KR101456096B1

KR101456096B1 - 인간 혈청 당쇄 지도 및 이를 이용하여 혈청 시료를 검증하는 방법

Info

Publication number: KR101456096B1
Application number: KR1020130036748A
Authority: KR
Inventors: 안현주; 김재한; 한찬영
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2014-11-03
Also published as: WO2014163421A1; KR20140120651A

Abstract

본 발명은 인간 혈청 N-당쇄 지도, 인간 혈청 N-당쇄 라이브러리 및 이를 이용하여 혈청 시료를 검증하는 방법에 관한 것이다. 정상인과 환자의 혈청시료 200여 개로부터 당쇄를 분리하여 분석한 결과, 정상인과 환자 모두에게서 100% 발견되는 18개의 기본 당쇄를 찾아내었다. 이 기본 당쇄 18종의 존재는 인간 혈청시료가 채취 및 처리과정에서 문제가 없음을 검증하는데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 인간 혈청 단백질의 N-당쇄는 이론적으로는 가능한 당쇄 종류가 매우 많지만, 실제로 N-당쇄는 도 3에 나타낸 것과 같은 구조만이 존재함을 밝혔으며, 존재하는 구조의 N-당쇄들의 출현 백분율을 밝힘으로써 출현 확률이 낮은 N-당쇄들을 특정 질환의 마커로 사용할 수 있음을 밝혔다.

Description

인간 혈청 당쇄 지도 및 이를 이용하여 혈청 시료를 검증하는 방법 {Human serum glycome map}

본 발명은 인간 혈청 글라이콤 지도 및 이를 이용하여 혈청 시료를 검증하는 방법에 관한 것이다.

글라이코믹스는 글라이칸 구조 및 특성에 관한 광범위한 연구를 포함한다. 글라이칸은 단당류 구조, 가지뻗기 (branching)의 정도 및 연결구조가 다양하기 때문에 구조가 매우 복잡하여 분석이 용이하지 않다. 게놈의 단선적인 DNA 주형과 직접적으로 관련되어 있는 단백질 구조와 달리, 글라이칸 구성은 일련의 글라이코실트랜스퍼레이즈 효소반응에 의해 결정된다.

N-당쇄화 (N-Glycosylation)는 펩타이드 골격의 아스파라긴에 올리고당이 부가되는 것이다. 이것은 그 위치와 구조적 다양성을 결정하는 생물학적 원칙에 의해 지배된다. N-당쇄화의 변화는 종양과 같은 질환에서 정상적인 당쇄화 장치에 오류가 생긴 것이다. 이러한 이유로, N-당쇄를 질병 마커로 사용하려는 시도가 있어왔다.

N-당쇄는 아주 다양하지만, O-당쇄, 글라이코스아미노글라이칸, 및 글라이코리피드와 같은 다른 글라이코콘쥬게이트와 구별되는 특징이 있다. N-당쇄는 아스파라긴 다음 다양한 아미노산이 오고 그 뒤에 세린, 트레오닌 또는 덜 일반적인 시스테인 아미노산이 오는 구조에서만 발견된다. 프롤린을 제외하고, 다양한 아미노산들이 아스파라긴 다음에 올 수 있다. 펩타이드 N-글라이코시데이즈 F (PNGase F)와 같은 효소가 생리학적 조건 하에서 N-연결 당쇄를 자르는데 이용될 수 있다. N-연결 코어는 키토바이오스 코어 (chitobiose core; Man₃GlcNAc₂)에 부착된 세 개의 만노스 당으로 이루어져 있다. N-연결 당쇄는 N-연결 코어에 어떤 단당이 부가되느냐에 따라 종종 세 개의 주요 타입으로 분류된다. 고만노스 당쇄 (High Mannose Glycan) 형은 N-연결코어에 만노스 단당이 여섯 개 더해진 구조이다. 복합형 (Complex type) 당쇄는 N-연결 코어에서 돌리콜 전구체가 분해된 후 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 디옥시헥소스 (퓨코스) 및 사이알릭산 단당들이 효소적으로 결합된다. 하이브리드형 당쇄는 고만노스 구조와 복합형 구조를 모두 포함한다.

발암 및 전이 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질이 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받아 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"가 일어나고 이로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 세포간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암전이를 일으키게 된다(Hakomori and Kannagi, 1983, J. Natl. Cancer Inst., 71:231-251; Feizi, 1985, Nature, 314:53-571). 세포 외부에서 자극이 오면 암유전자 ras, 전사인자 ets-1의 신호전달을 거쳐 당전이효소 GnT-V(Nacetylglucosaminyltransferase)의 발현이 강화된다. 상기 GnT-V는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 공격(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al., 1987, Science, 236:582-5853).

일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 ER(endoplasmic reticulum)에서 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)하여 암을 유발하게 된다.

이와 같이, 최근 유전자와 단백질의 기능에 관한 학문인 지노믹스, 프로테오믹스에 이어 단백질의 표면에 존재하면서 단백질의 기능, 인식 등에 매우 중요한 역할을 수행하는 당에 관한 연구인 글라이코믹스 (Glycomics)가 과학자들의 관심사로 떠오르고 있다. 글라이코믹스 중에서도 특히 각종 종양세포에서 특정 단백질의 당쇄에 의미 있는 변화가 일어난다는 것이 밝혀지면서 많은 연구자들은 당쇄의 변화를 탐지하여 종양을 초기에 진단하는 바이오마커 발굴에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

혈액 등의 생체 시료에서 추출한 당(glycan)들을 질량분석기를 이용하여 프로파일하는 분석법은 글라이코믹스 기반 바이오마커 발굴 연구에서 널리 사용되고 있다. 그러나, 아직까지 시료로부터 당분석 추출과정의 정확도를 확인할 수 있는 품질관리 (quality control) 방법과 얻어진 당들 간의 총괄적인 생물학적 관계를 시각적으로 보여주고 확인할 수 있는 방법은 전무한 상태이다.

한국특허 제475642호는 암의 발생과 전이에 관여하여 N-연결형 당쇄의 변화를 나타내는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하는 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것이다.

