CN113702482B

CN113702482B - 一种IgG N-糖链特征组合及其应用

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Publication number: CN113702482B
Application number: CN202111006104.XA
Authority: CN
Inventors: 荆志成; 张泽建; 王惠芳; 蒋鑫; 徐希奇; 魏云鹏; 黎婧怡; 孙凯; 周玉平
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113702482A

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种IgG N‑糖链特征组合及其应用，所述IgG N‑糖链特征组合包括H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal‑ratio、agal、H4N4、H5N4、Fucosylation中的至少两种。同时，本发明提供了检测所述IgG N‑糖链特征组合的试剂和/或仪器在诊断受试者是否是慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者、预测慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的预后、判断心血管指标高低中的应用。

Description

一种IgG N-糖链特征组合及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种IgG N-糖链特征组合及其应用。

背景技术

慢性血栓栓塞性肺动脉高压(Chronic thromboembolicpulmonaryhypertension，CTEPH)是急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)或肺动脉原位血栓形成后，血栓因种种原因未溶解而持续存在，通过纤维化而导致肺血管阻塞的后果。CTEPH的发生率虽较低，但预后很差，持续升高的肺血管阻力最终会使患者发展至右心功能衰竭而死亡。研究数据显示，肺动脉压力高低与预后密切相关。

目前，肺动脉血栓内膜剥脱术(Pulmonary Endarterectomy，PEA)是CTEPH的首选治疗方案，效果明显。然而，就目前CTEPH的诊治情况，大部分患者就诊时已处于中晚期，其中有37％的患者因肺远端血管存在血栓、继发性肺小血管病或其它严重疾病不适合手术。

糖基化影响多种蛋白质生物学功能，包括蛋白质折叠，稳定性和活性。糖链的结构多样性使这些变化的功能得以实现，这些糖链源于单糖结构单元的组成，各种化学键合类型和分支。糖基化的最普遍形式是N糖基化和O糖基化，N糖基化过程中寡糖与天冬酰胺的侧链氨基部分(-NH₂)的氮原子连接，而O糖基化过程中，寡糖与丝氨酸或苏氨酸的羟基部分(-OH)的氧原子连接。尽管IgG糖基化在许多生理和病理过程中起着关键作用，但在临床和免疫学研究中，对IgG糖基化的监测往往被忽视。

N-聚糖的分析可通过几种可释放N-聚糖的酶来辅助。其中，最著名的是肽N-糖苷酶F(PNGase F)，这是一种酰胺酶，通过在N-聚糖最内侧的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和天冬酰氨残基之间进行切割而释放出完整的高甘露糖型、复杂型和杂合型的N-聚糖。

基质辅助激光解析电离质谱技术诞生于80年代末期，是一种软电离质谱技术，具有样品不易裂解、分子离子峰强、灵敏度高等特点，该技术为分析强极性、热不稳定和难挥发的生物样品提供了新途径，逐渐成为分析蛋白样品、多肽、核酸的首选方法。

发明内容

本发明公开了IgG N-糖链特征组合在诊断受试者是否是CTEPH患者、预测CTEPH患者的预后、判断受试者心血管指标是否正常中的应用。同时提供了CTEPH诊断和预后评估的产品和方法。

本发明在具体实施例中通过血浆中IgG分离、IgG上的N-糖链游离和质谱检测，比较CTEPH与健康对照血浆中IgG上N-糖表达量差异。发现健康对照与CTEPH患者血浆之间有6种IgG N糖特征(glycan traits)(3种直接检测到N糖特征和3种派生糖链特征)表达量存在显著差异。

上述6种差异糖链特征的联合应用可以有效区分CTEPH和健康对照；同时H4N5、H5N5和岩藻糖基化(Fucosylation)的表达量和多种心血管指标具有线性关系，由于所述心血管指标具有预后的功能，相应地，所述H4N5、H5N5和岩藻糖基化表达量具有预后的潜力。

IgG N-糖链特征组合

一方面本发明提供了一种IgG N-糖链特征组合，所述IgG N-糖链特征包括糖链派生特征和/或直接检测到的糖链；

优选地，所述糖链派生特征包括G0/G2、Gal-ratio、agal、Fucosylation；所述直接检测到的糖链包括H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、H4N4、H5N4；

