CN109655622A - 基于唾液特异糖蛋白糖链结构的早期乳腺癌相关筛查/评估的产品及应用 - Google Patents

基于唾液特异糖蛋白糖链结构的早期乳腺癌相关筛查/评估的产品及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种基于唾液特异糖蛋白糖链结构的早期乳腺癌相关筛查/评估的产品及应用，明确了凝集素BS‑I所识别的α‑Gal,α‑GalNAc,Galα‑1,3Gal,Galα‑1,6Glc糖链结构在HV、BB、BC‑I、BC‑II患者唾液中均存在差异，其中：两种半乳糖基化N‑糖链、两种半乳糖基化O‑糖链仅存在于BB组患者唾液中，一种半乳糖基化N‑糖链、七种半乳糖基化O‑糖链仅存在于BC‑I组患者唾液中，三种半乳糖基化N‑糖链仅存在于BC‑II组患者唾液中。从而本发明基于唾液样本能够无创、准确地实现早期乳腺癌(BB、BC‑I、BC‑II)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估。

Description

基于唾液特异糖蛋白糖链结构的早期乳腺癌相关筛查/评估 的产品及应用
技术领域
本发明涉及一种基于唾液特异糖蛋白的早期乳腺癌标志物的确定及其相关产品、应用。
背景技术
乳腺癌(Breast Cancer，BC)是世界范围内女性发病率最高的一类恶性肿瘤，在中国的发病率呈现明显的上升趋势。目前，、乳腺肿瘤的早期诊断主要依赖于乳腺钼靶X线摄影技术，但此技术需要相应的仪器设备、配套空间、专业操作人员，是一种较为昂贵且复杂的早筛手段，且有大约11％的患者无法被检出，尤其是高乳腺密度的癌症患者。近年来大量研究表明：随着肿瘤的发生发展，患者的肿瘤组织、血清和唾液等体液中发生了糖蛋白糖基化异常改变。
专利文献ZL201610315822.8公开了一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用的方案。其中：
基于唾液检测时，当凝集素PNA、PHA-E+L、UEA-I、PWM、MAL-I、NPA、BS-I、PTL-II、PHA-E所识别的糖链结构的表达都较健康女性志愿者上调或下调，同时需满足已构建的早期乳腺癌患者诊断模型，进而可以确定唾液样本对应的人群患有早期乳腺癌(BB、BC-I或BC-II)。
上述方案在检测样本时所需凝集素较多，且需作组合统计，因此对于早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)的筛查、诊断以及评估仍不够简便、有效。
发明内容
关于早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)的筛查、诊断以及评估等，发明人通过大量实验和分析，确定了以下结论：
凝集素BS-I所识别的α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构在HV、BB、BC-I、BC-II患者唾液中均存在差异。具体如下，2种半乳糖基化N-糖链、2种半乳糖基化O-糖链(m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,m/z 3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1；m/z734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,m/z 896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1))仅存在于BB组患者唾液中，而未见于HV、BC-I、BC-II组的唾液中；1种半乳糖基化N-糖链、7种半乳糖基化O-糖链(m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1；m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,m/z882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,m/z 884.270(NeuAc)2)(GalNAc)1,m/z915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,m/z 942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,m/z1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,m/z1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1)仅存在于BC-I组患者唾液中，而未见于HV、BB、BC-II组的唾液中；3种半乳糖基化N-糖链(m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,m/z2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,m/z2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2)仅存在于BC-II组患者唾液中，而未见于HV、BB、BC-I组的唾液中。