미국특허 제7,651,847호(2010.01.26.특허)는 종양에 특이적인 올리고당을 확인하는 방법, 개인의 종양 계통 (strain)을 결정하는 방법 및 특정 종양 마커의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 개인의 종양을 진단 또는 종양 진행단계를 진단하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 혈액 내 질병의 유무와 상관없이 100% 존재하는 당들을 밝혀내고, 이를 이용하여 생체 시료로부터 당을 추출할 때 시료준비과정에서의 문제점을 확인하는 혈청시료 검증방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 혈청 시료에 존재하는 당들의 존재 비율이 다름을 이용하여 질병의 바이오마커 발굴을 위한 인간 혈액 당쇄 지도를 구축하려는 것을 목적으로 한다.

상기 과제 해결을 위하여 본 발명자들은 200여명의 혈액에서 분리 및 정제한 당쇄들 (평균 80여개의 당쇄)을 분석하여 질병의 유무, 개인의 건강 및 환경과 상관없이 일정하게 검출되는 당쇄 (중성 당쇄: 10개, 산성 당쇄: 8개, 총 18개; 표 1)들을 선정하여 당쇄 추출 및 분석과정에서 품질관리를 할 수 있는 지표로 선정하였다.

또한, 본 발명자들은 당 프로파일을 토대로 당 간의 생물학적 관계를 도식화하여 인간 혈액의 당쇄 지도를 완성하였다.

본 발명에서는 정상인과 암환자(폐암환자와 난소암환자) 200여명의 혈액 시료에서 추출한 당들을 질량분석기를 이용하여 프로파일하였다. 한 시료당 질량분석을 5회 실시하여 특정 피크가 5번 이상 검출된 경우에만 "존재 (presence)"로 인정하였다. 그 결과, 혈액 시료에는 개인별로 평균 80여개의 다양한 당들을 함유하고 있으며, 200여명 모두에게서 공통적으로 발견된 당들은 모두 18개였다 (표 1). 표 1에서는 10% 아세토나이트릴 분획에서 얻어지는 당쇄가 10종, 20% 아세토나이트릴 분획에서 얻어지는 당쇄가 4종, 40% 아세토나이트릴 분획에서 얻어지는 당쇄가 8종인 것으로 나타났고, 이중 10% 분획 및 20% 분획에서 공통적인 당쇄가 4개 존재하므로, 총 18종의 당쇄가 질병의 유무, 개인의 건강 및 환경과 상관 없이 일정하게 검출되는 것으로 나타났다.

따라서, 이와 같이 질병 유무와 관계 없이 일정하게 검출되는 18종의 당쇄를 이용하면 혈청 시료를 검증할 수 있다. 어떤 혈청 시료에서 이러한 18종의 당쇄 중 한 가지라도 탐지되지 않는 당쇄가 있다면 그 혈청 시료는 시료 채취 및 처리 과정에서 문제가 있음을 의미한다고 볼 수 있다.

또한, 이와 같이 얻어진 당들의 구조와 관련하여 당 사이의 상관관계를 이용하여 당쇄가 어떤 순서로 형성되는지 생물학적 정보를 제시하는 지도는 지금까지 없었다. 뿐만 아니라, 혈액 시료에서 얻은 당들의 구성에 따라서 그 구조를 정의하고 기준이 되는 참고자료가 없기 때문에 불편을 겪고 있는 것이 현재의 상황이다.

이러한 문제를 극복하기 위하여 본 발명자들은 인간 혈액 시료 내의 당쇄화 과정에서 나오는 당 구조들의 생물학적 지도를 제작하였고, 이를 이용하여 각각의 당 사이에 특정한 상관 관계, 순서와 관련성이 있다는 것을 확인하였다. 탠덤 질량분석(Tandem MS)을 통하여 당의 조성 및 구조를 하나하나 확인함으로써 각각의 분자량이 가지고 있는 구조에 대하여 왜 이러한 구조를 가질 수밖에 없는지를 분석하여 인간 혈청에서의 당 구조 지도를 완성하였다 (도 3, 확대된 부분도는 도 4 내지 도 13).

본 발명은 모든 당분석 플랫폼에 적용될 수 있으며, 특히 바이오시밀러를 포함하는 바이오의약품의 특성분석 또는 암표지자 발굴 등 생명공학이나 의학분야에서 활용할 수 있다.

또한 처리된 데이타를 분석하는 바이오정보학과 관련하여서도 본 발명이 표준이 되는 자료를 제공함으로써 인간 혈청 내의 당과 관련하여 공통적인 기준을 제시하여 많은 시간을 투자하지 않고도 본 발명의 당쇄지도를 통하여 인간 혈청 내에서 나오는 당의 구성과 구조를 바탕으로 분석하는데 있어서 좀 더 명확한 방법 및 참고자료가 될 수 있다.

본 발명은

(a) 인간 혈청 시료를 준비하는 단계;

(b) 준비된 인간 혈청 시료를 효소처리하여 N-당쇄를 분리하는 단계;

(c) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;

(d) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계; 및

(e) 질량분석 결과, 키토바이오스 코어 (Man₃GlcNAc₂)에 결합된 당 구조가 (Hex)₂ 이론적 단일동위원소 질량값 1257.423, (Hex)₃이론적 단일동위원소 질량값 1419.475, (Hex)₄이론적 단일동위원소 질량값 1581.528, (Hex)₅이론적 단일동위원소 질량값 1743.581, (Hex)₆이론적 단일동위원소 질량값 1905.634, (HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1485.534, (Hex)₁(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1647.586, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1809.639, (Hex)₁(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1850.665, (Hex)₂(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2012.719, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1930.680, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2243.758, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2295.813, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2608.890, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2076.738, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2389.816 , (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₁ 이론적 단일동위원소 질량값 2441.871 및 (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2754.948의 18종 구조를 모두 포함하고 있는 경우에만 정상적인 시료로 판단하는 단계;를 포함하는 인간 혈청 시료 검증방법 {단, Man, 만노스 (Mannose); GlcNAc, N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosmine); Hex, 헥소스 (Hexose); HexNAc, N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamine); Fuc, 퓨코스 (Fucose); NeuAc, N-아세틸뉴라민산 (N-acetylneuraminic acid)}을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 혈청 시료로부터 추출한 도 3에 개시된 N-당쇄의 당쇄화 지도를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간 혈청 시료로부터 추출한 도 3 및 표 8~10에 개시된 108개 당쇄로 이루어진 당쇄 라이브러리를 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 정상군과 특정질병 환자군의 인간 혈청 시료를 준비하는 단계;