优选地，IgG N-糖链特征组合包括以下IgG N-糖链特征中的至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种：H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal、H4N4、H5N4、Fucosylation；

优选地，所述IgG N-糖链特征组合是以下任意一种：

(1)H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

(2)G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

(3)G0/G2、Gal-ratio的组合；

(4)G0/G2、agal的组合；

(5)Gal-ratio、agal的组合；

(6)H4N4、H5N4、Fucosylation的组合；

(7)H4N4、Fucosylation的组合。

本发明所述“IgG N-糖链特征组合”中，H＝己糖，N＝N-乙酰葡糖胺，F＝岩藻糖，G0＝不含半乳糖的岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链，G1＝含有1个半乳糖的核心岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链，G2＝含有2个半乳糖的核心岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链。

本发明所述“糖型(比如H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、H4N4、H5N4)”指的是其含量百分比，也称为相对表达量，所述含量百分比的计算公式是该单个糖链的峰面积与检测到的所有糖链的峰面积的比值。

本发明所述“G0/G2”的计算公式为H3N4F1/H5N4F1。

本发明所述“Gal-ratio”表示IgG半乳糖基化分布，其计算公式为G0/(G1+2*G2)；具体地，其计算公式为H3N4F1/(H4N4F1+2*H5N4F1)。

本发明所述“agal”表示去半乳糖基化水平，其计算公式为H3N4F1+H3N5F1，也就是H3N4F1和H3N5F1这两种糖型的含量百分比之和，也就是H3N4F1和H3N5F1这两种糖型的表达量之和占检测到的所有8种糖型表达量之和的百分比(即H3N4F1和H3N5F1的相对含量相加)。

本发明所述“Fucosylation”表示岩藻糖基化水平，其计算公式是H3N4F1+H4N4F1+H3N5F1+H5N4F1+H4N5F1+H5N5F1。

本发明所述“CTEPH”是chronic thromboembolic pulmonary hypertension的缩写，与“慢性血栓栓塞性肺动脉高压”有相同含义，可以互换使用。

诊断/预后的应用

另一方面，本发明提供了检测IgG N-糖链特征的试剂和/或仪器在制备诊断受试者是否是CTEPH患者的产品中的应用。

优选地，所述IgG N-糖链特征是H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的组合。

另一方面，本发明提供了检测IgG N-糖链特征的试剂和/或仪器在制备预测CTEPH患者的预后的产品中的应用。

优选地，所述IgG N-糖链特征包括H4N4、H5N4、Fucosylation。

优选地，所述IgG N-糖链特征包括H4N4、Fucosylation。

另一方面，本发明提供了检测IgG N-糖链特征的试剂和/或仪器在判断心血管指标中的应用。

优选地，所述IgG N-糖链特征包括H4N4、H5N4、Fucosylation。

优选地，所述IgG N-糖链特征包括H4N4、Fucosylation。

优选地，本发明所述“心血管指标”包括血流动力学指标、利钠肽(NP)或其前体、血氧指标。

优选地，所述血流动力学指标包括但不限于rap(右房压)、中心静脉压(CVP)、上肢动脉血压(AP)、右心室压(RVP)、肺动脉压(PAP)、肺毛细血管嵌顿压(PCWP)、心搏出量(SV)、每分心排血量(CO)、心排血指数(CI)、左室心功指数(CWI)、左室射血分数(LVEF)、左室心收缩指数(LHI)、总外周阻力(TPR)、主动脉顺应性(AC)、左室舒张指数(LDI)、左室舒张末压(LVEDP)。

优选地，所述利钠肽(NP)包括但不限于ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。

优选地，所述利钠肽(NP)是BNP。

优选地，所述利钠肽(NP)的前体是N末端B型利钠肽原(NT-proBNP，N末端B型利钠肽前体)。

优选地，所述血氧指标包括但不限于动脉血氧饱和度(sao2)、经皮血氧饱和度(SpO2)、静脉血氧分压(PvO2)。

优选地，所述心血管指标包括rap(右房压)、N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)、动脉血氧饱和度(sao2)。

所述rap(右房压)与H4N4、H5N4的表达量呈线性正相关，与Fucosylation的表达量呈线性负相关。

所述N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)与H4N4的表达量呈正相关，与Fucosylation的表达量呈负相关。