根据以上结论，可得出以下应用方案：
凝集素BS-I单独作为唾液特异糖蛋白糖链结构识别的试剂，通过识别具体糖链结构可实现早期乳腺癌(良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II))筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估。
特定糖链的识别单元在构建用于基于唾液样本作早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品方面的用途，所述识别单元识别以下半乳糖基化N-糖链、O-糖链之任一或任意组合(通过判断“有”、“无”即可得出结论)：
A、仅存在于BB组患者唾液中，而未见于HV、BC-I、BC-II组唾液中的两种半乳糖基化N-糖链、两种半乳糖基化O-糖链之任一或任意组合：
m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,
m/z 3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,
m/z 896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1)
B、仅存在于BC-I组患者唾液中，而未见于HV、BB、BC-II组唾液中的一种半乳糖基化N-糖链、七种半乳糖基化O-糖链之任一或任意组合：
m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,
m/z 882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,
m/z 884.270(NeuAc)2)(GalNAc)1,
m/z 915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,
m/z942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,
m/z 1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,
m/z 1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1
C、仅存在于BC-II组患者唾液中，而未见于HV、BB、BC-I组的唾液中的三种半乳糖基化N-糖链之任一或任意组合：
m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2
一种用于早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品，针对唾液样本，该产品包括：
A、凝集素BS-I；
B、用于耦联凝集素BS-I的亲和层析固相载体；
C、用于从含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的糖蛋白中分离出N-糖链、O-糖链的试剂和装置；
D、用于解析各种N-糖链、O-糖链的m/z信息或化学组成式的装置；
E、用于判别所解析的各种N-糖链、O-糖链中是否含有前述半乳糖基化N-糖链、O-糖链之任一或任意组合的标识、模块或处理器。
上述用于耦联凝集素BS-I的亲和层析固相载体可以选择Fe3O4磁性微粒、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、玻璃微球等。
上述用于解析各种N-糖链、O-糖链的化学组成式的装置有多种可选类型，其工作原理可以是基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、核磁共振NMR等，通过获取N-糖链、O-糖链的m/z信息得出化学组成式。
附图说明
图1为四组混合唾液样本总蛋白及经过凝集素BS-I磁性分离的含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的唾液糖蛋白的SDS-PAGE银染显色。各条带样本信息为：1：Protein Ladder，2：牛血清白蛋白(BSA)，3：凝集素BS-I，4—7：健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液总蛋白，8—11：经BS-I磁性分离的含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液糖蛋白。
具体实施方式
以下详细介绍本申请的相关验证实验及分析，发明人具体的研发过程不限于此。
利用凝集素BS-I对健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液特定糖蛋白的分离及糖链鉴定。
研究方法：