(c) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;

(d) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계; 및

(e) 질량분석 결과를 비교할 때 정상군과 특정질병 환자군 간에 도 3에 개시된 108개 당쇄 중 하나 이상의 특정 N-당쇄의 출현 빈도에 20% 이상의 차이가 있는 경우, 시료 내에 상기 특정 N-당쇄의 출현 빈도를 측정하여 특정질병의 유무를 결정하는 단계;를 포함하는, 특정 N-당쇄를 특정질병의 마커로 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(c) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;

(d) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계; 및

(e) 질량분석 결과를 비교할 때 정상군과 특정질병 환자군 모두에서 도 3에 개시된 108개 당쇄 중 특정 N-당쇄가 90% 이상의 확률로 발견되며, 정상군과 특정질병 환자군 간에 상기 특정 N-당쇄의 강도에 30% 이상의 차이가 있는 경우, 시료 내에 상기 특정 N-당쇄의 강도를 측정하여 특정질병의 유무를 결정하는 단계;를 포함하는, 특정 N-당쇄를 특정질병의 마커로 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 정상군과 특정질병 진행단계별 환자군의 인간 혈청 시료를 준비하는 단계;

(c) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;

(d) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계; 및

(e) 질량분석 결과를 비교할 때 특정질병 진행단계별 환자군에서 특정질병의 진행단계에 따라 도 3에 개시된 108개 당쇄 중 하나 이상의 특정 N-당쇄의 발현 빈도 또는 발현 강도에 유의한 차이가 있는 경우, 시료 내에 상기 특정 N-당쇄의 강도 또는 출현 빈도를 측정하여 특정질병의 진행단계를 결정하는 단계;를 포함하는, 특정 N-당쇄를 특정질병 진행단계의 마커로 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(Hex)₃(HexNAc)₃이론적 단일동위원소 질량값 1136.4,

(Hex)₃(HexNAc)₄이론적 단일동위원소 질량값 1339.5,

(Hex)₃(HexNAc)₅(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1688.6,

(Hex)₄(HexNAc)₅이론적 단일동위원소 질량값 1704.6,

(Hex)₄(HexNAc)₃(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1611.5,

(Hex)₆(HexNAc)₃(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1935.6 및

(Hex)₄(HexNAc)₅(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2017.7 중 1종 이상의 N-당쇄를 포함하는 인간 난소암 빈도 마커 (frequency marker)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커가 정상군 시료에 비하여 환자군 시료에서 20% 이상 높은 빈도로 발현됨을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

(Hex)₃(HexNAc)₄이론적 단일동위원소 질량값 1339.5,

(Hex)₃(HexNAc)₄(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1485.5,

(Hex)₃(HexNAc)₅이론적 단일동위원소 질량값 1542.6,

(Hex)₄(HexNAc)₅이론적 단일동위원소 질량값 1704.6,

(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1809.6,

(Hex)₄(HexNAc)₃이론적 단일동위원소 질량값 1298.45,

(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2295.8 및

(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2608.9 중 1종 이상의 N-당쇄를 포함하는 인간 난소암 강도 마커 (intensity marker)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기

(Hex)₃(HexNAc)₄이론적 단일동위원소 질량값 1339.5,

(Hex)₃(HexNAc)₄(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1485.5,

(Hex)₃(HexNAc)₅이론적 단일동위원소 질량값 1542.6,

(Hex)₄(HexNAc)₅이론적 단일동위원소 질량값 1704.6,

(Hex)₄(HexNAc)₃이론적 단일동위원소 질량값 1298.45 및

(Hex)₃(HexNAc)₄(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1485.5의 N-당쇄는 정상군 시료와 비교하여 환자군 시료에서 40% 이상 높은 강도로 발현됨을 특징으로 하는 인간 난소암 강도 마커 (intensity marker)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기

(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1809.6,

(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2295.8 및

(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2608.9의 N-당쇄는 정상군 시료와 비교하여 환자군 시료에서 30% 이하의 낮은 강도로 발현됨을 특징으로 하는 인간 난소암 강도 마커 (intensity marker)를 제공한다.

본 발명에 의하면, 인간 혈청을 비롯한 인간 체액 시료의 당쇄를 분석하여 기본 당쇄 18종의 존재 유무를 탐지함으로써 체액 시료가 적절한가를 검증할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 당쇄지도를 통해서 정상군과 환자군 간의 특정 당쇄 출현 빈도에 현저한 차이가 있는 경우, 이 특정 당쇄를 종양을 비롯한 특정 질병의 빈도 마커로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 당쇄지도를 통해서 정상군과 환자군 간의 특정 당쇄의 강도 (intensity)에 현저한 차이가 있는 경우, 이 특정 당쇄를 종양을 비롯한 특정 질병의 강도 마커로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 당쇄지도를 통해서 종양의 진행단계에 따라 특정 당쇄의 발현 빈도 또는 발현 강도에 차이가 있는 경우, 이 특정 당쇄를 특정 종양의 단계를 파악하는 마커로 이용할 수 있다.

도 1은 인간 혈청 시료로부터 당쇄지도를 작성하는 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 인간 혈청 시료로부터 정제한 당쇄에 대한 MALDI-TOF 결과이다.
도 3은 인간 혈청 시료로부터 얻은 당쇄지도이다.
도 4 내지 도 13은 도 3의 일부분을 확대한 당쇄지도이다.
도 14 (A)는 난소암 환자에서 분리한 N-당쇄의 대표적인 MALDI-FTICR 질량 스펙트럼이고, (B)는 GCC 분획에서 당쇄 분포 및 질량스펙트럼 신호이다. 10, 20 및 40%는 양성 및 음성 이온 모드 질량 분광기에서 아세토나이트릴의 해당 분획에서 나온 당쇄를 나타낸다. 구조들은 정확한 질량 및 당생물학에 기초하여 추정한 것이다.
도 15 (A)는 환자(96사람) 및 대조군(48사람) 시료를 계산하고 단일 m/z 매스에 놓아 피크 배열을 보여준다. (B) GCC20% 분획에서 발견한 풍부한 당쇄의 Box-Whiskers 플롯이다.
도 16은 난소암 당쇄 마커의 추정 구조 및 구조간 관계이다.
도 17은 본 발명에 의한 질병단계결정의 잠재력을 나타낸다. 다섯 개의 N-당쇄 추정구조가 삽입되어 있다. S, N 및 L은 각각 다른 질병 단계(S1부터 S4까지)의 난소암 환자군, 정상(대조)군 및 LMP 난소종양 환자를 나타낸다.
도 18은 종양 환자(n=96) 대 건강한 대조군(n=48) 당쇄 마커의 ROC 커브이다. (A)는 빈도 마커, (B)는 강도 마커이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

실시예 1: 인간 혈청 시료

1) 분석하고자 하는 혈청 시료를 충분히 격렬하게 교반하고 충분히 방치하였다.