所述动脉血氧饱和度(sao2)与H4N4呈负相关，与Fucosylation呈正相关。

优选地，所述检测IgG N-糖链特征的试剂包括但不限于以下任意一种或多种：IgG的分离试剂、IgG的纯化试剂、糖苷内切酶、PGC固相萃取纯化试剂、质谱检测所需要的试剂、标记试剂。

本发明所述“标记试剂”可以标记释放的N-聚糖，以增强聚糖的分离和检测。常用的标记试剂包括用于LC分离的2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和2-氨基苯甲酸(2-AA)，也称为邻氨基苯甲酸，用于荧光基团的8-氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)-辅助碳水化合物电泳(FACE)和1-氨基py-3,6,8-三磺酸(APTS)进行毛细管电泳(CE)。所述标记试剂还包括商品化的产品，例如InstantPC(ProZyme)和RapiFluor-MS(Waters)的荧光基团，它们可以标记PNGase F消化后立即产生的糖胺，从而加快了工作流程，与2-AA和2-AB比较这些染料具有增强的荧光和MS特性。

具体地，所述检测IgG N-糖链特征的试剂还可以包括但不限于以下任意一种或多种：96孔IgG蛋白纯化板(Protein A Spin Plate)，纯化IgG用缓冲溶液，包括结合缓冲溶液(Binding Buffer)和淋洗缓冲溶液(Elution Buffer)，96孔PVDF膜滤板，IgG N-糖链富集纯化板(96孔，填装有多孔石墨化碳(PGC))，96孔收集板，IgG N-糖链富集纯化用试剂，糖苷内切酶，检测时所用仪器校正蛋白(Bruker Calibration Standard II)、质谱基质(super-2，5-二羟基苯甲酸(sDHB))及均一化试剂(乙醇)。

优选地，所述糖苷内切酶包括EndoS2、PNGase F。

优选地，所述糖苷内切酶还可以用其他化学试剂(包括漂白剂)代替。

优选地，所述糖苷内切酶是PNGase F(N-糖酰胺酶F或肽N-糖苷酶F)。

优选地，所述检测IgG N-糖链特征的仪器包括但不限于质谱仪。

优选地，所述质谱仪通常包括离子源、分析器和收集器；具体地，所述质谱仪通常包括进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器和数据采集与控制系统。

优选地，所述质谱仪是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF-MS)。

方法

另一方面本发明提供了一种诊断受试者是否是CTEPH患者的方法，所述方法包括根据受试者的前述IgG N-糖链特征组合中一个或多个IgG N-糖链特征的数值判断受试者是否患病的步骤。

另一方面本发明提供了一种预测CTEPH患者的预后的方法，所述方法包括根据受试者的H4N4、H5N4、Fucosylation中一个或多个的数值预测受试者的预后的步骤。

优选地，所述方法包括根据受试者的H4N4和/或Fucosylation数值预测受试者的预后的步骤。

优选地，所述受试者是CTEPH患者。

另一方面本发明提供了一种判断心血管指标的方法，所述方法包括根据受试者的H4N4、H5N4、Fucosylation中一个或多个的数值判断心血管指标的步骤。

优选地，所述受试者是CTEPH患者。

优选地，所述方法包括根据受试者的H4N4和/或Fucosylation数值判断心血管指标的步骤。

优选地，前述的方法中还可以包括收集患者样品的步骤和/或测量IgG N-糖链特征的步骤。

优选地，所述测量IgG N-糖链特征的步骤包括以下任意一种或多种：IgG分离纯化、糖苷内切酶处理IgG、PGC固相萃取纯化N-糖链、质谱检测、质谱数据处理。

优选地，所述糖苷内切酶是PNGase F((N-糖酰胺酶F或肽N-糖苷酶F)。

优选地，所述样品包括但不限于血液(全血)、组织液、细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。

优选地，所述样品是血浆，由抽血样品处理而得到。

优选地，所述质谱检测所使用的方法包括：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS)、气相色谱-串联质谱(GC-MS)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)。