利用193例严格符合各阶段典型特征的早期乳腺癌患者唾液样本(BB，n＝65；BC-I，n＝66；BC-I，n＝62)及66例健康女性志愿者唾液样本，通过等蛋白质质量分别混合各组所有唾液样本后，利用四氧化三铁(Fe3O4)纳米磁珠表面偶联上凝集素BS-I制成凝集素磁性微粒复合物(BS-I-Magnetic Particle Compounds,LMPCs)来富集各组唾液混合样本中的特定糖蛋白，并通过SDS-PAGE蛋白变性电泳以及氧化银银染显色(Silver Staining)实验验证各组混合唾液样本经Fe3O4磁性微粒偶联BS-I分离前后各组样本中特异性蛋白丰度差异。随后利用PNGase F酶切法、NaClO氧化法分离特定糖蛋白上的N-糖链和O-糖链，并由基质辅助激光电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Timeof Flight-Mass Spectrum，MALDI-TOF-MS)对糖链进行质谱鉴定，并对糖链结构进行推测，获得凝集素BS-I识别的健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液特定糖蛋白糖链谱并对比分析差异，具体如下。
1.1唾液样本的收集、混合及定量
本实验所采用的健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)的唾液样本均严格经过西北大学、西安交通大学第二附属医院的伦理审批(Human Research Ethics Committees(HRECs))。所有捐赠唾液样本的志愿者连同协助采样指导的临床医师均对本研究工作知情、同意且高度配合，在均一的采样要求之下完成唾液样本的采集。其具体要求为：样本捐献者需无糖尿病，除乳腺外其他的器官应无炎症以及肿瘤等慢性疾病，在采样时捐献者需确定在采集唾液前3小时内未进食并且24小时内未服用药物，然后用洁净无菌的生理盐水(0.9％NaCl)漱口三次，确保捐献者口腔卫生和无食物残渣的前提下，捐献者舌尖抵住上颚并于舌下收集自然分泌的唾液样本收集至2mL离心管，于冰浴暂存。在临床医师指导下共收集唾液样本259例：健康女性志愿者(HV＝66)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB＝65)、I期乳腺癌患者(BC-I＝66)、II期乳腺癌患者(BC-II＝62)。具体的样本统计信息如表1所示。
唾液采集12小时内，将唾液按1mL分装至离心管中，若有量少不足1mL者可加入1×PBS补足至1mL，10,000g×15min离心，小心吸取上清液，经微量核酸蛋白测定仪(Nano-drop)测定浓度后按1mg唾液蛋白:10μL蛋白酶抑制剂的量加入蛋白酶抑制剂，随后按质量取每例唾液样本100μg进行混合。获得健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)四组唾液混合样本，利用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术，中国上海)测定混合样本浓度。
表1唾液样本信息统计
1.2凝集素-磁性微粒复合体的制备及对应糖蛋白的磁性分离
本实验利用一种实验室制备的环氧化Fe3O4磁性微粒，偶联上凝集素BS-I制成凝集素磁性微粒复合体(BS-I-Magnetic Particle Compounds,LMPCs)，然后通过LMPCs与样本的混合、磁性分离、清洗及洗脱，获得该凝集素BS-I所亲和结合的特异糖蛋白。首先取环氧化Fe3O4磁性微粒3mg(该材料通过一种免疫共沉淀方法获得并经环氧化修饰)，加入1mL的偶联缓冲液重复颠倒直至充分混匀后，置于磁性分离器上待磁性微粒完全吸附至磁铁上时弃去上清液实现清洗，该清洗步骤×3次。随后利用600μL偶联缓冲液溶解300μg的BS-I凝集素加入该磁性微粒体系中重悬混匀，置于水平震荡摇床上180rpm、25℃反应6h完成凝集素BS-I与磁性微粒的偶联。待偶联完成后于磁性分离器上磁分离同时弃去上清液，加入1mL磁粒封闭液通过重悬、震荡、磁分离弃上清步骤清洗此时的LMPCs，重复3次清洗之后加入600μL磁粒封闭液于摇床上反应1h封闭其多余的环氧基团。完成封闭后，利用结合缓冲液清洗LMPCs共3次，与此同时，利用600μL体积的结合缓冲溶液溶解唾液样本2mg(如果唾液原始浓度过小，利用10KDa超滤离心管(Millipore Corp,U.S.A)在装盛对应质量样本后于14,000×g离心超滤获得浓缩后的样本，然后利用结合缓冲溶液定容至600μL)后加入LMPCs体系中重悬，180rpm震荡、25℃反应3h。在洗脱前，利用清洗缓冲液，重复如前所述的清洗步骤至少5次。利用Nano-Drop实时测定清洗液中蛋白质浓度，待检测到清洗液中蛋白质浓度为0时即说明非特异性结合的蛋白质已分离彻底。加入400μL洗脱缓冲液，于摇床上180rpm震荡20min，磁性分离后收集上清液，此时特定的糖蛋白由于凝集素变性而溶于上清液中，然后再加入200μL洗脱缓冲液重复一次洗脱步骤并收集上清液。
1.3聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及氧化银银染显色