2) 각각 50 ㎕씩의 혈청 시료를 준비하였다.

3) 준비된 혈청 시료에 50 ㎕의 200mM NH₄HCO₃ (10mM DTT 포함)를 넣었다.

4) 격렬하게 교반하고 충분히 방치하였다.

실시예 2: 효소를 이용한 N-당쇄 분리

플라보박테리움 메닝고셉티쿰 (Flavobacterium meningosepticum) 유래 PNGase F (peptide N-glycosidase F; 500,000 unit/㎖)을 New England BioLabs (Ipswich, MA)에서 구입하였다. 효소를 이용하여 글라이칸을 단백질로부터 분리하기 위해, 상기 실시예 1을 거친 50 ㎕의 혈청을 소화 완충액 (pH 7.5, 100 mM 중탄산 암모늄, 5 mM DTT)에 용해시키고, 끓는 물에 2분간 가열하여 단백질을 변성시켰다. 실온에서 식힌 후 2 ㎕의 PNGase F (1,000 units)를 가하고 혼합액을 36 ℃ 수조에서 16시간 동안 배양하였다.

차가운 상태의 400 ㎕ 에탄올을 가하여 펩타이드와 단백질을 침전시켰다.

얻은 용액은 -45 ℃에서 60 분간 동결한 후 4 ℃에서 분당 14,400 rpm으로 20분간 원심분리한 후 각 시료마다 400 ㎕의 상층액을 취하고, 상층액에 포함된 에탄올을 완전히 건조시켰다.

그 후 각 시료에 1 ㎖의 물을 가하고 격렬히 교반하여 정제를 위한 당쇄 함유 시료를 준비하였다.

실시예 3: 당쇄 정제

PNGase F로 분리된 당쇄 함유 시료를 흑연 처리한 탄소 카트리지 SPE (GCC-SPE; 충진량 150 ㎎, 카트리지 부피 4 ㎖)로 정제하였다. GCC SPE 카트리지는 Alltech (Deerfield, IL)에서 입수하였다. 사용에 앞서 카트리지를 초순수 6 ㎖로 세척하고 0.1% 트리플루오로초산 (TFA) 함유 80% (v/v) 아세토나이트릴 (ACN) 6 ㎖로 세척한 후 다시 초순수 6 ㎖로 세척하였다. 당쇄 함유 시료는 GCC 카트리지에 넣고 카트리지 부피의 수 배의 초순수를 1 ㎖/min의 속도로 흘려주어 염을 제거하였다. 당쇄는 10% (v/v) 아세토나이트릴, 20% (v/v) 아세토나이트릴 및 40% (v/v) 아세토나이트릴과 0.05% (v/v) TFA로 순서대로 용출시켰다. 각 분획을 수집하여 원심식 증발기로 건조시켰다. 분획들은 질량분석에 앞서 초순수에 용해시켰다.

실시예 4: 질량분석

질량 스펙트럼은 7.0 테슬라의 자석이 장착된 HiResMALDI (IonSped Corporation)를 외부 소스로 하는 FT-ICR MS (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometer) 상에 기록되었다. HiResMALDI는 펄스 Nd:YAG 레이저 (355 ㎚)를 갖추었다. DHB (2,5-Dihycrosy-benzoic acid)는 모든 당쇄 분석의 매트릭스 (50% ACN:H₂O 내에 0.05 ㎎/㎕)로 사용되었다. 음성모드 분석을 위해 0.6 ㎕의 올리고당 용액이 MALDI 프로브에 적용된 후 1 ㎕의 적절한 매트릭스 용액을 적용시켰다. 시료는 진공건조 후 MS 분석에 적용하였다. 양성모드 분석을 위해 0.3 ㎕의 0.01 M NaCl을 매트릭스-분석대상 혼합물에 가한 것을 제외하고는 동일한 시료 제조과정을 적용하였다.

GCC-SPE 동안 용출된 세 분획 즉, 10% ACN 분획, 20% ACN 분획 및 40% ACN 분획은 각각 MALDI-FT-ICR로 분석하여 스펙트럼을 기록하였다. 당쇄들은 용매 극성에 따라 용출되었고, 그 결과 중성 당쇄는 10% 및 20% ACN 분획에서 탐지되었고, 산성 당쇄는 20% 및 40% ACN 분획에서 탐지되었다. 질량 스펙트로미터의 전하 극성은 이온 신호를 개선하고 각각 중성 또는 산성 당쇄의 이온 저해를 최소화하기 위해 양성모드와 음성모드 사이에서 변환되었다. 각 시료에 대해 네 개의 스펙트럼이 수집되었다. 즉, 양성 모드에서는 10% 및 20% ACN 분획, 그리고 음성 모드에서는 20% 및 40% ACN 분획을 얻었다.

실시예 5: 스펙트럼 데이타 선처리

신호에서 노이즈를 제거하기 위해 6 S/N 트레쉬홀드를 이용하였다. 스펙트럼은 Omega 8 소프트웨어 (IonSpec)로 모든 스펙트럼에 존재하는 여섯 개의 알려진 글라이칸 매스를 이용하여 내부에서 계산하였다. 각 스펙트럼은 총 이온량 (total ion abundance)으로 표준화하였다.

실시예 6: 난소암 당쇄마커 시험

난소암 환자군(1기: 21명, 2기: 14명, 3기: 52명, 4기: 13명), 건강한 여성 대조군 48명 및 LMP군 (Low malignancy Patient) 50명에 대하여 각 혈청시료를 위 실시예 1과 같이 준비하였다.

