和150000×下的显微形态。由图可以看出，包含与未包含细菌素CAMT2的大豆卵磷脂纳米脂质体都呈现出相似的球形形态；从纳米脂质体之间的分布状态来看也都比较均匀，未出现聚集的现象，表明它们具有良好的稳定性；通过对比大豆卵磷脂纳米脂质体和细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的表观颜色可以看出，细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的颜色比大豆卵磷脂纳米脂质体要深，间接反映出细菌素CAMT2被大豆卵磷脂成功包埋。
利用Nano-ZS90纳米粒度电位分析仪对本实施例提供的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体粒度、多分散性指数和电位进行测定，测试结果如表5。
表5细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体粒度Size、多分散性指数PDI和电位Zetapotential
4℃下保存天数(d) Size(nm) PDI Zeta potential(mV)
0 186.0±3.0<sup>a</sup> 0.231±0.010<sup>a</sup> -56.2±0.6<sup>a</sup>
15 187.2±2.0<sup>a</sup> 0.235±0.009<sup>ab</sup> -56.3±0.5<sup>a</sup>
30 191.6±1.8<sup>ab</sup> 0.255±0.006<sup>ab</sup> -57.2±0.5<sup>ab</sup>
60 195.0±1.9<sup>b</sup> 0.261±0.009<sup>b</sup> -58.4±0.7<sup>b</sup>
注：显著性水平α＝0.05，每列中右上角含相同字母则差异不显著，反之则显著。
由表5可知，刚制备好的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的粒度约为186nm，PDI值为0.231，Zeta值为-56.2mV。细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在4℃下可以稳定保存2个月左右，表明其在冷藏条件下具有较好的稳定性。
对细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的包埋率进行测定
1.细菌素CAMT2溶液标准曲线的制备：
配置浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL的细菌素CAMT2溶液，测定其在275nm处的吸光值，绘制细菌素CAMT2溶液的标准曲线。
2.包埋率的测定
采用紫外吸收光谱法测定大豆卵磷脂纳米脂质体对细菌素CAMT2的包埋率。使用Ultracel YM-30超滤膜将刚制备好的细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体分散体系于5000×g、4℃下离心15min，被纳米脂质体包埋的细菌素CAMT2截留在上层，未被纳米脂质体包埋的细菌素CAMT2留在滤液中，收集滤液，测定其在275nm处的吸光值，根据CAMT2溶液的标准曲线计算滤液中CAMT2的含量，并通过以下公式计算出细菌素CAMT2的包埋率。
Figure GDA0003353856060000121
如图3，为细菌素CAMT2溶液的标准曲线，所得标准方程为y＝0.55381x+0.05964(R2＝0.99925)，表明细菌素CAMT2溶液在此浓度范围内具有良好的线性关系。经测定，超滤后的滤液在275nm处的吸收值为2.1363，滤液的体积为4mL，根据标准方程及包埋率的计算公式可以得出大豆卵磷脂纳米脂质体对细菌素CAMT2的包埋率约70％。
应用试验例1
本应用试验例考察细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在纯牛奶中对单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果，通过如下过程实现。
(1)单核细胞增生李斯特氏菌的活化与保存
单核细胞增生李斯特氏菌的活化：用无菌注射器的针头取适量的单核细胞增生李斯特氏菌冻干粉于50mL已灭菌的酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSB-YE)培养基中，在37℃、120r/min的条件下培养至对数生长期(15h左右)，作为活化种子液。
单核细胞增生李斯特氏菌的保存：取活化后的单核细胞增生李斯特氏菌在TSA-YE培养基上进行三区划线培养，于37℃恒温培养箱中培养24h后，作为纯化的第一代，如此纯化2～3代后，挑取平板上的单菌落转接至TSA-YE试管斜面进行划线培养，37℃恒温培养24h后置于4℃冰箱保存备用。
(2)单核细胞增生李斯特氏菌标准菌悬液的配制
取试管斜面保存的单核细胞增生李斯特氏菌于含有0.85％生理盐水的无菌试管中，用移液枪吸打混匀后测定菌悬液在600nm处的吸光值(OD600)，适当调整菌悬液的浓度使OD600约为0.03，将此菌悬液进行十倍稀释后采用倾注法进行菌落计数。经计数，此浓度的菌悬液中单核细胞增生李斯特氏菌的菌量约为3.32×107CFU/mL，然后将该菌悬液稀释100倍后即得到约105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液。