将SDA-PAGE凝胶转移至电泳槽内，检查凝胶玻片方向和电极方向以确保电流在通路状态下。在本研究中，经SDS-PAGE分离的蛋白样本在凝胶上需通过氧化银银染显色(Silver Staining)对比经Fe3O4磁性微粒偶联BS-I分离前后特异性糖蛋白丰度表达差异。用于银染的唾液蛋白样本上样量为8μg，按照实验需求取等质量的各组样本并加入4μL 5×Loading Buffer，用超纯水补足体积至20μL，震荡混匀后将样本体系置于沸水中水浴5min，水浴后快速离心并于冰上冷却上样。按照1：Protein Ladder，2：牛血清白蛋白(BSA)，3：凝集素BS-I，4—7：健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液总蛋白，8—11：经Fe3O4磁性微粒偶联BS-I分离的含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的健康女性志愿者(HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)、I期乳腺癌患者(BC-I)、II期乳腺癌患者(BC-II)唾液糖蛋白的顺序依次向各个凝胶孔上样。电泳参数设定为：80V恒压模式下，待Loading Buffer于浓缩胶层内形成一条细长且水平的直线时，调整电源至110V恒压模式至电泳结束。
银染显色：用于银染的SDS-PAGE凝胶应在电泳反应结束后及时从胶板中取出，于固定液(50％乙醇，10％冰醋酸，水)中浸泡2h以上。固定至凝胶体积缩小到一半后于浸泡液(30％乙醇，6.8％五水乙酸钠，0.2％硫代硫酸钠，0.15％戊二醛，水)中反应30min。经浸泡液反应后于超纯水中浸泡溶胀，换水浸泡20min×3次。利用染色液(0.5％硝酸银，0.1％甲醛，水)浸泡凝胶目的是使银离子与胶内蛋白质结合。所有反应过程均于摇床上低速震荡，保持各步反应液与凝胶的均匀接触。染色反应20min后用超纯水漂洗凝胶和反应器皿1min，然后倒入显色液(2.5％碳酸钠，0.1％甲醛，水)。在凝胶中条带显色至适当程度后及时用终止液(1％冰乙酸，水)终止并采集图像，同时全过程中严格使用超纯水，避免各步溶液中引入Cl-、CO3 2-、SO4 2-等离子对显色反应造成影响。
1.4酶法分离糖蛋白N-糖链(N-Glycans)
取经LMPCs分离获得的特定糖蛋白200μg加入10KDa超滤管(Millipore Corp,U.S.A)中，首先加入8M尿素至超滤管内最大载液量刻度处，然后经14,000×g离心10min将无机盐离子、非蛋白类小分子随溶剂经超滤膜过滤至收集套管中；加入400μL 8M尿素混匀后离心并重复此步骤3次以使蛋白质样本充分变性；加入稀释好的1×DTT工作液400μL并充分吹吸混匀，56℃下反应45min后14,000×g离心10min；向管内加入400μL 1×IAM工作液并于室温下避光反应30min封闭二硫键；加入400μL的40mmol/L NH4HCO3离心换液以除去残余的各步反应液并重复此步骤3次；加入20μL用盐酸预活化的Trypsin蛋白酶，37℃过夜酶切；反应结束后沸水浴1min以灭活Trypsin蛋白酶，然后为超滤膜换上新的收集套管，向超滤膜内加入2μL PNGase-F糖苷酶，反应10h后14,000×g离心10min，加入400μL 40mmol/LNH4HCO3重复一次离心，两次离心后N-糖链已滤至新的收集套管中，将N-糖链溶液于离心浓缩仪上-20℃真空离心冻干。
1.5 NaClO氧化法分离O-糖链(O-Glycans)
取经LMPCs分离所获得的糖蛋白200μg加入10KDa超滤管中，14,000×g离心10min去除原溶剂相，加入400μL超纯水混匀后离心，重复该清洗至少7次，NaClO在后续的反应中对pH有严格要求，因此实验过程中特别注意超纯水的质量以及清洗的彻底程度；最后一次清洗后依次加入200μL超纯水、100μL 6％NaClO，置于水平震荡摇床上室温下反应30min；反应结束后冰浴预冷，加入15μL的10％甲酸(提前于冰上预冷配制)终止次氯酸钠的氧化反应，为避免反应过于剧烈，反应体系一直保持在冰浴中10min；离心后加入400μL超纯水重复清洗至少7次以充分去除上步反应剩余的甲酸；完成最后一次清洗后，经离心此时滤膜内应剩余约30μL体积的溶液，向滤膜内加入170μL超纯水并用甲酸调pH至7.6左右，然后加入6.64μL 6％NaClO，换上新的收集套管并用封口膜将体系密封起来于室温下反应24h。反应结束后加入8μL预冷的10％甲酸终止反应，离心后再加入200μL超纯水混匀并离心，两次离心后O-糖链已充分滤至新的收集管中，将O-糖链溶液于离心浓缩仪上-20℃真空离心冻干。
1.6糖链的凝胶除盐
Sepharose CL-4B的清洗和非极性平衡：取1.5mL的无酶离心管，加入100μL的Sepharose CL-4B凝胶，加入800μL的甲醇水洗脱液，重悬混匀后9,000×g离心5min，从离心机中取出后于离心管孔板中竖直静置30s，待凝胶平面水平后用移液器小心吸弃上清液，用甲醇水洗脱液重复上述步骤5次；加入正丁醇清洗液重复离心、弃上清步骤2次后获得待上样的凝胶。
糖链上样除盐：取500μL正丁醇清洗液重新溶解冻干后的N/O-糖基化糖链样本，然后上样至预先平衡好的Sepharose CL-4B凝胶中，于水平震荡摇床上80rpm震荡反应1h，根据固液两相的极性差异，极性的糖链会疏于液相而结合至凝胶粒内；待糖链与凝胶结合后，9,000×g离心5min并用移液器吸弃上清液，然后再加入500μL正丁醇清洗液混匀后离心弃上清，重复此清洗步骤5次以除去样本中的非极性多肽和盐离子；清洗完成后加入500μL甲醇水洗脱液，于摇床上180rpm震荡反应20min，此时因甲醇溶液的极性而使糖链重新溶于洗脱液中，反应结束后9,000×g离心并用新的无酶管收集上清液，再用500μL甲醇水洗脱液重复洗脱1次。将纯化后的N/O-糖链溶液于离心浓缩仪上-20℃真空离心冻干。