优选地，所述质谱检测所使用的方法是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS)。

产品-系统

另一方面本发明提供了一种诊断受试者是否是CTEPH患者的系统，所述系统包括根据受试者的前述IgG N-糖链特征组合中一个或多个IgG N-糖链特征的数值判断受试者是否患病的计算装置。

另一方面本发明提供了一种预测CTEPH患者的预后的系统，所述系统包括根据受试者的H4N4、H5N4、Fucosylation数值预测受试者的预后的计算装置。

优选地，所述系统包括根据受试者的H4N4、Fucosylation数值预测受试者的预后步骤。

优选地，所述受试者是CTEPH患者。

另一方面本发明提供了一种判断心血管指标的系统，所述系统包括根据受试者的H4N4、H5N4、Fucosylation数值判断心血管指标的计算装置。

优选地，所述受试者是CTEPH患者。

优选地，所述系统包括根据受试者的H4N4、Fucosylation数值判断心血管指标的步骤。

优选地，前述的系统中还可以以下任意一种或多种装置：

(1)收集、处理患者样品的收集装置；

(2)质谱检测的检测装置；

(3)处理质谱检测结果的软件运行装置；

(4)传送计算装置的结论的传输装置。

优选地，所述软件包括但不限于FlexAnalysis、MassyTools、GlycoWorkbench、Rstudio。

本发明所述的“方法、系统”的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。

而且，根据本发明方法、系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。

附图说明

图1为在CTEPH与HC间差异表达的IgG N-糖特征的箱线图；A是H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的联合，B是H3N4F1，C是H5N4F1，D是H5N5F1，E是G0/G2，F是Gal-ratio，G是agal。

图2为H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的联合指标区分CTEPH与HC的ROC曲线图。

图3为IgG N-糖链特征与CTEPH预后指标之间线性回归图；A-C图依次是右房压与H4N4、H5N4、Fucosylation的关系，DE图是N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)与H4N4、Fucosylation的关系，FG图是动脉血氧饱和度与H4N4、Fucosylation的关系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实验对象

54例健康对照(Healthy control，HC)，54例CTEPH(慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者)，12个质控标准品血浆技术重复。

表1.样本队列特征

	CTEPH	HC
				n＝54	n＝54
年龄，岁，均值(SD)	52.7(13.6)	51.6(12.5)
			性别，男性，n(％)	28(51.9％)	29(53.7％)
非O血型，n(％)	11(79.6％)	\
			肺动脉收缩压(sPAP)，mm Hg，中位数(IQR)	74.5(64.0-93.8)	\
肺动脉舒张压(dPAP)，mm Hg，中位数(IQR)	30.0(26.0-36.0)	\
			右房压(RAP)，mm Hg，中位数(IQR)	6.0(4.0-8.5)	\
平均肺动脉压(mPAP)，mm Hg，中位数(IQR)	47.0(39.0-56.0)	\
			肺小动脉楔压(PAWP)，mm Hg，中位数(IQR)	9.0(7.8-11.0)	\
心脏指数(CI)，L/(min·m<sup>2</sup>)，中位数(IQR)	2.6(2.2-2.8)	\
			心输出量(CO)，L/(min·m<sup>2</sup>)，中位数(IQR)	4.5(3.7-5.3)	\
肺血管阻力(PVR)，Wood units，中位数(IQR)	8.4(6.5-10.8)	\
			混合静脉血氧饱和度(SVO2)，％	63.0(59.0-69.9)	\
动脉血氧饱和度(SAO2)，％	89.2(86.6-92.6)	\
			WHO分级(WHO function class)(III-IV)，n(％)	31(57.4％)	\
N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)，pg/mL，median(IQR)	1585.0(321.5-3151.0)	\
			D-二聚体(D-dimer)，mg/mL，median(IQR)	0.3(0.2-0.8)	\
血红蛋白(HGB)，g/L	146.5(137.0-159.3)	\
			血小板(PLT)，×10<sup>9</sup>/L	190.5(158.3-237.8)	\
白细胞(WBC)，×10<sup>9</sup>/L	6.1(4.9-7.2)	\