효소를 이용하여 실시예 2~4와 같이, 각 시료의 N-당쇄를 분리한 후 이를 정제하고 질량분석을 실시하였다. 실시예 5와 같이, 스펙트럼 데이타를 선처리하였다.

상기 실시예 6의 결과는 아래와 같다.

결과 1: 난소암 환자 혈청의 당쇄 프로파일링

당쇄 분리를 포함하는 실험 단계를 도 1에 나타내었다. 이 방법은 시료 조작을 최소화하고 속도를 높이기 위해 개발되었다. 본 발명자들은 인간 혈청에서 O-당쇄보다 훨씬 더 풍부하기 때문에 N-당쇄를 선택하였다. N-당쇄는 또한 효소에 의해 좀더 쉽게 그리고 선택적으로 분리할 수 있다. 본 발명자들은 단백질 확인, 분리 및 정제가 필요 없이 N-당쇄를 프로파일하였다. 분리된 당쇄들은 먼저 농축한 다음 극성이 다른 용매에 분획되었다 (0.05% TFA를 포함하는 10, 20 및 40% 아세토나이트릴 수용액). 세 개의 분획에서 용출된 당쇄 혼합물들은 MALDI-FTICR MS를 이용하여 질량 분석하였다. 이러한 방법으로 다른 당쇄에 의하여 당쇄 신호가 억제되는 현상을 피할 수 있었다. 정확한 당쇄 구성은 정확한 질량을 바탕으로 추론하였다. 풍부한 당쇄는 CID (collision-induced dissociation) 또는 IRMPD (Infrared multiphoton dissociation)를 이용한 텐덤 질량분석으로 확인하였다.

100 개의 비점액 상피성 난소암 환자 혈청 (1기-21명; 2기-14명; 3기-52명; 4기-13명), 48 개의 건강한 여성 대조군 혈청 및 50 개의 낮은 악성 잠재력(Low malignancy potential; "LMP") 난소암 환자의 혈청을 포함하는 GOG 시료를 당쇄 마커 연구에 이용하였다. 표 2에 종양 단계, 나이, 혈청 시료 조직 등을 정리하였다. 모든 시료는 수술 후 병리 (pathology following surgery)로 확인하였다.

양성 및 음성 이온탐지 모드에서 10, 20 및 40% SPE 분획의 난소암 환자 혈청 유래 N-당쇄의 대표적인 질량 스펙트럼은 도 14A와 같다. N-당쇄들은 트리만노스 코어 (Man₃GlcNAc₂)로부터 잘 분리되어 FTICR MS (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectroscopy)에서 정확한 질량을 얻을 수 있었다. 이 도면은 풍부한 N-당쇄들의 추정 구조만을 보여준다. 덜 풍부한 신호들을 확대한 결과, 좀더 많은 당쇄들을 밝힐 수 있었다. 10% ACN 스펙트럼에서, 당쇄들은 대부분 고만노스 및 복합형이었다. 좀더 높은 질량 구역에 있는 시알산 (NeuAc)을 포함하는 산성 올리고당들은 음성 모드의 40% ACN 분획에서 발견된다. 20% ACN 분획은 중간 질량 구역에서 중성 및 산성 올리고당들을 포함한다. 따라서, 양성 및 음성 스캔은 이 분획상에서 수행되었다. 중성 당쇄들은 산성에서 억제되며, 역도 마찬가지이다. 따라서, 10%에서 40% 분획까지 가면서 당쇄 크기가 증가할 뿐만 아니라 당쇄 산도도 증가한다. 당쇄의 수를 최대화하기 위해 각 시료에 대해 네 번의 질량 스펙트럼을 측정하였다. SPE-GCG 분획에서 당쇄 분리는 도 14의 B에 요약하였다. 이러한 접근으로 시료당 80 개 이상의 당쇄 구조들이 확인되었다.

결과 2: 질량 스펙트럼 품질 관리

모든 질량 스펙트럼은 스펙트럼 내에 존재하는 N-당쇄로 내부에서 보정되었다 (< 5ppm). 실험 캘리브란트 이온의 피크 선택은 바이오마커 발견에 매우 중요한데, 이는 잘못된 선택이 전체 스펙트럼을 잘못 계산하게 할 수 있기 때문이다. 질량 계산을 확실히 하기 위해 그리고 시료 준비를 확인하기 위해, 환자군과 대조군 모두에 존재하는 것으로 알려진 N-당쇄의 일군의 피크를 이용하여 질량 스펙트럼에 대한 품질관리를 수행하였다. 예를 들어 단일 시알화된 두 가지 (biantennary) N-당쇄 (NB1)와 이중시알화된 두 가지 (biantennary) N-당쇄 (NB2)와 같은 복합형 두 가지 (biantennary) 올리고당들은 대조군과 암환자의 혈청 모두에서 발견되었다 (Morelle, W. et al., Glycobiology 2006(16), 281-293). 이러한 피크가 없으면 보정 및/또는 시료 준비가 잘 수행되지 않았음을 나타낸다. 품질관리 및 내부 보정에 이용되는 당쇄는 표 6에 나타내었다. 환자(96 cases)와 대조군(48cases) 시료에 대한 개별 스캔이 보정되었다. 예컨대 m/z 1485.529의 단일 당쇄 (3Hex:4HexNAc:1Fuc) 피크는 피크 배열과 보정의 정확도를 나타내기 위해 겹쳐 관찰하였다 (도 15A). 처음에 본 발명자들은 198개의 GOG 시료 (100 개의 환자 시료, 50 개의 낮은 악성 잠재력 난소암 환자 시료 및 48 개의 정상 대조군 시료)로 연구를 시작하였으나, 194개 (96 환자 시료, 50 낮은 악성 잠재력 난소암 환자 시료 및 48 개의 정상 대조군 시료) 시료만으로 이후의 바이오마커 연구를 수행하였다. 네 개의 시료로부터 얻은 피크는 주 피크가 당질이 아니라 펩타이드인 이유로 품질관리에 의해 배제되었다.