1.7 N-/O-糖链的MALDI-TOF-MS质谱解析
利用5μL的1:1甲醇：水溶液(v:v)重新溶解冻干后的糖链结晶，吹吸混匀保证管底微量糖链样本的充分溶解后，取2μL上样至Bruker MTP Anchorchip 384点的靶板样品孔上，待样品自然风干结晶，观察不锈钢靶板上样本结晶的形状，糖链样本在适宜浓度下结成的晶型应该是在圆形液滴的范围内呈星状向外放射开来。随后在原样本结晶的范围内再加上2μL DHB基质，等待自然风干重新结晶，将上样有糖链结晶的MTP Anchorchip 384点靶板装载于MALDI-TOF/TOF-MS(Bruker Daltonic,Germany)，在TOF-MS模式下通过一级质谱解析原始样本，其参数选定为：在“RP_700-4000_Da.Par”的多糖测定谱段下，根据标准品校准该范围内的解析精度，根据记录的靶点位置依次解析N-糖基化糖链(1000-3750Da)和O-糖基化糖链(500-1800Da)。
1.8质谱数据分析
利用分析软件flexAnalysis打开以“.Ref”为后缀的质谱数据，设置谱峰信噪比(S/N)>4为自动筛选条件，读取各峰的数据，若因信躁影响使得个别可见峰未读取出来，可通过软件界面中“+(Find MASS Spectrum)”手动将个别较高峰添加至数据列表中。通过上述一系列操作，可获得“m/z.”、“S/N”、“Quality Fac.”、“Res.”、“Intens.”及“Area”共6项数值化数据。在信噪比有效的条件下(S/N>4)选取各峰的“m/z.”和“Intens.”列举生成文本文档，导入Glycoworkbench软件并自动分析糖链结构，分析参数设定为：选择Glycome DB数据库，选择离子通道为“[M+Na]+”和“[M+H]+”，电荷最多+1，前体离子容忍度为±1.0Da，碎片离子容忍度为±0.5Da。
研究结果：
2.1氧化银银染显色
三组患者和健康女性志愿者唾液样本分别通过混合消除组内个体差异后，混合样本通过SDS-PAGE电泳并经银染实验评估Fe3O4磁性微粒偶联BS-I分离前后特异性糖蛋白丰度表达差异(如图1)。银染结果表明四组唾液总蛋白的条带基本一致，大于100KDa的大分子蛋白条带在本实验中染色较浅而使得条带不明显，在50～100KDa间的高峰度蛋白条带的数量和着色深度基本一致(如70KDa、50KDa附近的较宽条带)，而在15～35KDa之间呈淡黄色的条带。经Fe3O4磁性微粒偶联BS-I分离的四组特异性唾液糖蛋白的条带主要分布在25～35KDa，50～70Kda，70～100Kda处，与四组唾液原样总蛋白的条带差异较大。初步说明从四组唾液总蛋白中成功分离含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的特异糖蛋白。
2.2经BS-I-LMPCs分离的糖蛋白N-糖链MALDI-TOF-MS解析
利用LMPCs分离HV、BB、BC-I和BC-II患者唾液中BS-I识别的特定糖蛋白，然后利用PNGase F内切酶专一地分离特定糖蛋白上的N-糖链，通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定各糖链质荷比(m/z.)，取质谱鉴定获得的信噪比S/N>4的各个N-糖链峰并搜索糖链数据库GlycomeDB进行分析，推测获得了N-糖链结构信息，并得出各个N-糖链峰对应的质谱数据，包括m/z、N-糖链结构、相对峰强度等。
通过MALDI-TOF-MS共鉴定到了24种N-糖链，其中在HV、BB、BC-I和BC-II各组中分别鉴定到了14、12、8和9种N-糖链。在这些糖链当中，共有3种N-糖链(m/z 1867.614/1889.596(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(Man)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2221.718(NeuAc)1(Sulf-GalNAc)1(Gal)1(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2319.809(NeuAc)1(Gal)3(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2)在四组中均被鉴定到，1种N-糖链(m/z 3191.164(Fuc)2(Gal)6(GlcNAc)5+(Man)3(GlcNAc)2)在BB、BC-I两组患者的唾液中共同被鉴定到，1种N-糖链(m/z2572.927/2594.909(NeuAc)2(Gal)2(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)在BB、BC-I、BC-II三组患者的唾液中共同被鉴定到。值得注意的是，有3种N-糖链(m/z 2110.766(Gal)1(GlcNAc)5+(Man)3(GlcNAc)2,3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)仅存在于BB组的唾液样本中，有1种N-糖链(m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)仅存在于BC-I组的唾液样本中，有4种N-糖链(m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2，m/z 2762.027(Fuc)1(Gal)3(GalNAc)1(GlcNAc)3(GlcNAc)2+(Man)3)仅存在于BC-II组的唾液样本中。