*CTEPH＝慢性血栓栓塞性肺动脉高压，HC＝健康对照。

实验材料

96孔IgG蛋白纯化板(Protein A Spin Plate)，纯化IgG用缓冲溶液，包括结合缓冲溶液(Binding Buffer)和淋洗缓冲溶液(Elution Buffer)，96孔PVDF膜滤板，IgG N-糖链富集纯化板(96孔，填装有多孔石墨化碳(PGC))，96孔收集板，IgG N-糖链富集纯化用试剂(乙腈：水：三氟醋酸(体积比80:19.9:0.1)，水：三氟醋酸(体积比99.9:0.1)，乙腈：水：三氟醋酸(体积比25:74.95:0.05))，糖苷内切酶(PNGase F)，检测时所用仪器校正蛋白(Bruker Calibration Standard II)、质谱基质(super-2，5-二羟基苯甲酸(sDHB))及均一化试剂(乙醇)。

实施例、筛选差异表达IgG N糖并验证其功能

一、实验方法

1、血浆中IgG分离纯化

(1)将96孔IgG蛋白纯化板和IgG结合缓冲溶液(Binding Buffer)、淋洗缓冲溶液(Elution Buffer)于室温平衡1小时。

(2)取下96孔IgG蛋白纯化板底部的盖子，将纯化板放置在收集板上，再取下纯化板顶部的盖子，然后在96孔纯化板每个孔中加入300μL结合缓冲溶液(Binding Buffer)平衡。

(3)将上述组装纯化板和收集板以1,000×g的转速离心1min。重复步骤(2-3)。

(4)为使IgG与纯化板中吸附材料的结合处于最好的pH和离子强度中，每个待测样品血浆取50μL并与50μL结合缓冲溶液(Binding Buffer)以1:1的比例混合稀释，然后将稀释好的混合液加入纯化板的每个孔中。

(5)将含有样品的纯化板放在震荡器上缓慢震荡孵育1小时。

(6)对步骤(5)中的含有样品的纯化板以1,000×g的转速离心1min，收集离心下来的样品溶液。重复上样2次。

(7)将纯化板置于收集板上，在纯化板的每个孔中加入400μL结合缓冲溶液(Binding Buffer)，以1,000×g的转速离心1min。重复此操作3次。

(8)为使收集板重复使用，用70％的乙醇冲洗一次，再用超纯水冲洗三次，干燥，保存待用。

(9)在每个收集板中加入20μL结合缓冲溶液(Binding Buffer)，将纯化板放在收集板上，并在其每个孔中加入200μL淋洗缓冲溶液(Elution Buffer)，缓慢震荡孵育1min，将组装的纯化板和收集板以1,000×g的转速离心1min。重复此步骤2次。用BCA试剂盒检测，以确定IgG在哪个收集板中。收集纯化出的IgG蛋白。

(10)在纯化柱的每个孔中加入400μL淋洗缓冲溶液(Elution Buffer)，洗涤3次，再用400μL 0.02％的叠氮化钠洗涤三次，使纯化柱再生。

(11)在纯化柱的每个孔中加入100μL叠氮化钠或结合缓冲溶液(BindingBuffer)，盖上上面和下面的盖子，放入密封袋，4℃保存。

2、糖苷内切酶(PNGase F)处理IgG，游离下N-糖链

(1)用70％的乙醇洗涤96孔PVDF膜滤板一次，再用超纯水洗涤2次。

(2)将纯化出的IgG样品溶液与PNGase F混合，并设置三个重复放入96孔PVDF膜滤板的每个孔中，37℃反应12小时。

3、PGC固相萃取纯化N-糖链

(1)在96孔PVDF膜滤板中装填好PGC(每孔填装1mg)。

(2)用0.1％的三氟醋酸80％的乙腈水溶液活化上述IgG N-糖链富集纯化板。

(3)用0.1％的三氟醋酸水溶液平衡IgG N-糖链富集纯化板。

(4)在酶解反应的96孔PVDF膜滤板的每个孔中分别加入100μL超纯水，然后将此板与IgG N-糖链富集纯化板组装，以1,000×g的转速离心2min。重复上样三次，使N-糖链与石墨化碳最大限度结合。