결과 3: 난소암 환자에서 당쇄 변화

본 실시예에서 관찰된 모든 질량 스펙트럼 신호는 총 이온강도에 의해 환자와 대조군 간의 좀더 직접적인 비교를 위해 표준화되었다. 환자와 대조군 간의 질량 스펙트럼의 전체적인 차이는 당쇄의 Box-Whiskers plot에 의해 설명될 수 있다. 일례로서, GCC 20% 분획에서 발견된 풍부한 당쇄의 분포는 도 15 B에 표현되었다. 바이오마커에 대해 말하자면, 두 가지 타입의 마커-즉, 빈도 마커 (frequency marker) 및 강도 마커 (intensity marker)로 각각 결정될 수 있다. 빈도 마커에서는, 먼저 대조군과 환자 시료에서 각 당쇄 피크의 존재가 %로 계산되었다. 표 3의 네 개의 중성 및 세 개의 산성 당쇄들을 포함하는 일곱 개 당쇄들은 빈도 마커로 확인되었다. 이들은 대부분 [Hex]_3-6[HexNAc]_3-5[NeuAc]_0-1로 이루어진 두 가지 (biantennary) 또는 세 가지(triantennary) 복합/하이브리드형 N-당쇄들이다. 흥미롭게도, 잠재적 당쇄 마커들 또한 도 16에 나타낸 바와 같이 구조적으로 서로 관련이 있었다.

환자 및 대조군 모두에서 90% 이상 존재하는 피크들에 대해서는 강도 마커로서의 가능성을 시험하였다. 여덟 개의 중성 (10% 및 20% 분획에 존재) 및 두 개의 산성 당쇄 (40% 분획에 존재)를 포함하는 열 개의 N-당쇄에 대해 강도 마커로서의 가능성을 확인하였다 (표 4). 두 개의 시알화된 당쇄, 단일시알화된 3가지 N-당쇄 (NT-1, m/z 2295.812) 및 이중시알화된 세 가지 (triantennary) N-당쇄 (NT-2, m/z 2608.890)의 질량 스펙트럼 신호 강도는 각각 모든 질병 단계 (1기~4기)를 통해 환자 시료에서 감소하였다. 중성 당쇄 중 단일퓨코실화된 두 가지 (biantennary) N-당쇄 (NBF1, m/z 1809.640)는 복합/하이브리드 형에 해당하는 다른 당쇄들의 피크 강도가 증가하는 반면, 환자군에서 감소하였다. 잠재적 당쇄 마커의 추정 구조는 그들 간의 관계를 설명하기 위해 도 16에 도시되었다. 모든 당쇄 마커들은 그것이 빈도 마커 또는 강도 마커이냐에 관련 없이 서로 밀접하게 관련되어 있다. 일반적으로 그것이 강도 마커이든지 또는 빈도 마커이든지 중성 당쇄의 증가는 환자군에서 일반적으로 관찰되며, 반면, 산성(시알화된) 당쇄의 감소는 환자군에서 관찰된다.

또한, 임상 단계가 초기 단계 (S1)에서 말기단계 (S4)로 올라갈수록 강도 마커의 수는 증가하였다 (도 17). 이들은 [Hex]_3-4[HexNAc]_3-5[Fuc]_0-1로 이루어진 전형적인 복합형 N-당쇄 (NB)이다. 이러한 결과는 난소암 환자에서 당쇄화의 변화가 질병의 진행을 통하여 계속되고 있음을 보여준다. 따라서, 단계 마커로서 당쇄는 질병의 진행을 조사하거나 예후를 예측하는데 이용될 수 있다.

결과 4: 낮은 악성 잠재력의 난소암 환자에서 당쇄 변화

낮은 악성 잠재력의 난소암 환자 혈청 시료 50개에서 프로파일된 당쇄들은 각각 환자군 및 대조군과 비교하였다. 흥미롭게도 낮은 악성 잠재력 종양 유래 당쇄의 빈도 및 강도 패턴은 환자와 대조군의 가운데 단계를 보여준다. 몇 개의 당쇄는 환자군과 LMP 종양군을 구별하는데 이용될 수 있고, 반면, 다른 당쇄는 대조군과 LMP 종양군을 구별하는데 이용될 수 있다. LMP 난소암의 잠재적 당쇄 마커는 4개의 빈도 마커와 5개의 강도 마커인데, 표 5에 나타내었다. 각 시료군 (환자군, 대조군 및 LMP군)의 발생 빈도 (% 존재)는 당쇄 변화를 시험하기 위해 비교하였다.

[Hex]_3-5[HexNAc]_3-5[Fuc]_0-1로 이루어진 네 개의 복합/하이브리드 형 N-당쇄가 빈도 마커로 확인되었다. 이들은 난소암 환자에서는 많이 존재하였다 (82.8% < f(p) < 94.3%). 반면, 대조군은 50% 미만 (27.9% < f(N) < 48.8%)이었다. 흥미롭게도, 낮은 악성 잠재력 종양의 빈도 (51.1% < f(L) < 80.0%)는 환자군과 대조군의 중간이었다. 경계성 종양은 일반적으로 침투성 종양보다 낮은 마커수준을 나타낸다. 다섯 개의 당쇄가 낮은 악성 잠재력 종양의 강도 마커로 결정되었다. 이들은 세 개의 세 가지 복합형 (tri-antennary complex) (NT: m/z 2028.7, NT1: m/z 2295.8, NT1F: m/z 2441.9), 하나의 네 가지 복합형 (tetra-antennary complex) (NTe1: m/z 2660.0), 그리고 하나의 복합형 당쇄 (m/z 1542.6)이다. 이들 중 세 개의 당쇄 (m/z 1542.6, 2028.7 및 2295.8)는 환자군 및 LMP 군으로부터 대조군을 구별할 수 있으나, 반면 NT1F 및 NTe1은 환자군과 대조군에서 LMP 군을 구분할 수 있다. 임상에서 경계성 종양은 종종 CA125의 높은 수치로 인해 난소암으로 종종 오진된다. 또한, 많은 LMP 여성들은 높은 골반내 종양(high pelvic mass)을 가진다. 따라서, CA125와 복합된 방법, 초음파, 도플러 및 생검이 양성종양 진단에 이용되며, 이는 이 치명적인 종양의 진단에 CA125의 이용을 보충할 부가적인 마커가 필요함을 암시한다. LMP 난소암에서 당쇄 변화는 LMP 종양의 성질을 명확히 보여주며, 또한 특정 당쇄가 질병 개시에 대응하는 임상 셋팅에서 확인될 수 있음을 암시한다.