而根据凝集素BS-I识别糖蛋白糖链末端半乳糖的特性，对上述24种糖链进行进一步的分析，发现在HV、BB、BC-I和BC-II各组中分别鉴定到了11、10、7和7种半乳糖基化N-糖链。其中，2种半乳糖基化N-糖链(m/z 2221.718(NeuAc)1(Sulf-GalNAc)1(Gal)1(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2319.809(NeuAc)1(Gal)3(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2)在四组中均被鉴定到，1种半乳糖基化N-糖链(m/z 3191.164(Fuc)2(Gal)6(GlcNAc)5+(Man)3(GlcNAc)2)在BB、BC-I两组患者的唾液中共同被鉴定到，1种半乳糖基化N-糖链(m/z 2572.927/2594.909(NeuAc)2(Gal)2(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)在BB、BC-I、BC-II三组患者的唾液中共同被鉴定到。值得注意的是，有2种半乳糖基化N-糖链(m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)仅存在于BB组的唾液样本中，有1种半乳糖基化N-糖链(m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)仅存在于BC-I组的唾液样本中，有3种半乳糖基化N-糖链(m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2)仅存在于BC-II组的唾液样本中。
所以，可以得出：2种仅在BB组鉴定到的半乳糖基化N-糖链(m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)，1种仅在BC-I组鉴定到的半乳糖基化N-糖链(m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1)，3种仅在BC-II组鉴定到的半乳糖基化N-糖链(m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2)；针对唾液样本进行检测，只需测定其是否含有这6种半乳基化N-糖链之任一或任意组合，即可作出早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的结果。
2.3经LTL-LMPCs分离的糖蛋白O-糖链MALDI-TOF-MS解析
利用NaClO氧化法分离特定糖蛋白上的O-糖链，通过MALDI-TOF-MS质谱鉴定各糖链质荷比(m/z.)，取质谱鉴定获得的信噪比S/N>4的各个0-糖链峰通过搜索糖链数据库Glycome DB进行分析(根据O-糖链酸的修饰特点，在通过质荷比进行糖链信息比对时对应地加上糖链修饰基团A:58Da和B:72Da进行分析比对)，推测获得了O-糖链结构信息，并得出各个O-糖链峰对应的质谱数据，包括m/z.、N-糖链结构、相对峰强度等。
通过MALDI-TOF-MS共鉴定到了33种O-糖链，其中在HV、BB、BC-I和BC-II各组中分别鉴定到了12、22、26和12种O-糖链。在这些糖链当中，共有6种O-糖链(如m/z 536.106/558.088(Sulf-Gal)1(GalNAc)1,544.088(Gal)1(Sulf-GalNAc)1,700.256(GlcNAc)1(GalNAc)2等)在四组中均被鉴定到，6种O-糖链(如m/z 774.272(NeuAc)1(GalNAc)2,889.335(NeuAc)1(Sulf-GlcNAc)1(GalNAc)1,1014.152(Fuc)1(Sulf-Gal)1(Gal)2(GalNAc)1等)在BB、BC-I两组患者的唾液中共同被鉴定到，2种O-糖链(m/z 599.115(GlcNAc)1(Sulf-GalNAc)1,830.217/852.199(Fuc)1(Sulf-Gal)1(Gal)1(GalNAc)1)在BB、BC-I、BC-II三组患者的唾液中共同被鉴定到。值得注意的是，有3种O-糖链(m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1,922.221(Gal)1(Sulf-Gal)1(GlcNAc)1(GalNAc)1)仅存在于BB组的唾液样本中，有8种O-糖链(如m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,884.270(NeuAc)2)(GalNAc)1,903.335/925.293(GlcNAc)1(GalNAc)3等)仅存在于BC-I组的唾液样本中，有1种O-糖链(m/z 519.158(GlcNAc)1(GalNAc)1)仅存在于BC-II组的唾液样本中。