(5)用100μL超纯水洗涤杂质和盐，重复洗涤2次。

(6)用0.05％的三氟醋酸25％乙腈水溶液洗脱N-糖链，并收集洗脱溶液待质谱分析检测。

4、质谱检测

将步骤3中IgG N-糖链富集纯化板富集的N-糖链溶液与校准品溶液(BrukerCalibration Standard II)点在质谱靶板上，室温下晾干，再将基质(super-2,5-二羟基苯甲酸)点在每个点上使样品结晶，室温下晾干后用纯乙醇重溶均一化，用MALDI-TOF质谱检测糖链信号，定性定量分析每种IgG N-糖链。

MALDI-TOF质谱配备Smartbeam 3D激光源，在正离子反射模式(reflectionpositive，RP)下采集信号离子，应用FlexControl 4.0软件进行控制，检测时m/z范围设置为：1000-3500。谱图采集设置为：对于靶板上的每个样品点，激光在样品点范围内完全随机采集信号，累积10K laser shots采集一张质谱谱图，激光频率为5000赫兹。

5、质谱数据处理和统计分析

使用FlexAnalysis和MassyTools两种软件对采集到的质谱图进行(预)处理，之后将文件导出到Microsoft Excel进行进一步分析。应用GlycoWorkbench软件的糖链解析和注释功能并辅助人工手动匹配，来鉴定质谱数据中N-糖链结构。N-糖链结构的鉴定主要基于质荷比、二级质谱碎片归属及已经发表的文献。

单个直接检测到的糖链的定量由单个糖链的峰面积/检测到的所有糖链的峰面积和得到。除了直接检测到的糖链结构外，派生糖链特征(derived glycan traits)由直接检测到的N-糖链依据其结构特点和生物相关性通过Rstudio计算所得。

派生糖链特征包括：

不含半乳糖的岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链与含有2个半乳糖的核心岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链的比值(G0/G2)，

IgG半乳糖基化分布(Gal-ratio，G0/(G1+2*G2))，

去半乳糖基化(agal)，

岩藻糖基化水平(Fucosyaltion)，

平分型中性糖的糖链水平(Bisecting type neutral N-glycans)。

派生糖链特征的计算公式：

G0/G2＝H3N4F1/H5N4F1；

Gal-ratio＝H3N4F1/(H4N4F1+2*H5N4F1)；

agal＝H3N4F1+H3N5F1；

Fucosylation＝H3N4F1+H4N4F1+H3N5F1+H5N4F1+H4N5F1+H5N5F1；

Bisecting type neutral N-glycans＝H3N5F1+H4N5F1+H5N5F1。

CTEPH与HC两组样本IgG N-糖链表达量的差异以及N-糖基化特征与临床参数之间的关系，通过统计检验、回归分析进行评价。差异糖链的诊断效能通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)进行评价。

当ROC曲线下面积(area-under-the-curve，AUC)≥0.9时，诊断指标被认为是“高度准确”，当0.8≤AUC<0.9时，诊断指标被认为是“准确”，当0.7≤AUC<0.8时，该诊断指标被认为是“中度准确”。研究队列的质谱数据质量通过样品检测过程中随机分布在靶板上的12个标准品，及计算所得到的12个标品中每一种糖链的平均值、变异系数和标准偏差来评估。

二、差异表达的IgG N糖及其诊断功能验证

在表1所示的CTEPH研究队列中，根据定量分析结果，CTEPH与HC之间比较了13种IgG N-糖链特征(包括8种直接检测到N-糖链结构和5种计算所得的N糖派生特征)。8种直接检测到N-糖链结构包括H3N4F1，H4N4，H4N4F1，H5N4，H3N5F1，H5N4F1，H4N5F1和H5N5F1。5种计算所得的N糖派生特征包括G0/G2，Gal-ratio，agal，Fucosylation和Bisecting typeneutral N-glycans。

在CTEPH与HC之间具有显著统计学差异的IgG N-糖链特征(直接检测到的N-糖链结构+根据直接检测糖链计算的派生糖链特征)、在CTEPH与HC间差异表达的糖链的表达量的median值、p值、AUC、灵敏度和特异度如表2所示。

结果显示，直接检测到的IgG N-糖链中，与健康对照相比，H3N4F1在CTEPH中的表达量显著升高(表2，图1)，而H5N4F1和H5N5F1在CTEPH中的表达量显著降低(表2，图1)。

派生糖链中特征，G0/G2，Gal-ratio和agal在CTEPH中的表达量显著升高(表2，图1)。图2中***表示p值<0.001，**表示p值<0.01，CTEPH表示慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)，HC表示健康对照(healthycontrols，HC)。