결과 5: 당쇄지도를 이용한 당쇄마커 평가

질병 탐지에서 바이오마커의 시험 수행을 평가하기 위한 전략적 도구는 ROC (receiver operating characteristic) 커브이다. 일반적으로 AUC(area under the curve) 값이 0.50-0.75인 ROC 커브는 타당한 구별 (fair discrimination)을 가진 것으로 사료된다. 우리는 당쇄마커의 빈도 및 강도에 대하여 각각 ROC 커브에서 AUC를 계산하였다. 빈도 마커에 대하여는 각 빈도 마커들은 조합할 수 있었고, 하나의 ROC 커브는 같은 컷오프 값에 의해 만들어졌다. ROC 커브는 각 빈도 마커에 가중치를 부여함으로써 최적화된다 (표 3). 빈도 당쇄 마커에 대한 ROC 커브는 도 18A에 나타내었다. 모든 시료에 대한 ROC 커브에서 AUC는 0.93 (95% Cl: 민감도 0.92, 특이도 0.91)이었다. 빈도 마커와 달리, 각 강도 마커는 컷오프 값이 다르기 때문에 독립적으로 고려하여야 한다. 각 강도 당쇄 마커에 대한 ROC 커브는 도 18 B에 나타내었다. 다른 강도 마커들에 대한 AUC는 표 4에 추가하였다. 강도 마커 중 (HexNAc)_3-(Man)₃(GlcNAc)₂에 대응하는 m/z 1542.556은 가장 높은 AUC 값인 0.94를 나타내었다.

본 발명에서 당쇄에 의해 생성된 AUC는 CA125 분석방법에 의해 결정된 AUC와 직접 비교되지 않았다. CA125 35U/㎖의 컷오프 값이 본 발명에서 사용된 시료에 대해 이미 확립된 값이므로, CA125 값에 있어서 training set은 완전히 편중된 시료이다 (표 7). 따라서, CA125 값은 AUC 값이 높기 때문에 당쇄 분석과 비교하여 ROC 커브를 생성하는데 이용될 수 없다. CA125에 대하여 특이하게 높은 AUC 값를 나타내는 GOG 시료는 다른 연구팀의 연구에서도 보고되었다.

난소암은 각각 구별되는 조질학 병리학 및 임상 행태를 갖는 30종 이상의 악성 서브타입이 있는 다양한 질병의 모음이다. 또한, 확인은 외과적으로 절개된 조직의 병리학적 시험을 통해서만 가능하다. 난소암의 다양성과 낮은 발병률은 바이오마커 연구를 방해한다. 스크린 마커로서 CA125의 유용성은 높은 허위 양성률로 인해 특히 양성 및 악성 조건에 대하여 한계가 있다. 따라서, CA125와 비교하여 진단 성과가 개선된 새로운 시험법 개발이 요구된다. 당쇄연구는 관련된 단백질을 고려하지 않고 생체액으로부터 당쇄를 얻는 과정을 포함한다. 당쇄화는 초기 당쇄에 덧붙이기 위해 서로 경쟁하는 글라이코실트랜스퍼레이즈를 포함한다. 당쇄화는 우선 세포의 두 부분에서 일어나는데, 소포체와 골지체이다. 따라서, 만약 당쇄화 장치가 오작동하면, 그 세포에서 유래하는 거의 모든 당단백질들은 잠재적으로 당쇄화에 오류가 생길 수 있다. 따라서, 당쇄를 모으는 것은 개체 내에서 당쇄화의 변화를 시험하는 방법을 제공한다. 나아가, 질병 단계에 따라 함량이 증가하거나 또는 감소하는 단백질과는 달리, 당쇄 변화는 좀더 뚜렷하다. 특정 당단백질은 세포 타입에 따라 다양한 속도로 생성될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 당쇄화는 일반적인 세포와 비교하여 종양세포에서 매우 다양하게 변화하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 당쇄화의 변화를 모니터링하는 것은 제한된 수의 단백질 항원을 인식하는 단일클론항체를 이용하는 간접적인 방법에 비해 종양을 탐지하는 좀더 특이적이고 민감한 방법이 될 수 있다.

본 발명에서는 인간 혈청에서 난소암 바이오마커의 N-당쇄를 결정하는 질량분석에 기초한 접근방법이 발명되었다. 일곱 개의 빈도 마커 및 열 개의 강도 마커를 포함하는 열일곱 개의 당쇄가 잠재적 바이오마커로 확인되었고, 이들은 대부분 복합/하이브리드형 N-당쇄였다. 어떤 강도 마커들은 임상 단계가 진행되면 증가하여 질병의 단계를 나타내기도 한다. 또한, LMP 종양은 LMP 종양을 어떻게 분류하느냐는 관점의 차이가 존재하기는 하지만, 당쇄 프로파일링에서 환자군과 대조군 사이의 중간적 특징을 나타낸다. 질병 마커 발견에서 글라이코믹스적인 접근은 관련된 단백질 분리 또는 분석에 의존적이지 않다. 대신 인간 혈청에서 N-당쇄를 분리하여 시료로 사용한다. 비록 이들 마커에 대한 확인과 확증이 필요하긴 하지만, 이 결과들은 높은 민감도와 특이도로 난소암을 탐지하기 위한 당쇄 바이오마커의 사용 가능성을 설명해 준다.