而根据凝集素BS-I识别糖蛋白糖链末端半乳糖的特性，对上述33种糖链进行进一步的分析，发现在HV、BB、BC-I和BC-II各组中分别鉴定到了10、19、24和9种半乳糖基化O-糖链。在这些糖链当中，共有5种半乳糖基化O-糖链(如m/z 536.106/558.088(Sulf-Gal)1(GalNAc)1,563.133/585.115(Sulf-GlcNAc)1(GalNAc)1,700.256(GlcNAc)1(GalNAc)2等)在四组中均被鉴定到，6种半乳糖基化O糖链(如m/z 774.272(NeuAc)1(GalNAc)2,889.335(NeuAc)1(Sulf-GlcNAc)1(GalNAc)1,1014.152(Fuc)1(Sulf-Gal)1(Gal)2(GalNAc)1等)在BB、BC-I两组患者的唾液中共同被鉴定到，2种半乳糖基化O-糖链(m/z 599.115(GlcNAc)1(Sulf-GalNAc)1,830.217/852.199(Fuc)1(Sulf-Gal)1(Gal)1(GalNAc)1)在BB、BC-I、BC-II三组患者的唾液中共同被鉴定到。值得注意的是，有2种半乳糖基化O-糖链(m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1)仅存在于BB组的唾液样本中，有7种半乳糖基化O-糖链(m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,m/z 882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,m/z 884.270(NeuAc)2)(GalNAc)1,m/z 915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,m/z942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,m/z1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,m/z1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1)仅存在于BC-I组的唾液样本中。
所以，可以得出：2种仅在BB组鉴定到的半乳糖基化O-糖链(m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1)，7种仅在BC-I组鉴定到的半乳糖基化O-糖链(m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,m/z 882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,m/z 884.270(NeuAc)2)(GalNAc)1,m/z 915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,m/z942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,m/z1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,m/z 1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1)；针对唾液样本进行检测，只需测定其是否含有这9种半乳基化O-糖链之任一或任意组合，即可作出早期乳腺癌(BB、BC-I)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的结果。

Claims (8)

1.一种凝集素单独作为唾液特异糖蛋白糖链结构识别的试剂以制备相关产品的用途，其特征在于：所述凝集素为BS-I；所述相关产品为试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合，产品用途为通过识别具体糖链结构实现早期乳腺癌筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估。
2.特定糖链的识别单元在构建用于基于唾液样本作早期乳腺癌筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品方面的用途，其特征在于，所述识别单元识别以下半乳糖基化N-糖链和半乳糖基化O-糖链之任一或任意组合：
m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,
m/z 3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,
m/z 896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1),