根据ROC测试结果，上述差异表达糖链不能单独有效区分CTEPH与HC(AUC<0.7)(表2)，而当6种差异表达糖链联合应用时，能有效区分CTEPH与HC(AUC>0.7，灵敏度69％，特异度83％)(表2，图2)。另外，任意2种或3种差异表达的派生特征联合应用时，也能有效区分CTEPH与HC(AUC>0.7)(表2)。而任意2种或3种差异表达的直接检测到的糖链联合应用时，不能有效区分CTEPH与HC(AUC<0.7)(表2)。

表2.在CTEPH与健康对照样本中表达具有统计学差异的IgG N-糖链和N-糖派生特征及其受试者工作曲线评估结果

上述N-糖链特征中，H＝己糖，N＝N-乙酰葡糖胺，F＝岩藻糖，G0＝不含半乳糖的岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链，G1＝含有1个半乳糖的核心岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链，G2＝含有2个半乳糖的核心岩藻糖基化的二天线复杂型IgG N-糖链。Gal-ratio＝IgG半乳糖基化分布，agal＝去半乳糖基化。

根据以上实验结果可知，这些IgG N-糖特征的联合应用可作为CTEPH诊断的标志物。

三、预后功能的验证

对检测到的N-糖链结构、计算得到的派生糖链特征和其他在临床上与CTEPH患者的预后相关的指标进行回归分析，仅筛选到H4N4、H5N4和Fucosylation与其他预后指标有相关性，其他N-糖链结构、派生糖链特征与预后指标均无相关性。

回归分析结果表明(图3)，rap(右房压)与H4N4、H5N4的表达量呈线性正相关(r＝0.3229,p＝0.0208；r＝0.5106,p＝0.0001)，与Fucosylation(Fucosylation表示岩藻糖基化水平)的表达量呈线性负相关(r＝-0.4051,p＝0.0032)。N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)与H4N4的表达量呈正相关(r＝0.3552,p＝0.0105)，与Fucosylation的表达量呈负相关(r＝-0.3286,p＝0.0186)。动脉血氧饱和度(sao2)与H4N4呈负相关(r＝-0.3398,p＝0.0147)，与Fucosylation呈正相关(r＝0.3167,p＝0.0235)。

而rap(右房压)、N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和动脉血氧饱和度(sao2)在临床上与CTEPH患者的预后相关，因此，IgG N-糖型H4N4、H5N4和Fucosylation可作为CTEPH预后的潜在标志物，与现有指标联合或单独使用。

Claims

1.检测以下任意一种IgG N-糖链特征的试剂和/或仪器在制备诊断受试者是否是CTEPH患者的产品中的应用；

所述IgG N-糖链特征选自以下任意一种组合：

（1）H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

（2）G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

（3）G0/G2、Gal-ratio的组合；

（4）G0/G2、agal的组合；

（5）Gal-ratio、agal的组合。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测IgG N-糖链特征的试剂包括以下任意一种或多种：IgG的分离试剂、IgG的纯化试剂、糖苷内切酶、PGC固相萃取纯化试剂、质谱检测所需要的试剂，所述检测IgG N-糖链特征的仪器包括质谱仪。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖苷内切酶是PNGase F。

4.一种诊断受试者是否是CTEPH患者的系统，所述系统包括根据受试者的以下任意一种IgG N-糖链特征判断受试者是否患CTEPH的计算装置；

所述IgG N-糖链特征选自以下任意一种组合：

（1）H3N4F1、H5N4F1、H5N5F1、G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

（2）G0/G2、Gal-ratio、agal的组合；

（3）G0/G2、Gal-ratio的组合；

（4）G0/G2、agal的组合；

（5）Gal-ratio、agal的组合。

5.如权利要求4所述系统，其特征在于，所述系统中还包括以下任意一种或多种装置：

（1）收集、处理样品的收集装置；

（2）质谱检测的检测装置；

（3）处理质谱检测结果的软件运行装置；

（4）传送计算装置的结论的传输装置。

6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述样品包括血浆、血液、组织液、细胞、组织、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液或支气管肺泡灌洗液。

7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述样品是血浆。