图4为单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液浓度为OD600＝0.03时对应的菌落计数结果。其中A、B、C是三个平行，且它们的稀释倍数为10-4，倾注时菌悬液的用量为100μL，37℃恒温培养24h后，经过计数，A、B、C三个平板上的菌落数分别为308、321、366个，换算后总的菌量分别为3.08×107、3.21×107、3.66×107CFU/mL，对A、B、C取平均值，得到菌悬液浓度为OD600＝0.03时，单核细胞增生李斯特氏菌的菌量为3.32×107CFU/mL。因此，将此浓度的菌悬液再稀释100倍即得到约105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液，用于制备含定量单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型。
(3)含单核细胞增生李斯特氏菌牛奶模型的建立
取100μL配制的105CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌工作菌悬液于10mL牛奶中，混合均匀后采用倾注法对牛奶中的单核细胞增生李斯特氏菌进行计数，得到含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型，作为测定细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体抑制食品中单核细胞增生李斯特氏菌效果的载体。
牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的计数结果见图5。其中A、B、C是三个平行，且它们的稀释倍数为100(未稀释)，倾注时牛奶的用量为100μL，37℃恒温培养24h后，经过计数，A、B、C三个平板上的菌落数分别为139、163、192个，换算后总的菌量分别为1.39×103、1.63×103、1.92×103CFU/mL，对A、B、C取平均值，得到牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的菌量为1.65×103CFU/mL。此结果表明含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的牛奶模型建立成功，可用于细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体接下来在牛奶中的防腐实验。
(4)脱脂牛奶的制备
取买到的新鲜纯牛奶于50mL已灭菌的离心管中，配平后置于离心机中于4℃、5000rpm/min的条件下离心10min，去除上层的脂肪，即得到脱脂牛奶，经灭菌处理后于4℃保存备用。
(5)CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果
取4支已灭菌的50mL离心管，编号1、2、3、4，取含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的全脂牛奶模型，摇匀后取100μL牛奶样品经适当稀释后采用倾注法进行菌落计数，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的起始菌量，最后向4支离心管中分别加入1mL无菌水、大豆卵磷脂纳米脂质体、细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体和细菌素CAMT2溶液，摇匀后置于4℃冰箱中，保存1、2、4、6、8、10d后，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的数量。每个样品重复3次，取平均值。
细菌素CAMT2对全脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果见图6(注：空纳米脂质体指大豆卵磷脂纳米脂质体，CAMT2纳米脂质体指细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体)。由图可知，经无菌水(阴性对照)和大豆卵磷脂纳米脂质体(空白对照)处理的牛奶，其单核细胞增生李斯特氏菌的菌量随着保藏时间的延长而逐渐增加，6d后菌量达到最大值，并基本保持稳定，此结果表明，大豆卵磷脂纳米脂质体在全脂牛奶中对单核细胞增生李斯特氏菌无抗菌活性。经细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体(实验组)和游离的细菌素CAMT2(阳性对照)处理的牛奶，0～4d，单核细胞增生李斯特氏菌的菌量都逐渐降低，但实验组降低的速率比阳性对照组慢，可能是由于细菌素CAMT2发挥抗菌作用前首先需要从纳米脂质体中释放出来；4d后，阳性对照组的菌量又开始升高，表明有效的细菌素CAMT2被消耗殆尽，从而不能继续抑制单核细胞增生李斯特氏菌的生长繁殖，而实验组的菌量则继续缓慢降低，直到8d时数量降为0，且10d时依旧未检出，表明在8d时单核细胞增生李斯特氏菌已全部被杀死。对比阳性对照组和实验组的结果可以得出，阳性对照组中能有效发挥抗菌作用的细菌素CAMT2的总量应该低于实验组。
(6)细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果