Claims

(a) 준비된 인간 혈청 시료를 효소처리하여 N-당쇄를 분리하는 단계;
(b) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;
(c) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계; 및
(d) 질량분석 결과, 키토바이오스 코어 (Man₃GlcNAc₂) 에 결합된 당 구조가 각각 (Hex)₂ 이론적 단일동위원소 질량값 1257, (Hex)₃이론적 단일동위원소 질량값 1419, (Hex)₄이론적 단일동위원소 질량값 1582, (Hex)₅이론적 단일동위원소 질량값 1744, (Hex)₆이론적 단일동위원소 질량값 1906, (HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1486, (Hex)₁(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1648, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1810, (Hex)₁(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1851, (Hex)₂(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2013, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1931, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2244, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2296, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2609, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2077, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₂(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2390, (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₁ 이론적 단일동위원소 질량값 2442 및 (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2755의 18종 구조를 모두 포함하고 있는 경우에만 정상적인 시료로 판단하는 단계;를 포함하는 인간 혈청 시료 검증방법 {단, Man, 만노스 (Mannose); GlcNAc, N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine); Hex, 헥소스 (Hexose); HexNAc, N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamine); Fuc, 퓨코스 (Fucose); NeuAc, N-아세틸뉴라민산 (N-acetylneuraminic acid)}.
청구항 1에 있어서,
(b) 의 분획 단계는 크로마토그래피를 이용하여 수행함을 특징으로 하는, 인간 혈청 시료 검증방법.
청구항 1에 있어서,
(c) 질량분석 단계는 MALDI-FT ICR MS (Matrix asisted laser desorption inization Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry)를 이용하여 수행함을 특징으로 하는, 인간 혈청 시료 검증방법.
키토바이오스 코어 (Man₃GlcNAc₂)에 결합된 당 구조가 (Hex)₂ 이론적 단일동위원소 질량값 1257, (Hex)₃이론적 단일동위원소 질량값 1419, (Hex)₄이론적 단일동위원소 질량값 1582, (Hex)₅이론적 단일동위원소 질량값 1744, (Hex)₆이론적 단일동위원소 질량값 1906, (HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1486, (Hex)₁(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1648, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1810, (Hex)₁(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1851, (Hex)₂(HexNAc)₃(Fuc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2013, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 1931, (Hex)₂(HexNAc)₂(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2244, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2296, (Hex)₃(HexNAc)₃(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2609, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁(NeuAc)₁이론적 단일동위원소 질량값 2077, (Hex)₂(HexNAc)₂(Fuc)₁(NeuAc)₂ 이론적 단일동위원소 질량값 2390, (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₁ 이론적 단일동위원소 질량값 2442 및 (Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₂이론적 단일동위원소 질량값 2755의 18종 구조로 이루어진 인간 혈청 필수 N-당쇄 라이브러리 {단, Man, 만노스 (Mannose); GlcNAc, N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine); Hex, 헥소스 (Hexose); HexNAc, N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamine); Fuc, 퓨코스 (Fucose); NeuAc, N-아세틸뉴라민산 (N-acetylneuraminic acid)}.
키토바이오스 코어 (Hex)₃(HexNAc)₂
,
(Hex)₅(HexNAc)₂
,
(Hex)₆(HexNAc)₂
,
(Hex)₇(HexNAc)₂
,
(Hex)₈(HexNAc)₂
,
(Hex)₉(HexNAc)₂
,
(Hex)₁₀(HexNAc)₂
,
(Hex)₁₁(HexNAc)₂
,
(Hex)₁₂(HexNAc)₂
,
(Hex)₃(HexNAc)₃
_,
Hex)₃(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₃(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₃
_,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₂
,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₁(NeuAc)₂
,
(Hex)₅(HexNAc)₄(NeuAc)₂
,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₁(NeuAc)₁
,
(Hex)₅(HexNAc)₄(NeuAc)₁
,
(Hex)₅(HexNAc)₄(Fuc)₁
,
(Hex)₅(HexNAc)₄
,
(Hex)₄(HexNAc)₄(Fuc)₃
,
(Hex)₄(HexNAc)₄(Fuc)₂
,
(Hex)₃(HexNAc)₄(Fuc)₂
,
(Hex)₄(HexNAc)₄(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₄(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₄(Fuc)₁
_,
(Hex)₃(HexNAc)₄(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₄
_,
(Hex)₃(HexNAc)₄
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₃
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₂
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₂
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₃
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₂
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₃(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅
_,
(Hex)₃(HexNAc)₅
_,
(Hex)₇(HexNAc)₆(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₆(Fuc)₂
_,
(Hex)₆(HexNAc)₆(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆(Fuc)₂
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆
_,
(Hex)₃(HexNAc)₆
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(Fuc)₃
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₂
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(Fuc)₂
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(NeuAc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₃
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃
_,
(Hex)₄(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₃(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₃(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃(NeuAc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₄
_,
(Hex)₆(HexNAc)₄(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₄(Fuc)₂
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃
_,
(Hex)₅(HexNAc)₂(Fuc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₂(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₃(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₃
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₂
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₂
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅(NeuAc)₁
_,
(Hex)₅(HexNAc)₅
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₃
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₂(NeuAc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₂
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₁(NeuAc)₁
_,
(Hex)₃(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(Fuc)₁
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅(NeuAc)₁
_,
(Hex)₃(HexNAc)₅
_,
(Hex)₄(HexNAc)₅
_,
(Hex)₃(HexNAc)₆
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆(Fuc)₂
_,
(Hex)₆(HexNAc)₆(Fuc)₁
_,
(Hex)₆(HexNAc)₆(Fuc)₂
_,
(Hex)₄(HexNAc)₆(NeuAc)₁
및
(Hex)₆(HexNAc)₅
의 108종 구조로 이루어진 인간 혈청 유래 N-당쇄 라이브러리 {단, Hex, 헥소스 (Hexose); HexNAc, N-아세틸헥소사민 (N-acetylhexosamine); Fuc, 퓨코스 (Fucose); NeuAc, N-아세틸뉴라민산 (N-acetylneuraminic acid); 원은 헥소스, 네모는 N-아세틸헥소사민, 삼각형은 퓨코스, 마름모는 N-아세틸뉴라민산을 나타내며, 헥소스 중 녹색 원은 만노스, N-아세틸헥소사민 중 청색 네모는 N-아세틸글루코사민을 나타낸다}.
정상군과 시료군 비교 분석을 위한 혈청 시료 검증방법에 있어서,
(a) 정상군과 특정질병 환자군의 인간 혈청 시료를 각각 효소처리하여 N-당쇄를 분리하는 단계;
(b) 분리된 N-당쇄를 분획하는 단계;
(c) N-당쇄 분획을 질량분석하는 단계;
(d) 분석한 N-당쇄 분획에 상기 청구항 4의 인간 혈청 필수 N-당쇄 라이브러리의 18종 N-당쇄가 모두 존재하는지를 확인하는 단계; 및
(e) 질량분석 결과를 비교할 때 정상군에 상기 청구항 5의 108개 N-당쇄 외의 다른 N-당쇄가 존재하지 않는 경우에만 정상적인 시료로 판단하는 단계;를 포함하는 혈청 시료 검증방법.
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