m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,
m/z 882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,
m/z 884.270(NeuAc)2(GalNAc)1,
m/z 915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,
m/z942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,
m/z 1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,
m/z 1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1,
m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：以下两种半乳糖基化N-糖链和两种半乳糖基化O-糖链之任一或任意组合对应于良性乳腺肿瘤/囊肿患者(BB)；
m/z 3065.073(NeuAc)2(Fuc)2(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2,
m/z 3539.281(NeuAc)1(Gal)6(GlcNAc)6+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 734.265(Fuc)2(Gal)1(GalNAc)1,
m/z 896.318(Fuc)2(Gal)2(GalNAc)1)。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：以下一种半乳糖基化N-糖链和七种半乳糖基化O-糖链之任一或任意组合对应于I期乳腺癌患者(BC-I)；
m/z 2773.977(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)4(GlcNAc)3+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 868.295(Fuc)1(GlcNAc)1(GalNAc)2,
m/z 882.243(Acetyl-NeuAc)1(Gal)1(Clucose)1,
m/z 884.270(NeuAc)2(GalNAc)1,
m/z 915.285(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)1(GalNAc)1,
m/z942.265(Gal)1(Sulf-GalNAc)1(GlcNAc)1(GalNAc)1,
m/z 1030.348(Fuc)1(Gal)1(GlcNAc)2(GalNAc)1,
m/z 1351.418(NeuAc)3(Gal)1(GalNAc)1。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：以下三种半乳糖基化N-糖链之任一或任意组合对应于II期乳腺癌患者(BC-II)；
m/z 2101.755(Fuc)2(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2246.792(NeuAc)1(Fuc)1(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2(Fuc)1,
m/z 2392.850(NeuAc)1(Fuc)3(Gal)2(GlcNAc)2+(Man)3(GlcNAc)2。
6.一种用于早期乳腺癌(BB、BC-I、BC-II)筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估的产品，针对唾液样本，其特征在于，该产品包括：
A、凝集素BS-I；
B、用于耦联凝集素BS-I的亲和层析固相载体；
C、用于从含有α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc糖链结构的糖蛋白中分离出N-糖链、O-糖链的试剂和装置；
D、用于解析各种N-糖链、O-糖链的m/z信息或化学组成式的装置；
E、用于判别所解析的各种N-糖链、O-糖链中是否含有权利要求2中所列糖链之任一或任意组合的标识、模块或处理器。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述用于耦联凝集素BS-I的亲和层析固相载体为Fe3O4磁性微粒、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶或玻璃微球。
8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述用于解析各种N-糖链、O-糖链的化学组成式的装置的工作原理为基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法或核磁共振NMR，通过获取N-糖链、O-糖链的m/z信息得出化学组成式。
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