取4支已灭菌的50mL离心管，编号1、2、3、4，取含103CFU/mL单核细胞增生李斯特氏菌的脱脂牛奶模型，摇匀后取100μL牛奶样品经适当稀释后采用倾注法进行菌落计数，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的起始菌量，最后向4支离心管中分别加入1mL无菌水、大豆卵磷脂纳米脂质体、细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体和CAMT2溶液，摇匀后置于4℃冰箱中，保存1、2、4、6、8、10d后，分别测定4支离心管中单核细胞增生李斯特氏菌的数量。每个样品重复3次，取平均值。
细菌素CAMT2对脱脂牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌的抑制效果结果见图7。由图可知，经无菌水(阴性对照)和大豆卵磷脂纳米脂质体(空白对照)处理的牛奶，其单核细胞增生李斯特氏菌的菌量随保藏时间的变化情况与在全脂牛奶中的结果相似，即6d前逐渐升高，随后基本保持稳定，此结果表明，大豆卵磷脂纳米脂质体在脱脂牛奶中对单核细胞增生李斯特氏菌也无抗菌活性。经细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体(实验组)和游离的细菌素CAMT2(阳性对照)处理的牛奶，0～2d，单核细胞增生李斯特氏菌的菌量都逐渐降低，但阳性对照组降低的速率比实验组快，且2d时，阳性对照组中的单核细胞增生李斯特氏菌已全部被杀死；实验组的菌量在2～6d继续缓慢降低，到6d时，菌量也降为0，且不再随保藏时间的延长而升高。对比阳性对照组和实验组的结果可以得出，被大豆卵磷脂纳米脂质体包埋的细菌素CAMT2发挥抗菌功效的速率比游离的CAMT2要慢，这表明被包埋的细菌素CAMT2要发挥抗菌作用需要经过一个从纳米脂质体中缓慢释放的过程。
从上述结果可知，在全脂牛奶中，被包埋的细菌素CAMT2在8d时可彻底杀灭单核细胞增生李斯特氏菌，而游离的细菌素CAMT2只在前4d对单核细胞增生李斯特氏菌有一定的抑制作用，4d后菌量又逐渐升高，这可能是因为牛奶中的脂肪与阳性对照组中游离的细菌素CAMT2发生了相互作用，使能发挥抗菌作用的细菌素CAMT2的有效浓度降低，导致杀菌作用不彻底，而经纳米化包埋的细菌素CAMT2则有效地避免了此类作用的影响，表现出更好地抗菌效果；
在脱脂牛奶中，游离和被包埋的细菌素CAMT2可分别在2d和6d时杀灭其中的单核细胞增生李斯特氏菌，游离的细菌素CAMT2相比于被包埋的细菌素CAMT2更快速地达到了杀菌的效果，说明在没有脂肪存在的情况下，游离的细菌素CAMT2能更好地发挥抗菌效果，而被包埋的细菌素CAMT2则需通过缓慢释放来发挥抗菌作用。

Claims (9)

1.一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将大豆卵磷脂溶解于有机溶剂，加入抗氧化剂，超声，然后加入细菌素CAMT2溶液，振荡形成油包水的乳状液后，超声得到反相微乳液分散体系；所述大豆卵磷脂和细菌素CAMT2的质量比1:0.18～0.71；所述抗氧化剂为Fe2+；
S2：在40～60℃下对反相微乳液分散体系搅拌3～12h，然后利用旋转蒸发除去分散体系中的有机溶剂得有机凝胶；
S3：向有机凝胶中加入水，超声，过滤后即得到细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体；
所述细菌素CAMT2由海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06代谢合成得到，所述海洋源解淀粉芽孢杆菌ZJHD3-06于2016年12月15日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2016756。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1中所述有机溶剂为三氯甲烷、环己烷或乙酸乙酯中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1中所述细菌素CAMT2溶液的浓度为25～100mg/mL。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，S1中所述细菌素CAMT2溶液的浓度为100mg/mL。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述抗氧化剂与大豆卵磷脂的质量比为0.001～0.01:1。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中所述搅拌的温度为50℃；所述搅拌的时间为3h。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中所述搅拌的方式为磁力搅拌。
8.一种细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体，其特征在于，通过权利要求1～7任一所述制备方法制备得到。
9.权利要求8所述细菌素CAMT2大豆卵磷脂纳米脂质体在作为天然防腐剂在抑制食品腐败或致病微生物生长繁殖中的应用。
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